3.1. Vật liệu:
- Mẫu Nghệ vàng ựược lấy tại vườn lưu trữ giống cây dược liệu của công ty cổ phần Dược phẩm Bắc Ninh.
- Lát cắt củ cây Nghệ vàng (mô già, bánh tẻ và mô non)
- Các loại môi trường, MS, N6, MT và các chất ựiều tiết sinh trưởng chất kắch thắch sinh trưởng (NAA, BAP, 2,4-D ), dung dịch Johnson, dung dịch HgCl2 do các hãng Fermentas (Mỹ), PrọLab, Sigma (Mỹ), có trụ sở ựại diện ở Việt Nam cung cấp.
- Các thiết bị như bốc cấy, nồi hấp, máy ựo pH, máy ựo OD, tủ ổn nhiệt, máy ựiều chỉnh ánh sáng, Ầ do các hãng của Nhật, đức, Mỹ sản xuất.
3.2. Nội dung nghiên cứu:
3.2.1. Nội dung 1: Thắ nghiệm về khử trùng mẫu:
Nội dung 1a: Ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% và dung dịch Johnson 10% ựến sự sống và khả năng hình thành callus của củ Nghệ. Phối hợp các chất theo bảng 3.1a:
- Vật liệu: Lát cắt củ bánh tẻ
- Môi trường nền: MS ựầy ựủ, Saccharose 2 %, Agar 0,8 %, 2,4-D 3 mg/L, pH môi trường ~ 5,8
Bảng 3.1a: Công thức ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% và dung dịch Johnson 10% ựến sự sống và khả năng
hình thành callus của củ Nghệ. Công thức HgCl2 0,1% (phút) Johnson 10% (phút) CT1 10 5 CT2 10 10 CT3 10 15 CT4 10 20
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Nội dung 1b: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2
0,1% và dung dịch Johnson 10% ựến sự sống và khả năng hình thành callus. Phối hợp các chất theo bảng 3.1b:
- Vật liệu: Lát cắt củ bánh tẻ
- Môi trường nền: MS ựầy ựủ, Saccharose 2 %, Agar 0,8 %, 2,4-D 3 mg/L, pH môi trường ~ 5,8
Bảng 3.1b:Công thức ảnh hưởng của sự phối hợp thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% và dung dịch Johnson 10% ựến sự sống và khả năng
hình thành callus của củ Nghệ Công thức Johnson 10% (phút) HgCl2 0,1% (phút) CT1 A 5 CT2 A 10 CT3 A 15 CT4 A 20
A là thời gian khử trùng tốt nhất ở thắ nghiệm 3.1a
3.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ựến sự phát sinh callus
- Vật liệu: Lát cắt củ bánh tẻ
- Các môi trường theo bảng 3.2 có bổ sung Saccharose 2 %, Agar 0,8 %, 2,4D 3 mg/L, pH môi trường ~ 5,8, chọn ựiều kiện khử trùng tốt nhất ở trên.
Bảng 3.2: Công thức ảnh hưởng của môi trường ựến sự phát sinh callus
Công thức Môi trường
CT1 MS
CT2 MT
CT3 N6
3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ựến sự phát sinh Callus.
- Vật liệu: Lát cắt củ báng tẻ
- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở nội dung 2, bổ sung Saccharose 2 %, Agar 0,8 %, 2,4-D 3 mg/l, pH môi trường ~ 5,8, bổ sung BAP theo bảng 3.3. Chọn ựiều kiện khử trùng tốt nhất ở trên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Bảng 3.3: Công thức ảnh hưởng của BAP ựến sự phát sinh callus
Công thức Nồng ựộ BAP (mg/l) CT1 0 CT2 0,2 CT3 0,4 CT4 0,6 CT5 0.8
3.2.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ựến sự phát sinh Callus.
- Vật liệu: Lát cắt củ bánh tẻ
- Môi trường nền: Môi trường tốt nhất ở trên, bổ sung Saccharose 2 %, Agar 0,8 %, 2,4-D 3 mg/l, BAP tốt nhất ở trên, bổ sung NAA theo bảng 3.4, pH môi trường ~ 5,8. Chọn ựiều kiện khử trùng tốt nhất ở trên.
Bảng 3.4: Công thức ảnh hưởng của NAA ựến sự phát sinh callus Công thức Nồng ựộ BAP (mg/l) Nồng ựộ NAA (mg/l)
CT1 B 0
CT2 B 1,5
CT3 B 2,0
CT4 B 2,5
CT5 B 3,0
B là nồng ựộ BAP tốt nhất ở thắ nghiệm nội dung 3
3.2.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu mô nuôi cấy ựến sự hình thành Callus. thành Callus.
Mẫu cấy là lát cắt củ (0,5cm x 0,5cm) của mô non (chồi củ), mô bánh tẻ, mô già nuôi cấy trong ựiều kiện khử trùng và môi trường tối ưu rút ra từ các thắ nghiệm trên.
3.2.6. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus.
Từ các thắ nghiệm ựã tiến hành ựể xây dựng quy trình nuôi cấy mô cây Nghệ tạo callus, từ ựó thử nghiệm quy trình trên quy mô lớn hơn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
3.2.7. định lượng hàm lượng Curcumin trong củ Nghệ ngoài tự nhiên và callus
định lượng hàm lượng Curcumin trong củ ngoài tự nhiên, Curcumin trong callus cấp 1, cấp 2 và cấp 3, sau ựó so sánh hàm lượng Curcumin giữa các cấp và so với củ Nghệ ngoài tự nhiên.
3.3. Phương pháp nghiên cứu: 3.3.1. Chuẩn bị mẫụ 3.3.1. Chuẩn bị mẫụ
Mẫu Nghệ tươi ựược rửa sạch ựất bằng nước máy, cắt bỏ rễ, và cạo sạch vỏ sau ựó khử trùng bằng dung dịch HgCl2 và dung dịch Johnson. Sau khử trùng rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, thấm khô và cắt thành những lát mỏng (0,2 mm), hình vuông (0,5 x 0,5 cm) sau ựó cấy vào bình trụ chứa môi trường nuôi cấy, mỗi bình 4- 5 mẫụ
3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi