Bước đầu xây dựng quy trình nuôi cấy invitro cây nghệ vàng (curcuma ionga l) phục vụ chiết xuất curcumin

Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học.. Tác dụng chuyển hóa lipid: Curcumin làm giảm lượng lipoprotein ở nồng ñộ thấp và rất thấp nồng ñộ lipoprotein củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

LƯƠNG ðỨC BẰNG

“BƯỚC ðẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI

CẤY INVITRO CÂY NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L)

PHỤC VỤ CHIẾT XUẤT CURCUMIN”

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành : 60.42.80

Người hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN ðỨC BÁCH

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2012

Học viên

Lương ðức Bằng

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phan Hữu Tôn ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi, trong quá trình tôi làm việc tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ, các bạn học viên trong

bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tạo ñiều kiện và giúp ñỡ tôi hoàn thành bản luận văn này

Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2012

Học viên

Lương ðức Bằng

2.1 Vài nét chung về chi Nghệ (Curcuma) [1,2,3,4] 4

2.2 Khái quát về cây Nghệ vàng (Curcuma longa L) [1,2,3,4] 6

2.4 Công dụng và hoạt tính sinh học chính từ cây Nghệ vàng 11

2.4.2 Hoạt tính sinh học của Curcumin và tinh dầu Nghệ 15

2.5.3 Nuôi cấy tế bào thực vật, các hợp chất tự nhiên và ứng dụng trong

2.5.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 25 2.5.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 27

3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus 35 3.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh Callus 36 3.2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu mô nuôi cấy ñến sự hình

3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi 37 3.3.3 ðịnh lượng hàm lượng Curcumin trong Callus 37

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng ñến khả năng tạo callus 39 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus 44 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ñến sự phát sinh callus 46 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh callus 49 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu nuôi cấy tới sự phát sinh callus 51 4.6 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus 53

MS : Murashige and Skoog

CV : Coefficient of variation-hệ số biến ñộng

LSD : Least Significant Difference Test

So sánh theo sai khác nhỏ nhất

ROS : Reactive oxygen species

HSP : Heat shock proteins

GSTP1-1 : Glutathione S-transferse P1-1

TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand

DANH MỤC BẢNG BIỂU

3.1a Công thức ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung

dịch HgCl2 0,1% và dung dịch Johnson 10% ñến sự sống và khả năng

3.1b Công thức ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung

dịch HgCl2 0,1% và dung dịch Johnson 10% ñến sự sống và khả năng

3.2 Công thức ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus 35 3.3 Công thức ảnh hưởng của BAP ñến sự phát sinh callus 36 3.4 Công thức ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh callus 36 4.1a Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl2 và Johnson ñến

4.1b Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl2 và Johnson ñến

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ñến sự phát sinh callus của củ

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh callus 49 4.5 Kết quả ảnh hưởng của kiểu mô ñến sự hình thành callus 51 4.6 Bước ñầu thử nghiệm nuôi cấy mô cây nghệ tạo callus 53 4.7 Hàm lượng Curcumin trong callus và trong Nghệ tự nhiên 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Ảnh hưởng của Curcumin trên các bệnh khác nhau 16

4.1 Sự hình thành callus và callus CT xử lý HgCl2 0,1% trong 10 phút và

4.2 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng hình thành callus

4.3 Ảnh hưởng của BAP ñến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi

cấy (từ trái qua phải, CT1, CT2, CT3, CT4, CT5) 48 4.4 Ảnh hưởng của NAA ñến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi cấy (từ

4.5 Ảnh hưởng của kiểu mô ñến khả năng hình thành callus sau 1 tháng nuôi cấy

(từ trái qua phải mô non, mô bánh tẻ, mô già) 52

DANH MỤC CÁC BIỂU ðỒ

4.1a Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl2 và dung dịch

Johnson ñến sự sống và khả năng tạo callus của của củ Nghệ 43 4.1b Ảnh hưởng sự phối hợp thời gian khử trùng của HgCl2 và dung dịch Johnson

ñến sự sống và khả năng tạo callus của của củ Nghệ 43 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ñến sự phát sinh callus

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ñến sự phát sinh callus

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ñến sự phát sinh callus 50 4.5 Kết quả ảnh hưởng của kiểu mô ñến sự hình thành callus 52

TÓM TẮT

Nghệ vàng (Curcuma longa L) thuộc họ gừng (Zingiberaceae) phân bố rộng

rãi trên khắp các nước nhiệt ựới và cận nhiệt ựới, ựặc biệt ở Việt Nam, Ấn độ, Trung Quốc và vùng đông Nam Á Ở nước ta Nghệ vàng ựược trồng ở khắp mọi nơi tập chung nhiều ở các ựịa phương thuộc huyện Quản Ba, Yên Minh, đồng Văn, Mèo Vạc (Hà Giang), Cao Bằng, Nghệ AnẦ ở Miền Bắc có 2 vùng chuyên canh lớn là Gia Lâm (Hà Nội), Khoái Châu (Hưng Yên) Curcumin chất màu, hoạt chất chắnh ựược tách chiết bằng dung môi hữu cơ từ củ Nghệ vàng và nhiều loài Curcuma khác ựã ựược tìm ra và khẳng ựịnh hoạt tắnh kháng viêm và ức chế khối u thể Carcinogen Curcumin ựược vắ như là thuốc ỘnguồnỢ ựể pha chế các loại thuốc

và thực phẩm chức năng hỗ trợ ựiều trị nhiều loại bệnh khác nhau như: Ung thư, HIV, tiểu ựường, Alzheimer, viêm loét ựường tiêu hóa, viêm gan B, C, kháng nấm, kháng khuẩn, loại bỏ cholesterol, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, chống oxi hóa, tiêu diệt gốc tự do, sử dụng làm mỹ phẩm Theo nghiên cứu của chúng tôi quy trình nuôi cấy in vitro cây Nghệ vàng sử dụng mô bánh tẻ ựể nuôi cấy với công thức khử trùng là HgCl2 0,1% trong 10 phút kết hợp với dung dịch Johnson 10% trong 10 phút sau ựó nuôi cấy trên môi trường: MS ựầy ựủ bổ sung Saccharose 2 % , Agar 0,8 % , 2,4-D 3 mg/l, BAP 0,4 mg/l, NAA 2 mg/l, pH môi trường ~ 5,8 Sau một tháng nuôi cấy tỷ lệ callus cao nhất ựạt 72% Khi phân tắch hàm lượng Curcumin trong callus cấp 1 ựạt 2,7% thấp hơn Curcumin trong củ nghệ tươi 0,5%

1 MỞ đẦU

1.1 đặt vấn ựề

Nghệ vàng (Curcuma longa L) thuộc họ gừng (Zingiberaceae) phân bố

rộng rãi trên khắp các nước nhiệt ựới và cận nhiệt ựới, ựặc biệt ở Việt Nam, Ấn

độ, Trung Quốc và vùng đông Nam Á [4, 44] Củ Nghệ (Tumeric) là phần thân

rễ của loài này ựã ựược sử dụng trong các món ăn dân tộc, các loại bột carry và súp như là một loại phẩm màu thực phẩm và gia vị chắnh Trong y học dân tộc Phương đông, tắnh chất làm giảm ựau, chống viêm và diệt trừ khối u của Nghệ vàng ựã ựược phát hiện và áp dụng trong các bài thuốc dân gian nhằm ựiều trị viêm loét nội tạng, giải ựộc và ung bướu

Với sự phát triển của Hóa học hữu cơ và Công nghệ Sinh học, ựặc biệt là các nghiên cứu về hóa thực vật học và sinh học phân tử trên thế giới Curcumin chất màu, hoạt chất chắnh ựược tách chiết bằng dung môi hữu cơ từ củ Nghệ vàng và nhiều loài Curcuma khác ựã ựược tìm ra và khẳng ựịnh hoạt tắnh kháng viêm và ức chế khối u thể Carcinogen Nó ựược vắ như là thuốc ỘnguồnỢ ựể pha chế các loại thuốc và thực phẩm chức năng hỗ trợ ựiều trị nhiều loại bệnh khác nhau như: Ung thư, HIV, tiểu ựường, Alzheimer, viêm loét ựường tiêu hóa, viêm gan B, C, kháng nấm, loại bỏ cholesterol, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, chống oxi hóa, thu nhặt gốc tự do, sử dụng làm mỹ phẩm [28] Chắnh vì vậy nhu cầu sử dụng loại dược liệu này càng tăng trong nước cũng như trên thế giới

Ở nước ta Nghệ vàng ựược trồng ở khắp mọi nơi tập chung nhiều ở các ựịa phương thuộc huyện Quản Ba, Yên Minh, đồng Văn, Mèo Vạc (Hà Giang), Cao Bằng, Nghệ AnẦ ở Miền Bắc có 2 vùng chuyên canh lớn là Gia Lâm (Hà Nội), Khoái Châu (Hưng Yên) Hiện nay nhu cầu sử dụng Nghệ vàng rất lớn, nguồn cung không ựủ nên giá của chúng tăng nhiều Nghệ vàng chủ yếu ựược trồng ngoài ựồng ruộng thời vụ gieo trồng bắt ựầu vào khoảng tháng 3 và thu hoạch vào tháng 1 dương lịch năm sau khi cây tàn lụi Sau khi thu hoạch người ta chọn củ to khỏe ựể làm giống cho vụ sau

Mặc dù Nghệ vàng bản chất là cây hoang dại nên trồng rất ñơn giản, không

bị sâu hại như các cây trồng khác Tuy nhiên năng xuất và chất lượng Nghệ vàng phụ thuộc nhiều vào ñiều kiện tự nhiên, kỹ thuật canh tác, giống ñem trồng Mặt khác phương thức trồng trọt là trồng bằng củ, chúng có ñặc tính ngủ nghỉ khá dài nên lượng giống và bảo quản giống phức tạp, mất nhiều công sức Hiện nay công nghệ sinh học phát triển ñặc biệt là công nghệ tế bào thực vật như nuôi cấy mô tế bào với những ưu ñiểm sau :

Các tế bào thực vật có thể ñược nuôi cấy trong ñiều kiện nhân tạo không phụ thuộc vào thời tiết và ñịa lý Không cần thiết ñể vận chuyển và bảo quản một lượng lớn nguyên liệu thô

Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự ñồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản

Một số sản phẩm trao ñổi chất ñược sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

Do vậy việc nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Nghệ vàng ñể thu các hoạt chất thứ cấp cũng cần ñược quan tâm nghiên cứu ñể phần nào ñó chủ ñộng ñược nguyên liệu cho ngành chiết xuất dược liệu Hơn nữa kết quả nghiên cứu cho rằng một số nuôi cấy in vitro (nuôi dịch huyền phù) có khả năng tổng hợp các sản phẩm ñặc biệt

có nồng ñộ cao hơn so với cây mà từ ñó chúng bắt nguồn Chẳng hạn: Schulte và cộng sự (1987) ñã thông báo sự tạo thành các Anthraquinone trong các nuôi cấy tế bào (ñược tối ưu các ñiều kiện) ñã vượt trội các cây sinh trưởng ngoài tự nhiên

Hiện nay trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro theo hướng tái sinh cây như tác giả: S.Prathanturarug, N.soonthornchareonnon, M.A.Islam, K.Kloppstech, Elsa Ventura Zapata, Guadalupe Salcedo Morales, V.A.Parthansarathy and B.Sasikumar, Sanghamitra Nayak* and Pradeep Kumar Naik [12,24,37,39] Nhưng chưa có công trình nào ñi sâu nghiên cứu khảo sát hàm lượng Curcumin trong sản phẩm callus tạo thành và ảnh hưởng của các yếu tố nuôi cấy in vitro ñến hàm lượng và chất lượng Curcumin Gần ñây ở nước ta các tác giả Nguyễn Hoàng Lộc, Võ Châu Tuấn ñã nuôi cấy thành công tế bào dịch huyền phù

cây Nghệ ñen và xác ñịnh hàm lượng Curcumin trong nuôi cấy in vitro theo phương pháp này cao gấp 2,7 lần so với cây ngoài tự nhiên [28]

Thực tế trong sản xuất Curcumin thương phẩm người ta chỉ tách chiết từ củ Nghệ vàng vì hàm lượng Curcumin trong củ Nghệ vàng cao gấp rất nhiều lần cây

Nghệ ñen Do vậy việc: “Bước ñầu xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro cây

Nghệ vàng (Curcuma longa L) phục vụ chiết xuất Curcumin” là một hướng

nghiên cứu có nhiều khả thi, nếu thành công có thể sẽ góp phần xây dựng một nhà máy sản xuất Curcumin từ cây Nghệ vàng tại Việt Nam

1.2 Mục ñích, yêu cầu của ñề tài

- Xác ñịnh ñược phương pháp khử trùng mẫu cấy

- Xác ñịnh ñược loại mô nuôi cấy

- Xác ñịnh ñược môi trường nuôi cấy tốt nhất

- Xác ñịnh ñược hàm lượng Curcumin trong callus

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vài nét chung về chi Nghệ (Curcuma) [1,2,3,4]

Họ Gừng (Zingibereaceae) là một họ thảo mộc sống lâu năm với thân rễ bộ

ngang bao gồm có 47 chi với 1000 loài Họ này phân bố ở vùng nhiệt ựới với cận nhiệt ựới, Nam và đông Nam Châu Á Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 20 chi bao gồm 100 loài Nhiều loài ựược dùng làm phẩm nhuộm, gia vị cây cảnh và vị thuốc

quan trọng Các chi thường gặp là Stahlianthus, Kaaemferia, Curcuma, Hedychium,

Zingiber, Alpinia, Amomum, Costus

Chi Nghệ (Curcuma) rất phong phú về loài Cho ựến nay trên thế giới có 48 loài Curcuma ựược phát hiện Các loài này mọc tập chung ở vùng đông Nam Á, Ấn

độ, Trung Quốc, đài Loan Pakistan và một số nước nhiệt ựới khác Ở Việt Nam có

16 loài trong ựó có 6 loài mà dân gian hay sử dụng làm thuốc đó là: Nghệ Vàng (

C.longa Linn), Nghệ ựen ( C.zedoaria ( Berg) Roscoe)), Nghệ trắng(C.aromatica Salisb), Nghệ Pierre (C.pierena Gagn), Nghệ rễ vàng (C.xanhthorrhiza Roxh), Nghệ ten ựồng(C.aeruginosa Roxb)

Dưới ựây là một số chi Curcuma thường thấy ở Việt Nam:

2.1.1 Curcuma longa Linn ( C.domestica Val)

Tên Việt Nam: Nghệ trồn, Nghệ vàng

Nguồn gốc của loài này là ở Ấn độ ựược trồng ựể làm gia vị ở Việt Nam, Nghệ vàng không những mọc hoang mà còn ựược trồng theo vùng chuyên canh như

ở Phú Thụy (Hà Nội), Khoái Châu (Hưng Yên) Thân rễ nghệ vàng trong đông y gọi là Khương Hoàng Nghệ vàng có vị ựắng cay, có mùi thơm hắc, tắnh ấm; có tác dụng hành khắ phá ứ, thông kinh chỉ thống Nghệ vàng dùng ựể chữa các bệnh: kinh nguyệt không ựều, viêm loét dạ dày, ung nhọt, phong thấp, tay chân ựau nhức, ựặc biệt Nghệ vàng còn dùng ựể ựiều trị ung thư, HIV, tiểu ựường, Alzheimer, viêm gan

B, C, kháng nấm, chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm

2.1.2 Curcuma zedoaria (Berg) Roscoe

Tên Việt Nam: Nghệ ựen

Nghệ ựen có nguồn gốc Himalaya, Srilanca và ựược trồng ở nhiều vùng như:

Ấn độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Việt Nam Nó mọc hoang dại ựược trồng lấy thân rễ, và rễ củ làm thuốc Thân rễ Nghệ ựen phơi khô gọi là Nga Truật

