Sắc tố thực vật và kỹ thuật thu nhận

Sắc tố là những hợp chất hóa học chỉ phản xạ ánh sáng ở bước sóng khả kiến và tạo nên màu sắc. Hoa, san hô và thậm chí cả da động vật chứa các loại sắc tố tạo nên màu sắc của chúng. Và một đặc tính quan trọng hơn là khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng nhất định. Màu sắc của thực vật xuất hiện nhờ các hợp chất màu gồm biochromes, có khả năng hấp thụ và phản xạ ánh sáng ở những bước sóng khác nhau, và sự phản xạ ánh sáng sẽ thể hiện màu sắc. Màu sắc còn là kết quả của hỗn hợp bước sóng còn lại được phản xạ. Mắt con người có khả năng nhìn thấy ánh sáng trong dãy 400700nm, tương đương với dãy màu của cầu vồng được Newton tìm ra: đỏ, cam, vàng, lục, lam, chàm, tím.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Thị Thủy Tiên đã tận tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu của mình giúp tôi hoàn thành chương trình học

Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án môn học này

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011

Trần Thị Thanh Huệ

ii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2011

Chữ ký của giáo viên

iii

MỤC LỤC

Chương 1: KHÁI NIỆM CHUNG VỀ SẮC TỐ THỰC VẬT 1

1.1 Khái niệm 1

1.2 Các loại sắc tố có trong thực vật 3

1.2.1 Màu xanh lá – Chlorophylls 3

1.2.2 Màu vàng, cam và đỏ - Carotenoid 5

1.2.3 Màu đỏ, xanh dương và đỏ tía – Anthocyanin và Betalain 6

1.2.3.1 Flavonoid 6

1.2.3.2 Màu xanh dương 8

1.2.3.3 Betalains 8

Chương 2: NHÓM SẮC TỐ CAROTENOID 11

2.1 Giới thiệu 11

2.2 Tính chất 11

2.2.1 Tính chất vật lý 12

2.2.2 Tính chất hóa học 12

2.3 Cấu trúc và chức năng 13

2.4 Sinh tổng hợp và điều khiển 17

2.4.1 Sinh tổng hợp carotenoid và lạp thể 17

2.4.2 Isoprenoid-chất nền carotenoid 19

2.4.3 Phytoene synthase 21

2.4.4 Desaturase 22

2.4.5 Isomerase 23

2.4.6 Cyclase 24

2.4.7 Hydroxylase 26

2.4.8 Zeaxanthin epoxidase và violaxanthin de-epoxidase 26

2.4.9 Neoxanthin synthase 27

2.4.10 Sản phẩm tách 27

Chương 3: KỸ THUẬT THU NHẬN CAROTENOID 28

3.1 Giới thiệu 29

iv

3.2 Chuẩn bị mẫu, chiết tách và xà phòng hóa 30

3.3 Lọc và tách 31

3.3.1 Sắc ký cột 31

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng 31

3.3.3 Sắc ký lỏng hiệu suất cao 33

3.4 Đặc điểm và xác định 34

3.4.1 Phổ khả kiến và phổ hồng ngoại 34

3.4.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 35

3.4.3 Khối phổ 36

3.4.4 Nghiên cứu hóa học lập thể 36

3.4.5 Hóa học vi lượng 37

3.4.6 Định lượng 37

Chương 4: VAI TRÕ CỦA CAROTENOID ĐỐI VỚI CON NGƯỜI 38

4.1 Vai trò của carotenoid trong việc duy trì sức khỏe con người 38

4.2 Carotenoid và tổn hại quang oxy hóa 40

4.3 Carotenoid và sự điều khiển các phản ứng của hệ miễn dịch 40

4.4 Carotenoid và sự ức chế bệnh tim mạch 41

4.5 Carotenoid và phòng ngừa ung thư 41

4.6 Tăng tiềm lực của hoạt tính carotenoid 42

KẾT LUẬN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loại sắc tố chính ở thực vật và ở các sinh vật khác 3

Bảng 1.2 Các anthocyanidin phổ biến và màu sắc của chúng 9

Bảng 2.1 Bước sóng hấp thụ mạnh nhất đối với một số carotenoid 12

Bảng 2.2 Tên hệ thống của carotenoid 17

Bảng 3.1 Sắc ký lớp mỏng của carotenoid Giá trị R F ( β-carotene = 1.00 của hệ thống 1,2 và 3, và giá trị R F cho hệ thống 4 33

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quang phổ khả kiến của bức xạ điện từ 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các loại sắc tố thực vật 11

Hình 2.1 Sự đa dạng của carotenoid 14

Hình 2.2 Sinh tổng hợp carotenoid ở thực vật bậc cao 19

Hình 2.3 Sự sinh tổng hợp isoprenoid theo con đường MVA và MEP 20

Hình 3.1 Cấu trúc một vài carotenoid điển hình 32

Hình 3.2 Quang phổ hấp thu thấy được của β-carotene, γ-carotene và lycopene trong dầu ether 37

Hình 3.3 Cấu trúc của dinochrome A 39

Màu sắc của thực vật xuất hiện nhờ các hợp chất màu gồm biochromes, có khả năng hấp thụ và phản xạ ánh sáng ở những bước sóng khác nhau, và sự phản xạ ánh sáng

sẽ thể hiện màu sắc Màu sắc còn là kết quả của hỗn hợp bước sóng còn lại được phản xạ Mắt con người có khả năng nhìn thấy ánh sáng trong dãy 400-700nm, tương đương với dãy màu của cầu vồng được Newton tìm ra: đỏ, cam, vàng, lục, lam, chàm, tím

Những bí ẩn của các loại sắc tố thực vật là điều cuốn hút lâu đời nhất đối với các nhà thực vật học.Nghiên cứu đầu tiên được công bố về carotenoid vào thế kỷ 19, và thuật ngữ “diệp lục tố” lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1818 Sự đa dạng của màu sắc và việc dễ dàng nhận dạng sự thay đổi đã giúp hoa trở thành đối tượng nghiên cứu gen phổ biến nhất, mở đầu là thí nghiệm của Mendel trên cây đậu Hà lan, dẫn tới việc xác định yếu tố màu sắc di động được gọi transposon trong cây bắp, đã giúp cho Barbara McClintock nhận được giải Noel về sinh lý học và y học vào năm 1983 Những nghiên cứu về sắc tố đã dẫn đến phát hiện mang tính đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử; Ví

dụ như khi nghiên cứu về anthocyanin, đã xác định được nhân tố chuyển vị đầu tiên, và thực hiện sự phân tách cDNA

Các sắc tố chịu trách nhiệm thể hiện màu sắc trong những thực vật bậc cao được phân loại thành các nhóm: chlorophyll, carotenoid (carotene, xanthophyll), flavonoid (chalcone, anthocyanin, flavone, flavonol) và betalain (betaxanthin, betacyanin)

Trong tế bào Prokaryote (Cyanobacteria) và Eukaryote (tảo đỏ) , đó là những sắc

tố quang hợp có thể tan được trong nước gọi là phycobilin, được tìm thấy trong tế bào chất hoặc stroma của lục lạp Có hai loại phycobilin – phycocyanin và phycoerythrin Sắc

tố hơi xanh phycocyanin được tìm thấy trong cyanobacteria và đem đến cho chúng cái tên “blue-green algae”, và sắc tố hơi đỏ phycoerythrin chỉ được tìm thấy trong tảo đỏ Những sắc tố này liên kết cộng hóa trị với protein tạo thành phycobiliprotein và một phức siêu phân tử gọi là phycobilisome Hai phycobilin chính là phycocyanobilin và phycoerythrobilin hấp thụ ánh sáng tương ứng tại bước sóng 620 nm và 560 nm

Màu sắc thực vật rất đa dạng Có khoảng 600 carotenoid, 7000 flavonoid và hơn

500 anthocyanin đã được xác định

2

Nhóm sắc tố chính được xác định tại những bộ phận khác nhau của cây Flavonoids xuất hiện hầu hết ở các mô; carotenoid có mặt trong lá, rễ, hạt, quả và hoa Một vài sắc tố khác như anthocyanin hoặc diệp lục tố có ở những vị trí tế bào đặc biệt hoặc dưới mức tế bào Anthocyanin thường được tìm thấy trong tế bào biểu bì hoặc trong cánh hoa, trong khi diệp lục tố và carotenoid có trong lục lạp của tế bào quang hợp dưới biểu bì của lá Như anthocyanin, betalain tan trong nước và xuất hiện trong không bào

Tất cả các đặc điểm tạo nên vẻ đẹp của cây đã hấp dẫn các loài động vật, côn trùng, chim và dơi đến để tìm thức ăn Trong quá trình tương tác đó, chúng góp phần phát tán hạt phấn giúp cho quá trình thụ phấn Vì lý do đó, thực vật nổi bật với môi trường xung quanh để dễ nhận thấy ở khoảng cách xa, giúp cho quá trình thụ phấn trên không

Vì vậy, thực vật phát triển, trải qua quá trình tiến hóa đã tạo nên những nét đặc trưng (màu sắc, mùi hương) để giúp cho quá trình thụ phấn Thực vật xuất hiện đầu tiên vào kỷ Đại trung sinh, chỉ có màu kem và sau quá trình phát triển màu sắc nét hơn, tăng nồng độ của các sắc tố khác

Sắc tố mang đến màu sắc cho hoa thực vật hạt kín và thường phổ biến ở những cây có mạch Sắc tố được tạo ra bởi cấu trúc điện tử do sự tương tác giữa ánh sáng với chất màu trong mô thực vật Sắc tố đầu tiên xuất hiện trong cây là diệp lục tố và carotenoid, tích lũy trong lạp thể, và anthocyanin và betalain, bị hòa tan trong không bào Flavonoid và carotenoid tạo nên sắc tố ở thực vật Mỗi nhóm hợp chất màu trong hoa, quả và lá được thể hiện qua các màu sắc khác nhau như xanh, đỏ, tím, vàng và cam Những sắc tố khác nhau sẽ có khả năng hấp thụ ánh sáng khả kiến ở những bước sóng khác nhau Những loại sắc tố khác nhau được đánh dấu với cường độ hấp thu tối đa, đó là một đặc tính quan trọng đối với những sinh vật sống trong những môi trường ánh sáng khác nhau sẵn có Flavonoids, cùng với anthocyanins tạo ra một dãy màu sắc cho hoa và trái cây, bao gồm vàng, đỏ tương, đỏ, hồng, tím và xanh dương Carotenoids cung cấp cho hoa và trái cây những màu sắc riêng từ vàng tới đỏ, và là thành phần cần thiết cho sự quang hợp

Màu sắc của vài loại hoa, quả và lá là do sự kết hợp của các loại sắc tố khác nhau, thường tạo ra một cấu trúc phức tạp gọi là đồng sắc tố giúp cho màu sắc ổn định hơn

Diệp lục tố a, b

Carotene Xanthophyll Chalcone Flavonol Anthocyanin Betaxanthin Betacyanin

Cyanobacteria, tảo đỏ Tất cả thực vật quang hợp

Thực vật, vi khuẩn và một số loài giáp xác

Cây hạt trần và cây hạt kín

Xương rồng và một số loài nấm

Hơi xanh

Đỏ Xanh lá cây Vàng, cam đỏ

Kem, vàng nhạt, hồng, đỏ, xanh dương và đen Vàng, đỏ

1.2.1 Màu xanh lá – Chlorophylls

Sắc tố thực vật phổ biến nhất là chất diệp lục, có trong lá và các bộ phận tiếp xúc

với ánh sáng Diệp lục tố cùng với carotenoid được xác định trong lục lạp và có chức

năng hấp thụ năng lượng ánh sáng cần thiết cho hoạt động quang hợp Có hai loại diệp

4

lục tố trong thực vật bậc cao: diệp lục tố a và diệp lục tố b Số lượng diệp lục tố tùy thuộc

vào loại thực vật, điều kiện ánh sáng và sự có mặt của các chất khoáng như Mg Thông thường chlorophyll a có hàm lượng gấp 2-4 lần so với chlorophyll b mặc dù phổ của

acetone chiết từ cây bạc hà tươi, cây sả và cây tầm ma cho thấy tỉ lệ diệp lục tố a/b thay

đổi từ 3:1 trong cây xả và cây tầm ma đến 1:1 trong bạc hà Những loại cây ưa tối chứa ít

diệp lục tố a và diệp lục tố b hơn Thay thế Mg bởi các ion Fe sẽ tạo nên sản phẩm xám

nâu diệp lục tố, và sự hiện diện của ion Zn và Cu sẽ làm tăng sự ổn định của màu xanh lá cây tự nhiên

Các phân tử chlorophyll là một dẫn xuất của porphyrin, đó là một cái khung cho gồm bốn pyrrole vòng chứa một ion Mg ở trung tâm Sự hiện diện của Mg ở trung tâm phân tử diệp lục tố đóng vai trò quan trong trong việc hấp thu năng lượng ánh sáng, và vòng pyrrole tạo ra một cấu trúc với liên kết đơn và đôi, tạo điều kiện cho việc hấp thu

quang tử ánh sáng Phần đuôi của phân tử chứa 20 nguyên tử carbon được gắn vào

tetrapyrrole của chlorophyll Sự khác nhau về cấu trúc giữa diệp lục tố a và b là do sự

tham gia của những nhóm khác nhau gắn vào nguyên tử carbon thứ ba trong vòng pyrrole

II Diệp lục tố a có chứa nhóm CH3, trong khi diệp lục tố b chứa nhóm CHO Sự chuyển đổi từ diệp lục tố a thành diệp lục tố b có thể xảy ra trong lục lạp, là kết quả của hoạt động của CAO oxygenase mã hóa bởi các gen xác định được tìm thấy ở Arabidopsis

thaliana và Oryza sativa

Màu xanh của lá cây là do diệp lục tố có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng khả kiến, chủ yếu là dãy màu xanh (420-460 nm) và đỏ (650-700 nm), và phản xạ ánh sáng xanh (~550 nm) Tuy nhiên, nguyên nhân sinh lý của màu xanh thực vật vẫn chưa được biết đến hoàn toàn Người ta cho rằng màu xanh lá thích nghi tốt trong những điều kiện ánh sáng khác nhau – chiếm ưu thế trong môi trường sống Sự tồn tại của sắc tố xanh lá không chỉ do khả năng hấp thụ ánh sáng của diệp lục tố dưới các sự thay đổi các bức xạ và tối ưu việc sử dụng năng lượng ánh sáng trong vận chuyển quang điện tử, mà còn do khả năng tự bảo vệ lục lạp khỏi năng lượng ánh sáng dư thừa bằng cách phân ly

nó dưới dạng nhiệt hoặc huỳnh quang Do đó, màu xanh của thực vật là kết quả của các phản ứng phức tạp sinh tổng hợp diệp lục tố Phản ứng cuối cùng phụ thuộc ánh sáng

được xúc tác bởi NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase (POR) Trong Arabidopsis

thaliana, có ba dạng đồng phân của POR: POR A, POR B và POR C Trong những cây

con bị úa vàng, một lượng lớn oxidoreductase POR A, cũng như POR A mRNA được tích lũy Sau khi tiếp xúc với ánh sáng, mức độ POR giảm nhanh chóng do sự phân giải protein Sự phân giải protein nhanh chóng của các đồng phân này là lý do cây ưa râm

5

không có chứa diệp lục tố Đồng phân POR B chịu trách nhiệm tổng hợp diệp lục tố được

tìm thấy trong lúa mạch và Arabidopsis thaliana phát triển dưới ánh sáng

Trong A thaliana, 30 gen mã hóa enzyme tham gia vào việc tổng hợp diệp lục tố

đã được xác định Đột biến ở những gen này thường gây hại cho cây Diệp lục tố bị đột biến thường có màu xanh lá nhạt hơn, nhạy cảm với ánh sáng, là kết quả của việc sản xuất thừa protochlorophyllide Những đột biến đặc biệt có lợi trong việc tìm hiểu những quy tắc diệp lục tố tổng hợp và tương tác với sự phát triển của thực vật Đặc biệt quan tâm là đột biến trong gen mã hóa uroporphyrino-gen III decarboxylase Đột biến này có đặc điểm các vết hoại tử trên lá do tích lũy các phototoxic trung gian

1.2.2 Màu vàng, cam và đỏ - Carotenoid

Carotenoid là nhóm hợp chất hòa tan trong chất béo, được hình thành nhờ sự tham gia của tám đơn vị isoprenoid, là một nhóm lớn sắc tố terpenoid (hơn 600 hợp chất) được tìm thấy trong vi khuẩn quang hợp, tảo, nấm, tế bào thực vật bậc cao và động vật Các carotenoid được chia thành hai nhóm: cam-đỏ carotene, đó là các hydrocarbon chưa bão hòa; và vàng-cam xanthophyll, có chứa thêm oxy trong phân tử của chúng

Các màu vàng, cam và đỏ của carotenoid là do hệ thống liên hợp của liên kết đôi C-C Có ít nhất bảy liên kết đôi trong hệ liên hợp cần thiết để tác động và màu sắc Mở rộng hệ thống liên hợp cho màu đậm hơn

Trong thực vật bậc cao, chúng tham gia vào việc thu nhận ánh sáng cho quang hợp

và bảo vệ chống lại ánh sáng có cường độ cao, tham gia vào năng lượng và vận chuyển điện tử Trong phản ứng thu nhận ánh sáng, carotenoids hoạt động như sắc tố phụ và

chuyển năng lượng kích thích chodiệp lục tố b

Carotenoid cũng có mặt trong lục lạp, cho màu vàng-đỏ-cam Các sắc tố này xác định màu sắc của vài loại thực vật (hoa hồng và cúc vạn thọ), hoa quả (cà chua), rễ (carot) và hạt (ớt đỏ) Các màu sắc bất thường của một số carotenoid là do sự tương tác giữa một số carotenoid với apoprotein như astaxanthin với crustacyanin, cung cấp màu xanh của tôm hùm β-carotene và lycopene là những carotenoid phổ biến nhất ở thực vật, tạo màu sắc đặc trưng ở cà rốt, cà chua; Các đại diện của xanthophyll là zeaxanthin, violaxanthin và lutein Ngoài chức năng như một ăngten, một vài xanthophyll (vioxanthin, lutein) còn đóng vai trò tạo màu vàng của lá mùa thu (xanthos = yellow, phyll = leaf)

Carotenoid hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 400-500 nm Ngoài vai trò vận chuyển năng lượng đến diệp lục tố, carotenoid còn có chức năng chính trong việc bảo vệ lục lạp khỏi điều kiện ánh sáng cường độ cao

Một ứng dụng quan trọng của công nghệ sinh học là nâng cao giá trị dinh dưỡng của cây trồng bổ sung vào chế độ ăn uống Carotenoid là một phần quan trọng của chế độ

6

ăn uống bao gồm vitamin A và chất chống oxy hóa Một trong những biến đổi gen được xác định sớm nhất là tiền β-carotene, một tiền chất của vitamin A Những giống gạo biến đổi gen với các gen mã hóa phytoene synthase và lycopene β-cyclase được tạo ra từ

Narcissus pseudonarcissus và Erwinia uredovora đã được sản xuất Những dòng sản

phẩm β-carotene thể hiện sắc tố màu da cam của hạt gạo, dẫn đến cái tên “Golden Rice”

Carotenoid có mặt trong lá cây cùng với anthocyanin, cây thay đổi màu sắc nhanh chóng từ vàng, tím thể hiện quá trình trao đổi chất mạnh mẽ Đây là tín hiệu thu hút côn trùng và trong trường hợp đó giúp tiêu diệt các kí sinh trùng gây hại cho quá trình trao đổi chất

1.2.3 Màu đỏ, xanh dương và đỏ tía – Anthocyanin và Betalain

1.2.3.1 Flavonoid Flavonoids là những chất hóa học thuộc nhóm polyphenol, có bộ khung gồm 15 nguyên tử carbon tạo thành 2 vòng phenyl, A và B được nối bởi cầu 3 carbon

Có hơn 7000 dẫn xuất chứa cấu trúc này được tìm thấy Ở thực vật bậc cao, các hợp chất này được chia thành vài lớp khác nhau về số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trên vòng A và B, mức độ oxy hóa của vòng C và sự hiện diện của cấu trúc nhị phân tử là sự lặp lại cấu trúc C6-C3-C6 Flavonoid bao gồm anthocyanin, chalcone, aurone, flavone và flavonol Chúng hòa tan trong nước, nằm trong không bào như glycoconjugates, và hấp thụ dãy ánh sáng khả kiến từ 280-315 nm Flavonoid là những chất hóa sinh hoạt động với những chức năng khác nhau: chúng chịu trách nhiệm về màu sắc cánh hoa và quả, tạo

ra bộ lọc tia UV, là chất chống oxy hóa, có hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus Chúng kiểm soát gen mã hóa protein và tham gia vận chuyển auxin, là tín hiệu trực quan quan trọng thu hút sâu bọ và động vật thụ phấn Tên của nhiều anthocyanin phản ánh lịch sử của chúng Vào năm 1913, Willstatter và Everest đã xác định được sắc tố anthocyanin xanh đầu tiên trong cây hoa bắp, và từ đó cấu trúc của hơn 600 loại anthocyanin khác nhau cũng được xác định Vào đầu năm 1664, sắc tố tím trong cây hoa bướm thuộc anthocyanins được xác định, và được sử dụng như chỉ thị pH tự nhiên đầu tiên

Sự đa dạng của flavonoid và chức năng tạo màu sắc cho cây là một trong những nghiên cứu lâu đời nhất ở thực vật Anthocyanin là nhóm sắc tố flavonoid phổ biến nhất, thường tạo màu đỏ tươi, đỏ, xanh dương và tím cho cánh hoa, quả và thân cây, có trong biểu bì, tế bào dưới biểu bì, hòa tan trong không bào hoặc tích lũy trong các túi anthocyanoplast Anthocyanin bao gồm aglycone (anthocyanidin), đường, đôi khí có phenolic hoặc acid hữu cơ Có 20 loại aglycone được xác định và 18 loại có nguồn gốc tự nhiên Aglycones tự do rất hiếm ở thực vật, bởi vì thể glycosylated ổn định hơn Đường đặc trưng bởi một hoặc nhiều đơn vị glucose, rhamnose, galactose, arabinose, xylose hoặc acid glucuronic liên kết với aglycone ở các vị trí 3-OH, 5-OH hoặc 7-OH

7

Anthocyanin có thể bị acyl hóa bởi một hoặc nhiều phân tử phenolic acid như p-coumaric

acid, acid ferulic, cinnamic acid và caffeic acid hoặc aliphatic acid…

Anthocyanin là các glycoside có nhóm đường gắn với anthocyanidin Trong cấu trúc anthocyanins, 17 loại anthocyanidin đã được xác định, phổ biến nhất là cyaniding, delphinidin, pelargonidin, peonidin, malvidin và petunidin Màu sắc của anthocyanin chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, một trong số đó là số lượng nhóm hydroxyl và methoxyl Nếu có mặt nhiều nhóm OH sẽ có màu xanh, nhiều nhóm OCH3 sẽ tiến về màu đỏ Nét đặc trưng của nhóm sắc tố này là khả năng thay đổi màu sắc dưới ảnh hưởng của các nhân tố môi trường Ở pH acid, anthocyanin sẽ có màu đỏ và ở pH kiềm có màu xanh Màu của anthocyan còn phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại như Al, Fe và Mg Flavone thường có màu vàng nhạt hoặc màu kem, và có thể hấp thụ tia cực tím, vì thế, chúng có khả năng bảo vệ chống lại bức xạ tia cực tím

