Những năm gần ựây, thuốc truyền thống trở thành một ựề tài quan trọng mang tắnh toàn cầụ Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong ựiều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn ựược dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóạ Theo các ựánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn ựề ựặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc ựang biến mất nhanh chóng do sự không ổn ựịnh của ựiều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu ựủ lớn ựể tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tắnh ựến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác ựể cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm nàỵ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
Nuôi cấy tế bào của nhiều cây dược liệu ựã ựược tiến hành nhưng trong nhiều trường hợp người ta không tìm thấy hoặc thấy với lượng rất nhỏ (dạng vết) các hợp chất muốn có. Tuy nhiên, tới nay thực tế ựã cho thấy có những thắ nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp thực vật với hàm lượng lớn hơn cả hàm lượng của các chất ựó ở chắnh những bộ phận thực vật có nhiệm vụ tắch trữ các hợp chất ựặc biệt nàỵ
Nuôi cấy ựầu tiên ựược phân lập có chứa hàm lượng cao các sản phẩm thứ cấp ựó là các nuôi cấy sản xuất ra các hợp chất sắc tố như anthocyanin trong tế bào
Haplopappus, betalain trong callus của củ cải ựường hoặc anthraquinon trong tế bào của Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia và các loài Galium. Trong trường hợp của cây Morinda và Galium, người ta ựã nâng ựược hàm lượng anthraquinon trong nuôi cấy tế bào lên 20 lần so với rễ là cơ quan tắch trữ các hợp chất này của các cây nói trên. Kể cả khi người ta so sánh hàm lượng các chất trong tế bào và là tế bào chuyên sản sinh ra các chất ựó thì hàm lượng ở tế bào nuôi cấy vẫn lớn hơn từ 2-4 lần.
Hàm lượng tương ựối cao của Ubiquinon-10 ựược tìm thấy trong tế bào thuốc lá và L-dopa trong môi trường nuôi cấy tế bào Mucuna pruriens. Nhiều công trình cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình thường. Người ta ựã phân lập ựược các dòng tế bào Catharanthus sản xuất serpentin ajmalicin từ nuôi cấy in vitrọ Bằng loại môi trường sản xuất ựặc biệt họ ựã ựưa ựược sản lượng alkaloid của hai dòng tốt nhất lên một mức cao hơn nữa, trong ựó một dòng tạo ựược 162 mg/L serpentin, còn dòng kia tạo ựược 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L ajmalicin. Cũng rất ựáng chú ý là nuôi cấy tế bào cây Panax pseudoginseng cho hàm lượng saponin khá cao và nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhiza glabra ựạt ựược hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô. Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất ựược xác ựịnh trong nuôi cấy tế bào của cây Coleus blumei, ựó là 13-15% trọng lượng khô chất rosmarinic acid trong chu kỳ nuôi 13 ngàỵ Nồng ựộ rosmarinic acid trong tế bào nuôi cấy lớn hơn năm lần so với trong câỵ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
Trên lĩnh vực steroid và chuyển hóa steroid các dòng tế bào có năng suất cao ựã ựược nghiên cứụ Một số công trình ựã nuôi cấy thành công tế bào của cây
Dioscorea deltoidea với sản lượng diogenin là nguyên liệu thô chắnh ựể sản xuất các steroid chống thụ thai và các hormone thượng thận. Quá trình chuyển hóa các steroid ựược khá nhiều phòng thắ nghiệm nghiên cứụ Chẳng hạn, nghiên cứu quá trình sinh chuyển hóa các hợp chất glycoside cardiac bằng nuôi cấy tế bào của
Digitalis lanata mặc dù tế bào Digitalis lanata ngừng sản xuất glycoside cardiac nhưng chúng vẫn có khả năng hydroxyd hóa digitoxin ở nguyên tử C12 ựể tạo ra digoxin. Digoxin là một hợp chất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóa xảy ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu quả khi ựưa vào môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày người ta thu ựược 4 g β- methyl-digoxin trong một bình nuôi dung tắch 20 lắt.
Ngoài ra, người ta còn có thể thu ựược các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây Coffea arabica, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu ựược hàm lượng ựáng kể berberin trong rễ, song hàm lượng này có thể thu ựược sau 4 tuần bằng phương pháp nuôi cấy tế bào)... Những chất này ựược sử dụng rộng rãi trong công nghệ hương liệu và trong y học. Chất reserpin là chất có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối loạn tuần hoàn khác cũng ựược sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào cây này trong 30 ngày có thể sản xuất ựược 3500 kg reserpin, tương ựương với lượng hàng năm của cả thế giới thu ựược từ rễ cây ựó. Chất naptathoquinones chiết từ rễ cây cỏ rễ máu (puccoon) ựược dùng ựể chữa bỏng và bệnh ngoài dạ Chất này cũng ựược sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, sản lượng chất này ựược tạo ra từ mô nuôi cấy cao hơn tám lần so với cây tự nhiên. Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) ựã sản xuất ựược loại alkaloid scopolanin từ tế bào cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấỵ Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật ựột biến tế bào trần, biến dị ựơn dòng và kỹ thuật gen, người ta ựã làm tăng sản lượng scopolamin gấp ngàn lần.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chlorideựược sử dụng ựể chữa bệnh rối loạn tiêu hóạ để thu ựược nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) C. japonicạ Sau ựó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) ựã cải thiện ựược năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa 1994).
Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự ựã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là ỘtaxolỢ chiết từ cây thông ựỏ Pacific (Taxus brevifolia). đến năm 1983, taxol ựược Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) ựồng ý ựưa vào thử nghiệm ở giai ựoạn I ựiều trị cho ung thư buồng trứng. Sau ựó, FDA ựã cho phép sử dụng taxol trong ựiều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng ựối với các bệnh nhân có khối u ác tắnh, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó ựược xem như là chất ựầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong ựiều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết ựược một lượng rất ắt từ vỏ của cây thông ựỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tắnh theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu ựược 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn ựợt ựiều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do ựó, cần có những nguồn khác ựể thay thế mới ựáp ứng ựược nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học.
Nuôi cấy tế bào các loài Taxus ựược xem như là một phương pháp ưu thế ựể cung cấp ổn ựịnh nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff 1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus ựã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và ựang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. FettNeto và cs (1994) ựã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tắch lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidatạ Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccatạ Lee và cs (1995) ựã nghiên cứu sản xuất taxol bằng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài ựược tìm thấy tại đài Loan ở ựộ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu ựược từ callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi ựược bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lắt dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol.
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm ựược sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh ựái ựường, sapogenin khác nhaụ Trong ựó, ginsenoside-Rb có hoạt tắnh an thần, còn Rg có hoạt tắnh kắch thắch. Từ 1973, Furuya và cs ựã nuôi cấy mô callus P. ginseng ựể phân lập saponins và sapogenins. Năm 1994, Choi bắt ựầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. đến nay, ựây là một trong các ựối tượng ựược các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất.
Merkli và cs (1997) ựã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này ựã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu ựược cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này ựã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan ựến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với ựối chứng.
Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophorạ Phương pháp này ựược sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù ựược thiết lập bằng cách ựưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D). Nồng ựộ saccharose tối thắch cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu ựược trong trường hợp này ựạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay ựã ựược ứng dụng trên quy mô công nghiệp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
Tóm lại, nuôi cấy mô và tế bào thực vật có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp với năng suất cao và trong một vài trường hợp cao hơn hẳn so với những cây hoàn chỉnh có năng suất cao nhất.