Ở Việt Nam, Nghệ ựen mọc hoang ở các vùng Việt Bắc, Tây Bắc và ở nhiều nơi thuộc đà Nẵng Thân rễ Nghệ ựen có vị ựắng, cay, mùi thơm hăng, tắnh hơi ấm; có tác dụng phá tắch tán kết, hành khắ chỉ thống, khai vị hóa thực, thông kinh được dùng trong đông Y ựể chữa khó tiêu, ựầy bụng, ung thư da, các vết bầm tắm trên da, kinh nguyệt không ựềuẦ

2.1.3 Curcuma aromatica Salisb

Tên Việt Nam: Nghệ trắng, Ngải trắng, Ngải mọi, Nghệ sùi

Thân rễ Nghệ trắng trong ựông y gọi là Uất kim Nghệ trắng là loài Nghệ Châu Á nhiệt ựới, Chúng phân bố ở hầu hết các rừng nước ta và cũng ựược trồng ựể lấy củ thơm Nghệ trắng có vị cay, ựắng, tắnh bình; có tác dụng hành khắ giải uất, lương huyết phá ứ lợi mật, trừ hoàng ựản được dùng ựể chữa tức ngực, chướng bụng, nôn ra máu, chảy máu cam, tiểu ra máu,Viêm gan mãn, xơ gan ựau nhức, hoàng ựản, kinh nguyệt không ựều, ựau bụng kinh, ựộng kinhẦ

2.1.4 Curcuma xanthorrhiza Roxb

Tên Việt Nam: Nghệ rễ vàng

Loài Nghệ này phân bố ở Châu Âu và nhiều nước Châu Á như Inddoneexxia, Nhật Bản, Triều Tiên Ở Việt Nam, Nghệ rễ vàng mọc hoang ở các vùng như: Lai Châu, Hòa Bình và ựược trồng nhiều ở Cần Thơ Thân rễ vị ựắng, cay, tắnh ấm; có tác dụng lợi mật, thông mật, làm giảm cholesterol, chống co thắt và diệt vi khuẩn Nghệ rễ vàng ựể ựiều trị thiểu năng gan và xung huyết gan, viêm túi mật, viêm ống mật, vàng da, bắ tiểu tiện, sỏi mật, bệnh ựường niệu và viêm mô tế bàoẦ

2.1.5 Curcuma alismatifolia Gagnep

Tên Việt Nam: Nghệ lá từ cô

Cây này phân bố ở vùng Châu đốc, Kon Tum, An Giang Loại Nghệ này có hoa dùng ựể ăn ựược Nghệ lá từ cô có tác dụng ựiều trị một số bệnh về gan, ựầy bụng khó tiêu, các vết bầm tắmẦ

2.1.6 Curcuma angustifolia Roxb

Tên Việt Nam: Nghệ lá hẹp

Cây này phân bố ở Tây Ninh Còn có ở Ấn độ, Nepa, Mianma, Thái Lan Thân rễ ựược sử dụng ở Ấn độ làm thuốc nhầy dịu và bổ dưỡng; nó chứa bột có thể dùng thay bột củ dong

2.1.7 Curcuma aeruginosa Roxb

Tên Việt Nam: Nghệ ten ựồng

Cây mọc hoang và ựược trồng ở Hà Giang, Tuyên Quang, Thành Phố Hồ Chắ Minh Còn ở Ấn độ, Mianma, Campuchia, Thái Lan, Malaixia, Indonexia

Thân rễ có vị ựắng, cay, tắnh ấm; có tác dụng phá huyết hành khắ, tiêu tắch chỉ thống được dùng trị huyết ứ ựau bụng, sưng to gan lách, kinh bế, ăn uống không tiêu Ở Indonexia, người ta dùng thân rễ sắc cho phụ nữ mới sinh ựẻ uống Còn ở Malaixia, củ ựược dùng trị ho, hen suyễn và dùng ngoài trị gàu và vảy da

2.1.8 Curcuma thorrelii Gagnep

Loài này phân bố ở vùng Châu Thới và biên giới Việt Lào

2.1.9 Curcuma pierreane Gagnep

Loài này phân bố ở vùng Chân đèo Cả

2.1.10 Curcuma cochinchinessis Gagnep

Tên Việt Nam: Nghệ gầy

Cây mọc hoang ở vùng Bà Rịa Gần ựây thấy ở Cao Bằng

2.1.11 Curcuma Gracillima Gagnep

Tên Việt Nam: Nghệ mảnh

Cây mọc hoang ở tỉnh miền Trung

2.2 Khái quát về cây Nghệ vàng (Curcuma longa L) [1,2,3,4]

2.2.1 đặc ựiểm thực vật

Nghệ vàng (Curcuma longa L) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Chúng có

ựặc ựiểm sau:

Cây thảo, cao 0.6 Ờ 1 m

Thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng sẫm ựến vàng ựỏ, rất thơm

Lá mọc thẳng thừ thân rễ, gốc thuôn hẹp, ựầu hơi nhọn, dài 30 Ờ 40 cm, rộng 10 Ờ 15 cm, hai mặt nhẵn cùng màu lục nhạt, mép nguyên uốn lượn, bẹ lá rộng và dài Cụm hoa hình trụ hoặc hình trứng ựắnh lên một cán mập dài ựến 20 cm, mọc

từ giữa túm lá; lá bắc rời màu rất nhạt, những lá phắa dưới mang hoa sinh sản, màu lục hoặc trắng nhạt, những lá gần ngọn không mang hoa hẹp hơn và pha màu hồng

ở ựầu lá; ựài có 3 răng không ựều; tràng có phiến cánh giữa dài hơn các cánh bên, màu vàng; nhị có bao phấn có cựa do một phần lồi ra của trung ựới ở dưới các ô; nhị lép dài hơn bao phấn; bầu có lông

Quả nang 3 ô, mở bằng van, hạt có áo

Mùa hoa quả: tháng 3 - 5

2.2.2 Nguồn gốc phân bố, sinh thái

Nghệ có nguồn gốc nguyên thủy có lẽ từ Ấn độ Từ thời xa xưa cây ựã ựược trồng ở nhiều nơi về sau trở nên hoang dại, trước hết là ở Trung Quốc Vào thế kỷ thứ 7 ựến thế kỷ thứ 8, cây ựược du nhập sang đông Phi; ựến thế kỷ 13, sang vùng Tây Phi và thế kỷ 18 người dân Jamaica mới tiếp xúc với cây nghệ Ngày nay, Nghệ

là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt ựới, từ Nam Á ựến đông Nam Á

Ở Việt Nam, Nghệ cũng ựược coi là một cây trồng cổ ở khắp các ựịa phương, từ ựồng bằng ven biển ựến vùng núi cao trên 1500 m Ở một số nơi thuộc huyện Quản Ba, Yên Minh, đồng Văn, Mèo Vạc (Hà Giang), Ầ ở miền Bắc có 2 vùng chuyên canh lớn là Gia Lâm ( Hà Nội), Khoái Châu ( Hưng Yên) Chắnh loài Nghệ này ựã trở nên hoang dại hóa ở các ruộng ngô, nương rẫy

Nghệ là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng; cây có biên ựộ sinh thái rộng, thắch nghi ựược với nhiều tiểu vùng khắ hậu khác nhau Từ nơi có khắ hậu nhiệt ựới ựiển hình, nhiệt ựộ trung bình ựến 25 Ờ 26oC ở các tỉnh phắa nam (không

có mùa ựông lạnh) ựến những nơi có khắ hậu cận nhiệt ựới núi cao phắa bắc, nhiệt

ựộ trung bình dưới 20oC, với mùa ựông lạnh kéo dài Nghệ vẫn tồn tại và sinh trưởng phát triển tốt Toàn bộ phần trên mặt ựất tàn lụi vào mùa ựông ở các tỉnh phắa bắc và mùa khô ở các tỉnh phắa nam Cây mọc lại vào giữa mùa xuân, có hoa sau khi ựã ra lá Hoa mọc trên những thân của chồi năm trước Những thân ựã ra

hoa thì năm sau không mọc lại nữa và phần thân rễ của chúng trở thành những Ộcủ cáiỢ già, sau 1 - 2 năm bị thối, cho những nhánh non nảy chồi thành các cá thể mới Trên một cụm hoa, các hoa phắa gốc nở trước và thời gian hoa nở kéo dài 3 - 4 ngày Hoa tự thụ phấn hoặc nhờ côn trùng Nghệ có trữ lượng khá dồi dào ở Viêt Nam Hiện nay có nhiều vùng trồng chuyên canh Nghệ với diện tắch lớn, phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu như Khoái Châu Ờ Hưng Yên, Gia Lâm Ờ Hà Nội,