Việc áp dụng kính hiển vi điện tử trong nghiên cứu cánh hoa đã cho thấy sự hiện diện của các cầu cơ quan như anthocyanic vacuolar inclusions (AVIs) trong vài nhóm, ví

dụ như Lisianthius, Dianthus caryophyllus, Salvia, Antirrhinum, Eustoma và Delphinium

Những cấu trúc này được hình thành bởi các anthocyanin gắn với phức protein bởi liên kết hydro, và màu sắc đậm hơn, đặc biệt là trong vùng giàu AVIs

Nhiều gen liên quan đến việc sinh tổng hợp các anthocyanin khác nhau đã được

xác định Việc hoàn thiện bộ gen của Arabidopsis thaliana đã cho chúng ta biết thêm về

cơ chế điều hòa biểu hiện gen, điển hình là hoạt động ở tế bào biểu bì cánh hoa và có thể tác động lại các yếu tố môi trường như bước sóng và cường độ ánh sáng Tổng hợp anthocyanin cũng có thể do nhiều yếu tố stress khác như điều kiện lạnh, nhiệt độ cao, độ mặn và thiếu khoáng, đặc biệt là nitrogen và phosphorus, thường được biểu thị bởi màu tía của thân và lá Các yếu tố môi trường phổ biến ảnh hưởng đến màu sắc là pH đất Nó

có thể ảnh hưởng đến đến pH trong các ngăn tế bào và bằng cách này có thể thay đổi tích lũy subcellular của flavonoid hoặc các các chất cấu thành tế bào tương tác với sắc tố flavonoid Đột biến trong gen glucosyltransferase (GTs) đã làm thay đổi vị trí của flavonoid từ không bào đến tế bào chất, kết quả là hoa vàng Một sô gen điều hòa pH không bào cũng sinh tổng hợp anthocyan trong cây thuốc lá cảnh

Nghiên cứu về anthocyanin ở cây hai lá mầm đã chứng minh rằng màu sắc của cây liên quan đến hai mức điều hòa gen của tổng hợp flavonoid Đầu tiên bao gồm những gen

mã hóa enzyme liên quan đến bước đầu quá quá trình tổng hợp flavonoid: chalcone synthase (CHS) và chalcone isomerase (CHI) Thứ hai liên quan đến biểu hiện gen tham gia vào giai đoạn cuối của việc sản xuất anthocyan, như là DFR (dihydroflavonol reductase) hoặc LDOX/ANS (leucoanthocyanidyn dioxygenase/anthocyanidins synthase)

8

Đột biến của CHS trong cả cây bắp và cây thuốc lá cảnh đã sản xuất phấn hoa trắng thay vì vàng ở thực vật hoang dã Ví dụ như, trong trường hợp của DFR, các biến đổi gen sử dụng cấu trúc gen đảo cho sự sắp xếp các nucleotide ở giai đoạn sau để tổng hợp flavonoid đã thay đổi màu sắc của hoa từ trắng sang hồng ở cây thuốc lá cảnh và từ

đỏ sang hồng ở cây hoa đồng tiền Kỹ thuật di truyền đã tạo ra khả năng sử dụng những gen này để biến đổi các loài cây trồng, giống để thu được các loại màu sắc

1.2.3.2 Màu xanh dương Những người trồng cây cảnh đã tạo ra được giống hoa hồng xanh Trong chi này, màu xanh cánh hoa thì không có trong tự nhiên, các tế bào biểu bì cánh hoa của chúng không tích lũy delphinidin hoặc bất cứ dẫn xuất delphinidin nào, do thiếu một enzyme chìa khóa liên quan đến việc tổng hợp: flavonoid 3’,5’- hydroxylase Hoa hồng tích tụ một lượng lớn pelargonidin, cyanidin và carotenoid Ngoài ra pH trong các không bào của các tế bào biểu bì cánh hoa ở khoảng giữa 3.69 và 5.78 Tại pH thấp như vậy, anthocyanin có màu đỏ hoặc hồng Một chủng hoa hồng, “Rhapsody in Blue”, chứa một lượng nhỏ sắc tố xanh rosacyanin trong AVIs Sự thay đổi màu từ tía sang xanh tỉ lệ với

độ tuổi là do sự tích tụ ngày càng tăng của anthocyanin trong các túi như cấu trúc AVI Tuy nhiên, cơ chế phân tử của hiện tượng này vẫn chưa rõ ràng

Các nhà khoa học từ Florigen tại Öc đã chuyển gen mã hóa flavonoid hydroxylase enzyme, cần cho sự tổng hợp dẫn xuất delphinidin xanh, để trồng hoa hồng xanh và cẩm chướng xanh