đông Triều Ờ Quảng Ninh, Lâm đồng, đồng Nai

2.3 Thành phần hóa học của cây Nghệ vàng

Trong củ Nghệ người ta phân tắch ựược: củ Nghệ chứa nước (8-10%), protein (6,3%), chất béo (5,1%), khoáng chất (3,5%) cacrbohydrate (69,4%), tinh dầu (5%), Curcumin (3-4%) [16]

Tinh dầu Nghệ ở nhiều nước trên thế giới ựược nghiên cứu phổ biến Bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước, ựã lấy ựược thành phần tinh dầu chủ yếu có trong lá và củ Nghệ Thành phần này ựược phân tắch bằng phương pháp GC và GC/MS Trong tinh dầu Nghệ có 52 chất với thành phần chủ yếu chứa: α-turmerone (44,1%), β-turmerone (18,5%), ar-turmerone (5,4%) Tinh dầu lá Nghệ chứa 61 chất với thành phần chắnh là: α-phelladrene (24,5%), 1,8-cineole (10,5%), terpinolene (11,5%) [34]

Tinh dầu từ lá Nghệ của Việt Nam có chứa: α-phellandrene (53,4%), cineole (15,9%), p-cymene (13,2%), β-pinene (8,9%) [27] Ở Nigerian tinh dầu chủ yếu là phellandrene (47,7%), và terpinolene (28,9%) [6] Tinh dầu Nghệ Trung Quốc chứa lượng lớn turmerone và ar-turmerone [14]

1,8-Cất kéo Nghệ bằng hơi nước ựược 5,8% tinh dầu với các chỉ số sau: Tỷ trọng

ở 200C là 0,929; nD30 1,5054, chỉ số ester 3,2; chỉ số acethyl 26,3 Tinh dầu chứa d.phellandren 1%, d,sabinen 0,6%; cineol 1%; borneol 0,5%; zingiberen 25%; sesquiterpen (tumeron) 58% Một chất ceton C13H20O, một chất alcol C9H11OH là p.tolymethylcarbinol ựược phân tắch thấy trong phần nước cất bay hơi Và một chất kết tinh 0,6% lad didifferuloyl methan

Trong tinh dầu lá Nghệ, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự ựã phân tắch và xác ựịnh hơn 20 thành phần gồm các monoterpen α-phellandren (24,5%), cineol

(15,9%), d.sabinen, zingeren, Curcumin, parahydroxyl cinnamoyl methan, p.p’ dihydroxycinnamoyl methan

Các thành phần chủ yếu trong tinh dầu Nghệ ñược xác ñịnh là những sesquiterpen ceton ar-turmerone, α-turmeron, β-turmeron, curlone, zingiberene và curcumene

Nhiều hợp chất terpen khác cũng ñã ñược xác ñịnh có trong tinh dầu là α và β-pinen, camphen, limonen, terpinen, caryophyllen, linalool, borneo, isoborneol, camphor, eugennol, cineol curzerenon và curcumen

Các chất màu phenolic trong củ nghệ chủ yếu là các dẫn chất của diarylheptan, 3 chất chủ yếu là Curcumin (bisferuloyl methan), bis 4 hydroxy-cinnamoyl)- methan và 4-hydroxycinnamoyl feruloyl methan Thực ra, Curcumin là một hỗn hợp 3 thứ: Curcumin chính thức ( gọi là Curcumin I) chiếm tỷ lệ khoảng 70%, Curcumin II là monodesmetoxy Curcumin chiếm khoảng 20% và Curcumin III là bidesmetorycurcumin chiếm khoảng 10%

Curcumin có nhiệt ñộ nóng chảy ở 176 – 177 OC, tác dụng với kiềm tạo thành muối có màu nâu ñỏ và hòa tan trong ethanol, kiềm, xeton, axit axetic và chloroform [16]

Gần ñây nhiều tác giả ñã nghiên cứu các polysaccharid có hoạt tính sinh vật trong củ nghệ, chất ukonan A, ukonan B và ukonan C, ñã ñược chiết có tác dụng lên hệ thống lưới nội mô (reticuloendo thelissystem) có cấu trúc là L arabinose; D xylose; D galactose; D glucose; L rhamose = D galacturonic acid với tỷ lệ phân tử là:

Chất màu trong củ Nghệ có thể chiết xuất dễ dàng bằng cách dùng dung môi chiết trực tiếp từ bột củ Nghệ hoặc chiết bằng nước kiềm, sau ñó, tủa với acid

Zang Lian Kui; Yang Zhibin ñã chiết Curcumin từ củ Nghệ theo các bước sau:

- Chiết các chất bay hơi (tinh dầu) bằng cất kéo hơi nước

- Chiết với cồn ethylic

- Xử lý với ether dầu hỏa

- Tinh chế với phương pháp acid – base

2.4 Công dụng và hoạt tính sinh học chính từ cây Nghệ vàng

2.4.1 Tác dụng dược lý của cây Nghệ

Nghệ có hoạt tính ức chế chống viêm cấp tính cà viêm mãn tính trong các

mô gây phù bàn chân và gây u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng, ñồng thời có tác dụng thu teo tuyến ức chuột cống ñực non

Tinh dầu Nghệ có hoạt tính chống viêm khớp thực nghiệm Hoạt tính này có thể do ức chế các enzym trypsin và hyaluronidase Curcumin và dẫn chất là những thành phần có hoạt tính chống viêm, tác dụng này có thể do khả năng thu dọn những gốc oxy có liên quan ñến quá trình viêm Một phân ñoạn polysacharid chiết

từ Nghệ tiêm phúc mạc làm tăng khả thực bào ở chuột trắng trong thực nghiệm thanh thải carbon ở dạng keo

Nghệ có hoạt tính chống loét dạ dày và loạn tiêu hóa Cao nước hoặc cao methanol cho thỏ uống làm giảm tiết dịch vị và làm tăng lượng chất nhầy của dịch

vị Cho chuột cống trắng uống cao cồn làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày, tá tràng chống thương tổn gây bởi thắt môn vị, strees gây bởi hạ nhiệt [38] Nghệ kích thích sinh sản chất nhầy ở thành và phục hồi sulfid không protein

ở chuột Curcumin dự phòng và cải thiện những tổn thương gây thực nghiệm ở dạ dày do kích thích sản sinh chất nhầy

Cho bệnh nhân uống bột Nghệ, ngày 4 lần trong 7 ngày ñã có hiệu quả tốt ñối với loạn tiêu hóa axit, loạn tiêu hóa gây ñầy hơi và loạn tiêu hóa mất trương lực Hai thử nghiệm lâm sàng khác ñánh giá tác dụng trên loét dạ dày tá tràng cho thấy việc uống thuốc kích thích sự lành vết loét và làm giảm ñau bụng

Nghệ có tác dụng kháng khuẩn nhờ vào một số thành phần hóa học như:

Curcumin I có tác dụng ức chế in vitro sự phát triển của thực khuẩn lao ở nồng ñộ

tối thiểu 25 µg/ml, ngoài ra còn có tác dụng ức chế Salmonella paratyphi ở nồng ñộ

50 µg/ml, tụ cầu vàng 25 µg/ml Curcumin có tác dụng kháng virus và ức chế proease của HIV-1, HIV-2, muối Na của Curcumin ức chế in vitro sự phát triển của

Micrococus pyogenes var aureus với nồng ñộ 10-6 Tinh dầu Nghệ ức chế trực khuẩn lao ở nồng ñộ 1 µg/ml , Bacciluss subtilis ở nồng ñộ 1/250 Thành phần

turmeron của tinh dầu Nghệ ức chế in vitro các vi khuẩn và nấm, theo thứ tự hoạt tính giảm dần như sau:

Baccillus subtilis, candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, Shigella dysenterium, S Flexneri, Diplococcus pneumoniae, Proteus vulgaris, Baccillus mycoides, Klebsiella sp Salmonella typhi, Escherichia coli Chất ar-turmeron từ tinh dầu và dịch chiết từ n-hexan từ lá Nghệ diệt ấu trùng, muỗi Aedesaegyptii và Mycobacterium tuberculosis ở nồng ñộ tối thiểu 1 µg/ml [4,10]

Nước sắc Nghệ và cao Nghệ lỏng toàn phần của Nghệ làm giảm cholesteron

và lipid toàn phần trong máu một cách rõ rệt, tỉ lệ beta/alphalipoprotein cũng giảm một cách có ý nghĩa so với ñối chứng

Trong ñiều trị bỏng, kem Nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ

tổ chức hoại tử bỏng, có tác dụng kích thích tái tạo tổ chức và liền sẹo Nhưng hiện tượng kích thích tái tạo tăng sinh các tế bào tổ chức liên kết xuất hiện chậm và thời gian lành bỏng kéo dài

Nghệ còn có tác dụng làm giảm tỷ lệ dưỡng bào vỡ khi tiêm liều chết nọc rắn

hổ mang cho chuột lang hoặc khi nhỏ dung dịch nọc rắn hổ mang lên màng treo ruột chuột lang Tác dụng này giải thích việc chữa rắn cắn của Nghệ

Tinh dầu Nghệ cất từ thân rễ khô có tác dụng sát trùng yếu, nó là thuốc chống axit, với liều nhỏ thì làm dễ tiêu, ăn ngon và bổ; với liều cao nó có tác dụng chống co thắt làm ức chế nhu ñọng tăng quá mức của ruột

Cao chiết với dầu hỏa của Nghệ cho chuột cống uống hằng ngày với liều lượng 100 mg/kg, từ ngày thứ 1 ñến ngày thứ 7, ñã có tác dụng ngừa thai với tỷ lệ tương ứng 80% và 100 %

Cao Nghệ chiết với cloroform 10% ñược áp dụng tại chỗ vào những vùng gây bệnh nấm tóc thực nghiệm ở bê Nghệ ñã có hiệu quả ñiều trị tốt và là thuốc chống nấm tốt ñối với các bệnh nấm da

Cao thân rễ Nghệ có hoạt tính dự phòng mạnh chống tổn thương gan gây bởi carbon tetraclorid in vivo và in vitro Cao ñược tách phân ñoạn dựa trên thử hoạt tính bằng thử nghiệm in vitro gây ñộc tế bào gan chuột cống trắng nuôi cấy nguyên phát Tác dụng bảo vệ gan của một số chất tương tự acid ferulic và acid p coumaric, có thể là những chất chuyển hóa của Curcumin cũng ñược thử nghiệm Nghệ phối hợp với các dược liệu khác có tác dụng tăng cường tái tạo tổ chức

ở vết loét cổ tử cung Rễ củ Nghệ phối hợp với một số dược liệu khác kết hợp với châm cứu ñiều trị viêm ñại tràng cho 80 bệnh nhân ñạt tỷ lệ khỏi là 7,5%, ñỡ 72,5% Một bài thuốc có Nghệ vàng và một số dược liệu khác ñã ñược ñiều trị viêm gan siêu vi trùng Có 20 bệnh nhân cấp tính ñều khỏi cả về mặt lâm sàng và xét nghiệm sinh hóa, và có 2 ca mạn tính ñều không khỏi

Một công trình tập hợp kết quả nghiên cứu của 15 nhóm tác giả cho thấy Nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống cho thắt phế quản, kháng histamin, chống viêm, long ñờm

Curcumin với liều lượng 125mg/Kg cho vào dạ dày chuột làm tăng lưu lượng mật và liều lượng 250mg/kg làm tăng hàm lượng cholesterol và axit mật trong mật tiết ra

Nghệ bột có tác dụng có lợi trên dạ dày Nó làm tăng bài tiết mucin ở thỏ và

có thể hoạt tính như gastroprotectant chống lại các chất kích thích [4, 22]

Curcumin có thể ngăn chặn indomethcin, ethanol và loét dạ dày do căng thẳng và cũng có thể ngăn chặn tiết axit môn vị, thắt ñộng mạch gây ra ở chuột [16] 1-phenyl-1hydro-n-pentane, một dẫn xuất của p-tolylmethylcarbinol (một thành phần trong nghệ) làm tăng bài tiết trong huyết tương, Curcumin cũng làm tăng hoạt tính lipase, amylase, trypsin và chymotrypsin của tuyến tụy [32]

Tác dụng ñiều hòa sinh sản của Nghệ ñược thử nghiệm dựa trên tác dụng oestrogen biểu thị ở sự sừng hóa âm ñạo và tăng trọng lượng tử cung ở chuột cái thiến cả hai buồng trứng Chuột ñược cho uống dịch chiết ñông khô Nghệ Sự sừng hóa niêm mạc âm ñạo ñược quan sát thấy ở 100 % chuột Nghệ chỉ tăng trọng lượng

tử cung ở liều cao, liều thấp gây giảm trọng lượng tử cung Nghệ gây tăng số lượng

hồng cầu, trị số hematocrit và hemoglobin Nó gây tăng bạch cầu với liều thấp, nhưng lại gây giảm bạch cầu với liều cao

ðộc tính cấp và mãn tính của cao cồn Nghệ cho uống trên chuột nhắt trắng ñược khảo sát với các liều cấp tính: 0,5 – 1,0 và 3 g/kg thể trọng hoặc liều mạn tính:

100 mg/kg/ngày Trong thí nghiệm này không thấy có tỷ lệ chết có ý nghĩa so với ñối chứng

Sau thí nghiệm mạn tính, các chuột uống Nghệ không tăng trọng lượng, có

sự biến ñổi ý nghĩa về trọng lượng tim và phổi và giảm số lượng hồng cầu và bạch cầu.Trọng lượng của các cơ quan sinh dục, sự vận ñộng của tinh trùng và số lượng tinh trùng tăng ở chuột nhắt ñực uống cao Nghệ Nghệ không có tác dụng ñộc hại với tinh trùng Nghệ không có tác dụng gây ñột biến và không gây ung thư

Một chất tương tự Curcumin chiết từ Nghệ vàng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh ñối với sự tự oxy hóa của acid linoleic trong một hệ nước – cồn Nghệ ức chế tính chất gây ñột biến của các chất ngưng tụ từ khói thuốc lá và dịch chiết thuốc lá [3,4] Theo Vũ ðiền tân dược lập, bản thứ 4 một số tác dụng dược lý của Nghệ ñã ñược nghiên cứu như sau [4]:

- Tác dụng ñối với cơ năng giải ñộc của gan ñã ñược thí nghiệm bằng cách cho uống thuốc có Nghệ, sau ñó theo dõi khả năng giải ñộc của gan ñối với santonin thì thấy tăng cơ năng giải ñộc của gan Nếu uống liên tục, thấy tác dụng rõ hơn là uống một lần

- ðối với bệnh nhân bị galactoza niệu sau khi uống thuốc có Nghệ 10 ngày, kiểm nghiệm lượng galactoza bằng phương pháp Banev thì thấy lượng galactoza giảm xuống

- ðối với lượng urobilin tăng trong nước tiểu, uống thuốc có Nghệ vài ngày

sẽ thấy lượng urobilin trong nước tiểu giảm xuống

- ðối với sự tiết nước mật: Cho nước Nghệ vào tá tràng sẽ thấy lượng nước mật trong tá tràng ñược tăng cao, nhưng lượng bilirubin không tăng, nhưng khi lượng nước mật tăng nhiều, ñộ sánh của nước mật cũng tăng lên

- Nếu như ñang cho nước Nghệ vào tá tràng làm cho lượng nước mật tăng lên, thôi không cho nước Nghệ vào nữa mà cho dung dịch MgSO4 ñặc vào thì lượng nước mật vẫn tăng và ñặc

- Dùng Nghệ trong những bệnh về gan và ñường mật thì thấy chóng hết ñau Nhưng trong những trường hợp sỏi mật cấp tính thì kết quả chậm, chỉ có tác dụng từ từ