Các anthocyan đầu tiên được tách ra từ thực vật là cyanidin, có nguồn gốc từ cánh hoa hoa bắp Sau đó, các sắc tố còn lại được xác định trong hoa hồng Sự khác biệt về sắc

tố giữa các loại hoa của hai loài được giải thích là do sự khác nhau của pH cánh hoa Các cấu trúc tinh thể của các sắc tố được tách ra từ hoa bắp cho thấy nó là một hợp chất phức tạp gồm 6 phân tử cyanidin liên kết với Fe3+ và Mg2+ và 6 flavone liên kết với Ca2+ Các siêu phân tử này được gọi là protocyanin

1.2.3.3 Betalains Nhóm betalain có khoảng 50 sắc tố đỏ gọi là betacyanin và 20 sắc tố vàng gọi là betaxanthin Tùy thuộc vào cấu trúc cộng hưởng, các sắc tố có thể có màu đỏ như trong betacyanin, hoặc màu vàng nhạt trong vulgaxanthin-1 Betacyanin được tìm thấy nhiều nhất là betanidin hoặc isobetanidin kết hợp với glucose, có thể bị acyl hóa

Các nhóm anthocyanin-flavonoid và betacyanin-betaxanthin không đồng thời có mặt trong cùng một cây, và do đó sự hiện diện của betalains không bao gồm sự hiện diện của anthocyanin và ngược lại Trong hầu hết các trường hợp không thể phân biệt anthocyanin và betalain bằng trực quan, nhưng các thí nghiệm đã có thể phân biệt ở pH

và nhiệt độ khác nhau

9

Betalain thay thế anthocyanin trong hầu hết các loài cẩm chướng Chúng cũng

được phát hiện trong nấm (Amanita, Hygrocybe) và xương rồng Cấu trúc betalain khác

nhau ở các chuỗi bên, có thể là các amino acid hoặc amine, và được chia thành hai nhóm: betaxanthin (màu vàng, ví dụ như indicaxanthin trong xương rồng) và betacyanin (đỏ đến

tím, ví dụ như amaranthin trong Amaranthus caudatus) Đôi khi chúng tạo phức hợp với tyrosine hoặc glycine (ví dụ như portulacaxanthin II và III được xác định trong Portulaca

grandifolia) Betalain, betanin và vulgaxanthin được tách từ củ cải đường Các loại nấm

chứa acid betalamic thay vì betacyanin, có ngồn gốc từ hợp chất musca-purpurin và musca-flavin

Các nhà nghiên cứu Tây Ban Nha đã thực hiện một quan sát thú vị trên Mirabilis

(Mirabilis jalapa), có cánh hoa phát huỳnh quang Những cánh hoa nở vào chiều tối để

thu hút côn trùng nhờ việc phát huỳnh quang Cánh hoa có chứa hai loại sắc tố: sắc tố phát huỳnh quang và sắc tố không phát huỳnh quang Một vài cánh hoa màu vàng, có betaxanthin và phát ra ánh sáng huỳnh quang xanh, một vài phần khác có chứa cả sắc tố betaxanthin vàng và betacyanin tím Các sắc tố màu tím hấp thụ ánh sáng xanh lá phát ra trong quá trình phát huỳnh quang Sự kết hợp của cả hai loại sắc tố tạo ra những hoa văn xanh lá để thu hút sâu bọ và dơi

Bảng 1.2 Các anthocyanidin phổ biến và màu sắc của chúng

Cam, đỏ

Đỏ tía, đỏ Xanh dương Màu tía, tím Màu hồng Màu tía, tím

Carotenoid đã được nghiên cứu một thời gian dài Vai trò quan trọng của carotenoid trong việc bảo vệ khỏi ánh sáng gây chết được tìm ra ở vi khuẩn quang

dưỡng, Rhodobacter sphaeroides, bởi Stanier và các cộng sự (Griffiths el al., 1955)

Vòng xanthophylls, được xác định sau đó bởi Yamamoto (1962) Những nghiên cứu gần đây đã làm rõ cơ chế chuyển hóa năng lượng và cơ chế bảo vệ bộ máy quang hợp,

và để xác định vai trò của gene và enzyme trong việc sinh tổng hợp lớp sắc tố quan trọng này

2.2 Tính chất

12

2.2.1 Tính chất vật lý

Carotenoid kết tinh ở dạng tinh thể hình kim, hình khối, lăng trụ đa diện, dạng lá hình thoi

Nhiệt độ nóng chảy cao : 130-2200ᵒC

Dung môi hòa tan khác nhau dẫn đến khả năng hấp thụ ánh sáng cũng khác nhau với cùng một loại Khả năng hấp thụ ánh sáng chỉ cần 1g cũng có thể thấy được bằng mắt thường

Bảng 2.1 Bước sóng hấp thụ mạnh nhất đối với một số carotenoid

Hợp chất Hệ nối đôi liên hợp Bước sóng, nm

A Ảnh hưởng của số lượng các nối đôi

Hợp chất 1,2-dihydro-1,1,6-trimethy naphthalene có thể tạo ra trong quá trình phân hủy neoxanthin và những carotenoid khác trong quá trình bảo quản rượu vang