Curcumin làm giảm mức ñộ nghiêm trọng của bệnh và bảo vệ tổn thương gây ra bởi nhồi máu cơ tim Curcumin làm tăng nồng ñộ Ca2+ giúp vận chuyển và trượt của cơ tim qua ñó nâng cao khả năng dược lý ñể sửa chữa các khiếm khuyến cân bằng nội môi Ca2+ của cơ tim [29], nếu Curcumin ñược ứng dụng thành công ñối với con người, nó sẽ mở ra một hướng ñi mới cho cách phòng và ñiều trị nhồi máu cơ tim, Curcumin có tác dụng trực tiếp lên nhân tế bào bằng cách ngăn ngừa việc sản sinh quá nhiều protein bất thường

2.4.2 Hoạt tính sinh học của Curcumin và tinh dầu Nghệ

Tác dụng chuyển hóa lipid: Curcumin làm giảm lượng lipoprotein ở nồng ñộ thấp và rất thấp nồng ñộ lipoprotein của huyết tương và cholesterol trong gan cùng với sự gia tăng của tocopherol trong huyết tương của chuột, trong in vivo tương tác giữa chất Curcumin và tocopherol có thể làm tăng tính khả dụng sinh học của vitamin E và giảm nồng ñộ cholesterol Curcumin làm giảm hàm lượng peroxid lipid và cholesterol trong huyết thanh người 10 tình nguyện viên ñược cho uống

500 mg Curcumin mỗi ngày, trong thời gian 7 ngày Kết quả cho thấy lượng peroxid lipid giảm 33%, cholesterol HDL tăng 29%, cholesterol huyết thanh toàn phần giảm 12% Kết quả này ñã khẳng ñịnh tác dụng làm giảm peroxid lipid và cholesterol trong huyết thanh của Curcumin [19]

Tiểu cầu bị kết vón lại tại vị trí các mảng vữa xơ ñộng mạch, sau ñó hình thành cục máu ñông gây cản trở lưu thông dòng máu là nguyên nhân dẫn ñến tắc mạch máu, gây tai biến mạch máu não cũng như các bệnh lý tim mạch Nghiên cứu của Verma ñã chỉ ra rằng Curcumin có khả năng chống lại sự kết tập của tiểu cầu thông qua việc ức chế adenosine diphosphate và adrenaline ở các thí nghiệm trên thỏ và trên chuột.[45]

Hình 2.1 Ảnh hưởng của Curcumin trên các bệnh khác nhau

Hoạt tính chống viêm: Các hoạt tính chống viêm của Curcumin cũng ñược

xác ñịnh ở những bệnh nhân ñã cho thấy cải thiện ñáng kể các triệu trứng sau khi tiêm Curcumin [43] Curcumin có hoạt tính kháng viêm thông qua sự ức chế kích hoạt NFkB, Curcumin cũng cho thấy làm giảm biểu hiện TNF-α do các gen trong các tế bào nội mô ñộng mạch chủ ở bò bằng cách ngăn chặn kích hoạt Ap-1 và NFkB Vai trò kháng viêm của Curcumin cũng do khả năng ức chế cyclooxygenase (COX) (IC50 = 8µM), và lipoxygenase (LOX) (IC50 =52 µM) - hai loại enzyme thúc ñẩy sự viêm nhiễm Sự viêm nhiễm có ý nghĩa quan trọng trong sự khởi phát

và tiến triển một số bệnh ung thư như ung thư da và ñặc biệt là ung thư ruột kết Cơ chế ức chế ñến nay vẫn chưa ñược hiểu biết ñầy ñủ nhưng có nhiều bằng chứng cho rằng Curcumin ñiều hòa một cách chọn lọc LOX và COX-2 mức ñộ trước phiên

mã và phiên mã [7,43] Do ñó, Curcumin là một hợp chất tự nhiên có nhiều ưu ñiểm ñể tổng hợp chất ức chế COX/LOX dùng làm thuốc chống viêm mà không chứa steroit

Hoạt tính chống oxy hóa của Curcumin ñã ñược báo cáo từ rất sớm năm

1975 Từ lâu, người ta dùng Curcumin ñể bảo quản thực phẩm khỏi bị ôi thiu do các phản ứng oxy hóa Quá trình oxy hóa thường sản sinh ra các gốc tự do là yếu tố

thúc ñẩy ung thư nhờ phá hủy ADN và hoạt hóa các gen Do ñó, Curcumin chống oxi hóa sẽ làm giảm sự sản sinh ra các gốc tự do, qua ñó, hạn chế nguy cơ ung thư Hầu hết các chất chống oxy hóa ñều có nhóm phenol và dixetol Curcumin là chất chống oxy hóa duy nhất có chứa rất nhiều nhóm chức β-diketo, liên kết ñôi cacbon – cacbon, vòng phenol và rất nhiều nhóm hydroxyl và methoxy Nó có thể bảo vệ hemoglobin trong quá trình oxy hóa [26,41] Trong ống nghiệm Curcumin có thể ức chế ñáng kể các phản ứng tạo oxy (ROS) như superoxide, anions, H2O2, nitrite ñóng vai trò quan trọng trong chứng viêm

Curcumin cũng làm giảm các phản ứng ROS trong cơ thể Dẫn xuất demethoxycurcumin và bis-demethoxycurcumin cũng là chất chống oxy hóa hiệu quả [41] Curcumin có tác dụng mạnh chống lại phản ứng H2O2 gây hư hại cho các

tế bào keratinocytes của người và các nguyên bào sợi [30]

Curcumin cũng làm giảm oxy hóa protein amyloid trong bệnh Alzheimer ở chuột biến ñổi gen nó cũng làm giảm peroxy hóa lipid trong microsome ở gan chuột, màng hồng cầu ðiều này ñược ñưa ra bằng cách duy trì các hoạt tính của enzyme chống oxy hóa như superroxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase [23] Gần ñây các kết quả nghiên cứu cho thấy Curcumin ngăn ngừa oxy hóa trong quá trình tổn thương dạ dày do indomethacin gây ra và có thể bất hoạt các peroxidase trong dạ dày, loại bỏ H2O2

Cơ chế chống oxy hóa của chất Curcumin do cấu trúc liên hợp ñộc ñáo của

nó, bao gồm 2 methoxylated phenol và cấu trúc enol – β diketone; cấu trúc cho thấy khả năng như một cái bẫy, phá vỡ chuỗi chất chống oxy hóa [26]

Quá trình chống oxy hóa của các chất chứa phenolic ñược trung gian qua 2 giai ñoạn sau ñây:

Trong ñó S là chất oxy hóa, AH là chất phenollic chống oxy hóa, A là chất chống oxy hóa có gốc tự do, X là một dimerize ñể tạo thành một sản phẩm không có gốc tự do Masuda et al [26]

Chống ung thư- cảm ứng apoptosis

Curcumin có hoạt tính chống ung thư mạnh Trong nhiều cơ chế khác nhau, cảm ứng apoptosis ñóng một vai trò quan trọng trong phòng chống ung thư Nó gây

ra apoptosis và ức chế sự tiến triển của chu kỳ tế bào, cả hai ñều là công cụ trong việc ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư ở chuột [8] Hiệu ứng chống Curcumin trung gian thông qua sự ức chế của protein tyrosine kinase và có thể biểu hiện c-myc mRNA và apoptosis thông qua sự ức chế protein tyrosine kinase, protein kinase C, biểu hiện c-myc mRNA và bcl-2 mRNA [8] Curcumin gây ra sự tự chết

tế bảo bởi sự hư hỏng DNA trong các dòng tế bào ung thư của người, TK-10,

MCF-7 và UACC-62 bằng cách làm ñộc topoisomerase II Gần ñây Curcumin ñã ñược chứng minh là gây ra apoptosis trong thế bào thần kinh ở chuột bằng cách làm suy yếu hệ thống ubiquitin-proteasome thông qua con ñường ti thể Curcumin làm sụt giảm nhanh chóng màng ty thể và giải phóng cytochrome C ñể kích hoạt caspase 9

và caspase 3 cho tế bào tự chết [17] Mới ñây một nhận xét liên quan ñến chất Curcumin gây apoptosis trong tế bào ung thư ruột ở người và vai trò của các protein sốc nhiệt ( HSP) Trong nghiên cứu này, các tế bào SW480 ñược chuyển nạp với hsp 70 cDNA sense hoặc antisense ñược nhân dòng ñược lựa chọn và kiểm tra ñộ nhạy của chất Curcumin Curcumin không có hiệu quả ñể gây ra apoptosis trong tế bào có hsp 70, trong khi các tế bào chứa antisense hsp70 rất nhạy cảm với apoptosis bởi chất Curcumin bằng cách cô ñặc nhân tế bào, ñiện thế xuyên màng của ti thể giải phóng cytochrome C, kích hoạt caspase 3 và caspase 9 gây ra apoptosis [35] Biểu hiện của glutathione S-transferase P1-1 (GSTP1-1) có tương quan với chất gây ung thư và Curcumin ñược chứng minh là gây ra apoptosis trong tế bào bạch cầu K562 bằng cách biểu hiện ức chế GSTP1-1 ở cấp ñộ phiên mã Cơ chế apoptosis

do Curcumin cũng ñược nghiên cứu trong các tế bào Caki, Curcumin gây ra apoptosis thông qua ñiều chỉnh Bcl-XL và IAP, giải phóng cytochrome C và ức chế Akt, trong ñó bị ngăn chặn bởi Nacetylcysteine cho thấy vai trò của ROS trong sự chết tế bào do Curcumin [42] Trong tế bào ung thư LNCaP Curcumin gây ra apoptosis bởi tăng cường khối u chết hoại liên quan ñến apoptosis và yếu tố gắn ( TRAIL) việc ñiều trị kết hợp của các tế bào bằng Curcumin và TRAIL gây ra sự

phân mảnh DNA cắt procaspase 3,8 và 9 và giải phóng cytochrome từ ty thể, cho thấy sự tham gia bên ngoài của 2 thụ thể trung gian và bản chất hóa học bên trong gây ra apoptosis trong các tế bào này [11] Trong dòng tế bào ung thư trực tràng Curcumin làm chậm và kéo dài apoptosis cùng với việc ngưng lại chu kỳ tế bào ở giai ñoạn G1 Curcumin cũng làm giảm biểu hiện của gen P53, cùng với cảm ứng gen hsp -70 thông qua sự giảm Ca2+ nội bào Curcumin gây ra apoptosis và phân mảnh DNA lớn cũng ñã ñược tìm thấy trong Vγ9δ2+ tế bào T thông qua sự ức chế isopentenyl pyrophosphate kích hoạt NFkB, và sản xuất chemokine [9] Curcumin gây ra apoptosis ở người bị bệnh máu trắng Hl-60, bị chặn bởi một số chất chống oxy hóa

Hình 2.2 Curcumin và hệ thống Apoptosis

Ung thư trực tràng cũng ñược ngăn ngừa bằng Curcumin thông qua việc ngừng tiến triển chu kỳ tế bào và ức chế tổng hợp prostaglandin.[26]

Curcumin cũng ức chế phát triển khối u thông qua các con ñường khác nhau Nitric oxide (NO) và các dẫn xuất của nó ñóng một vai trò quan trọng trong việc ñẩy mạnh phát triển các khối u Curcumin ức chế sản xuất ra iNOS (enzyme xúc tác tạo ra NO) và COX-2 và ức chế kích hoạt NFkB Curcumin gây ra apoptosis trong

tế bào ung thư AK-5 thông qua sự ñiều chỉnh caspase-3 Gần ñây, trong các tế bào Jurkat, Curcumin có thể ngăn chặn sự suy giảm glutathione, do ñó bào vệ các tế bào caspase-3 và phân mảnh DNA oligonucleosomal [31]

Curcumin chống tăng sinh mạch máu ở khối u: Trong cơ thể, khi một mô

nào ñó có biểu hiện tăng sinh (bao gồm cả khối u) thì một số enzyme nhất ñịnh sẽ hoạt ñộng kích thích sự hình thành mạnh máu mới ñáp ứng cường ñộ trao ñổi chất mạnh tại ñó gọi là sự tăng sinh mạch máu Nó cho phép khối u xâm lấn và lan rộng

ra các mô xung quanh Curcumin tác dụng ức chế tăng sinh mạch máu bằng cách ức chế AP-1 - một nhân tố kích thích tăng sinh mạch máu Một số loại enzyme thúc ñẩy tăng sinh mạch máu cần kim loại ñể thực hiện chức năng, ví dụ metalloproteinase cần Fe và Al ñể tăng sinh mạch máu cho khối u Curcumin giữ Fe2+ và Al3+ làm giảm hoạt ñộng của enzyme này Trong nghiên cứu về sự di căn của khối u ở những bệnh nhân ung thư gan, Curcumin ức chế 70% di căn nhờ kìm hãm hoạt ñộng của metalloproteinase-9.[26,47]

Curcumin giúp tăng cường miễn dịch:Curcumin giúp tế bào chống chọi với ung thư Nó có khả năng ức chế nitric oxide synthase trong ñại thực bào ñã hoạt hóa (IC50 = 6 µM) Ở ruột, sau khi tiêu hóa Curcumin, người ta nhận thấy tế bào B và trợ bào T biểu hiện CD4+ nhiều hơn mức bình thường Cùng với kích thích miễn dịch cục bộ này, Curcumin cũng làm tăng hoạt ñộng toàn bộ hệ miễn dịch Nghiên cứu trên chuột chỉ ra sự tăng lượng kháng thể và nhiều hoạt tính miễn dịch khác khi ñiều trị với Curcumin.[48]

Curcumin có hoạt tính chống ñông máu: Curcumin có hoạt tính chống

ñông máu do ức chế collagen và adrenaline gây ra kết hợp các tiểu cầu cả trong in vitro và in vivo ở ñộng mạnh chủ của chuột [40]

Tinh dầu các các chất chiết xuất trong dung dịch của củ nghệ cho hiệu quả tránh thai 100% ở chuột Curcumin ức chế 5α-reductase, chuyển testosteron thành

5α-dihydrotestosteron, do ñó ức chế sự tăng trưởng của các cơ quan bên sườn ở chuột Curcumin cũng ức chế sự vận ñộng của tinh trùng ở người tiềm năng phát triển thành biện pháp tránh thai mới [36]

Hoạt tính kháng khuẩn: Curcumin và tinh dầu ngăn chặn sự sinh trưởng của

một số vi khuẩn như Streptococcus, Staphylococos, Lactobacillus,vv Curcumin cũng ngăn cản sự tăng trưởng của dòng Helicobacter pylori CagA + trong invitro [25]

Kháng nấm: ete, chloroform và tinh dầu chiết xuất từ C longa có tác dụng

kháng nấm Chiết xuất ethanol cũng có hoạt tính kháng nấm Dầu nghệ có hoạt tính

chống lại Aspergilus flavus, A parasiticus, Fusarium moniliforme và penicillium [18]

Kháng virus: Curcumin ñã ñược chứng minh là có hoạt tính kháng virus

Curcumin kháng Epstein Barr virus (EBV) thông qua ức chế kích hoạt BZLF1 protein phiên mã trong tế bào Raji DR-LUC [15] Quan trọng nhất Curcumin cho thấy khả năng chống HIV Curcumin ức chế enzyme integrase của virus HIV-1 gây

ra AIDS Integrase giúp cho DNA của HIV-1 gắn ñược vào với nhiễm sắc thể của tế bào ký chủ, bước này rất cần thiết ñể cho virus nhân lên Curcumin ngăn chặn kết nối một ñoạn DNA của virus (dài 40 micromet) vào nhiễm sắc thể của người, khi enzyme integrase rút ngắn số axit amin 50 ñến 212 Curcumin vẫn ngừng hoạt ñộng của emzyme ðiều này có nghĩa Curcumin tương tác với các phần của enzyme [10] Hai hóa chất có hình dạng giống Curcumin là cinnamate methyl và axit chlorogenic không ức chế ñược integrase Integrese là mục tiêu quan trọng ñối với các loại thuốc chống lại AIDS Vì vậy Curcumin có tiềm năng trở thành loại thuốc có thể ngăn chặn ñược HIV

Curcumin ức chế bleomycin gây xơ hóa phổi ở chuột [33] Dùng Curcumin với liều 300mg/kg có thể ức chế bleomycin do tăng số lượng tế bào và các chị thị sinh học của chứng viêm Nó cũng ức chế bleomycin gây ra sản xuất ñại thực bào phế nang của TNF-α, surperoxide và nitric oxide Vì vậy Curcumin như một tác nhân kháng viêm và sơ hóa mạnh

Ar-turmerone, chiết xuất từ nghệ vàng vô hiệu hóa xuất huyết do nọc ñộc rắn Bothrops và của nọc ñộc rắn ñuôi chuông 70% gây tử vong ở chuột Nó hoạt ñộng như 1 enzyme ức chế nọc ñộc với các hoạt ñộng thủy phân protein [13]

Hoạt tính chống ñộng vật nguyên sinh Chiết xuất ethanol của củ nghệ có hoạt tính chống Entamoeba histolytica Curcumin có hoạt tính chống Leishmania trong in vitro [21]

2.5 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.5.1 Tính toàn năng của tế bào

Năm 1952, Haberlandt ñã ñề xuất học thuyết tính toàn năng của tế bào: “Mỗi một tế bào của một cơ thể ña bào ñều mang trong mình ñầy ñủ các thông tin di truyền ñể kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh Vì vậy khi ñặt tế bào vào trong ñiều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể”

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) ñã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh ñược tính toàn năng của tế bào Thành công trên ñã tạo ra công nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho ñến nay, con người ñã hoàn toàn chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

2.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa

Sau khi thụ tinh hình thành hợp tử, hợp tử phân chia ñều ñặn tạo ra các tế bào phôi sinh hoàn toàn giống nhau về hình dạng, chức năng Sau ñó các tế bào phôi sinh trải qua quá trình chuyên hóa tạo ra các tế bào có hình dạng khác nhau và thực hiện các chức năng sinh lý khác nhau Sự chuyển các tế bào phôi sinh thành tế bào chuyên hóa ấy chính là sự phân hóa Ví dụ, ở thực vật, từ hợp tử ban ñầu phân chia tạo các tế bào phôi sinh, các tế bào này phân hóa thành các mô chuyên hóa, hình thành nên các cơ quan khác nhau của cây [5]

Ngược lại, trong một số trường hợp nhất ñịnh, từ một tế bào ñã chuyên hóa lại trở về tế bào phôi sinh, và những tế bào phôi sinh này chỉ có khả năng phân chia

tế bào mới chứ không thực hiện chức năng chuyên hóa, ñược gọi là quá trình phản phân hóa Ví dụ, tế bào mô lá, mô rễ qua xử lý bằng các tác nhân, bị sùi lên, hình thành mô sẹo

Sự phân hóa và phản phân hóa là con ñường ñể thể hiện tính toàn năng của thế bào trong công nghệ nuôi cấy mô – tế bào thực vật Trong thực tế ñấy chính là

sự hoạt hóa hoặc ức chế các gen trong DNA của tế bào Khi gen quy ñịnh một hoạt ñộng nào ñó của tế bào ñược hoạt hóa thì tế bào sẽ thể hiện chức năng ñó, và ngược lại khi gen ñó bị ức chế Việc ñóng mở các gen ñược thực hiện bởi các tín hiệu của môi trường hay chính tế bào Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, việc ñó ñược ñiều khiển bởi các tác nhân của môi trường nuôi cấy ñặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ xung vào môi trường

2.5.3 Nuôi cấy tế bào thực vật, các hợp chất tự nhiên và ứng dụng trong công nghiệp [49]

Ngoài kỹ thuật hóa học và kỹ thuật dược học ñang phát triển một cách nhanh chóng và hiện ñại thì thực vật bậc cao vẫn là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học và dược liệu rất quan trọng Tuy nhiên trong những năm gần ñây sản lượng các

thực vật ñó rất khó ñảm bảo ở mức ổn ñịnh do hậu quả của một số yếu tố như: + ðiều kiện tự nhiên không thuận lợi

+ Chi phí lao ñộng ngày càng tăng

+ Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt

Phương pháp nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên Những tiến bộ của kỹ thuật này trong những năm gần ñây ñã ñược nhiều công trình tổng kết Nuôi cấy tế bào thực vật trong ñiều kiện in vitro ñể sản xuất các chất tự nhiên có một số ưu ñiểm sau: + Các tế bào thực vật có thể ñược nuôi cấy trong các ñiều kiện

nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và ñịa lý Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

+ Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô

và sự ñồng nhất giữa các lô sản xuất

+ Một số sản phẩm trao ñổi chất có thể ñược sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

Thách thức lớn nhất ñối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn ñịnh cho phép nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và ñạt hiệu suất tối ña cho sự tích lũy

và sản xuất các hợp chất tự nhiên (hay còn gọi là các sản phẩm thứ cấp) ðiều này

có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có sản lượng cao, xây dựng các công thức môi trường dinh dưỡng hợp lý ñể nuôi cấy

tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả

2.5.3.1 Nuôi cấy tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con ñường hóa học Những năm gần ñây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả ñược mong ñợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này Ưu thế về mặt nguyên

lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung 2 cấp liên tục nguồn nguyên liệu ñể tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004)

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng ñến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái Nhiều hợp chất thứ cấp ñược sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng ñược tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái

và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức ñộ nào ñó trong khối ñể tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001)

Nuôi cấy tế bào huyền phù thường khởi ñầu bằng cách ñặt các khối callus dễ

vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển ñộng (lắc hoặc khuấy) Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển ñộng xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào ñơn, các cụm

tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các

tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các

tế bào ñơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức ñộ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào ñặc tính của các khối tế bào xốp và có thể ñiều chỉnh bằng cách thay ñổi thành phần môi trường (Misawa, 1994)

Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có

ưu ñiểm là thao tác thí nghiệm ñơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược ñiểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc ñược một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao ñổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn ñến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men

vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng

2.5.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật

Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy

mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995) Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ñược khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích ñể nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này ñược phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu ñiểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và ñáng tin cậy dựa trên những lý do sau:

(1) tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự ñiều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, ñộc lập với khí hậu và ñiều kiện ñất trồng

(2) phủ ñịnh ảnh hưởng sinh học ñến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng)

(3) có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau (4) với việc tự ñộng hóa ñiều khiển sự sinh trưởng của tế bào và ñiều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh ñó, những

kết quả nghiên cứu gần ñây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng ñược sử dụng ñể sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999)

Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn ðể thu ñược hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta ñã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt ñộng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao 2000, Dixon 1999) Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những ñiều kiện ñặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và ñiều kiện nuôi cấy thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)

Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy Các thông số hóa học và vật lý như thành

phần và pH môi trường, chất ñiều hòa sinh trưởng, nhiệt ñộ nuôi cấy, sự thông khí,

sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng ñến hàm lượng các hợp chất thứ cấp ñã ñược nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và

cs 1999) Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi ñược nuôi cấy ở ñiều kiện tối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy

Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Các tế bào thực vật trong

nuôi cấy là một tập hợp các ñặc ñiểm sinh lý ñộc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy ñã ñược Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau ñó phương thức này ñã ñược ứng dụng rộng rãi Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc

ñã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin ñược sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố

mẹ (Yamamoto và cs 1982) Yamada và Sato (1981) ñã chọn lọc ñược một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước ñây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin ñạt tới 1,2 g/L

Cung cấp tiền chất (precursor feeding) Bổ sung các tiền chất của quá

trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản

phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt ñầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ

Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993) Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis ñã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia ñã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn ñến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004)

Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) Thực vật sản xuất các hợp chất

thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp

Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức ñể thu ñược các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (ñược phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) ñể kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và ñạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985)

2.5.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học

Những năm gần ñây, thuốc truyền thống trở thành một ñề tài quan trọng mang tính toàn cầu Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong ñiều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn ñược dùng phổ biến

do yếu tố lịch sử và văn hóa Theo các ñánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học Vấn ñề ñặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc ñang biến mất nhanh chóng do sự không ổn ñịnh của ñiều kiện môi trường và các yếu tố khác Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu ñủ lớn ñể tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm ðiều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính ñến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác ñể cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này