13

2.3 Cấu trúc và chức năng

Carotenoid là một họ lớn (khoảng hơn 600 loại) của isoprenoid (bảng 2.1) Hầu hết là sự kết hợp của khung hydrocarbon C40 với cấu trúc khác Carotenoid giúp cho trái cây và hoa có màu sắc tươi sáng Màu sắc của từng loại carotenoid, thường là dãy phổ từ vàng đến đỏ, là do một loạt các liên kết đôi liên hợp Dãy màu sắc được

mở rộng bằng cách thay đổi cấu trúc chuỗi polyene Tương tác của một số carotenoid với apoprotein, như astaxanthin với protein crustacyanin từ những động vật có vỏ, có thể tạo ra màu xanh mà sư thay đổi trở lại màu đỏ trong suốt quá trình nấu là do protein bị biến tính

Nhóm kết thúc của khung carotenoid có thể thẳng hoặc vòng, các nhóm kết thúc phổ biến là vòng β-ionone của β-carotene và dẫn xuất của nó Carotenoid với nhóm β-ionone là tiền chất của vitamin A và do đó là thành phần chủ yếu trong bữa ăn Những vòng cuối mạch khác là vòng ε, phổ biến trong cây, và vòng cyclopentane của capsanthin và capsorubin đã đem đến màu đỏ đặc trưng của ớt

Carotenoid có hai nhóm chính là carotene và xanthophyll – dẫn xuất dạng oxy hóa của carotene

14

Hình 2.1 Sự đa dạng của carotenoid

15

- Carotene – C40H56 là một carburdihydro chưa bão hòa, không tan trong nước mà chỉ tan trong các dung môi hữu cơ Công thức cấu tạo gồm một mạch carbon dài gồm 8 gốc isoprene và hai đầu là một hoặc hai vòng ionon Trong thực vật thường có 3 loại carotene : alpha, beta và gama carotene Cắt đôi phân tử beta carotene ta được hai phân tử vitamin A Bước sóng hấp thu cực đại của carotene ở 446-467 nm

- Xanthophyll – C40H56On ( n: 1-6) là dẫn xuất (dạng oxy hóa) của carotene

Vì oxy từ 1 đến 6 nến có nhiều loại xanthophylls : cripthoxanthin (C40H56O), lutein (C40H56O2), violaxanthin (C40H56O4) Các nguyên tử oxy liên kết trong các nhóm : hydroxyl, carboxyl, acetoxyl, metoxyl, epoxyl, Bước sóng hấp thu cực đại của xanthophyll ở 451-481 nm

Dinh dưỡng Thiếu vitamin A là nguyên nhân của một số rối loạn, khả năng sử dụng sắt kém, chậm phát triển và bị mù, làm suy yếu miễn dịch và tăng tính nhạy cảm sẽ dẫn đến lây nhiễm bệnh Hơn 100 triệu trẻ em thiếu vitamin A Thức ăn carotenoid, như α-carotene và β-carotene, có thể được tách từ động vật có vú để tạo thành một hoặc hai phân tử của 11-cis-retinal (vitamin A) tương ứng, và được gọi là tiền vitamin A

Việc thụ phấn và biến đổi gen nhằm tăng lượng tiền vitamin A Phần thịt màu cam trong khoai tây được thích nghi với những điều kiện chung bởi phương pháp nuôi truyền thống, và được giới thiệu đến Kenya như một nguồn mới của β-carotene Có nhiều ví dụ về biến thể của carotenoid, nhưng nổi tiếng nhất là “Golden Rice”, được

bắt đầu thiết kế để giải quyết vấn đề thiếu vitamin A ở các nước đang phát triển PSY

từ hoa thủy tiên vàng (Narcissus pseudonarcissus) và vi khuẩn PDS, crtI, từ Erwinia

uredorva, nhằm mục tiêu nội nhũ hóa gạo, bởi vì hạt eleurone bên ngoài sẽ bị loại bỏ

trong quá trình xay Kể từ đó, dòng lúa vàng ưu tú T3 trong Indica và Japonica được sản xuất Phosphomannose isomerase được sử dụng như một điểm chọn đánh dấu để ngăn ngừa các biến chứng của việc lựa chọn kháng kháng sinh Những dòng ưu tú hiện nay sẵn sàng cho việc đánh giá rủi ro và dinh dưỡng và thuần hóa giống cho địa phương

Có lẽ ví dụ ấn tượng nhất của việc vận dụng carotenoid được thực hiện trên cây

cải dầu (Brassica napus) Ngoài gen crtB của vi khuẩn PSY trong một hạt giống cụ

thể, thể hạt chịu trách nhiệm sản xuất carotenoid tăng 50 lần Sự tích lũy carotenoid thường có ảnh hưởng không mong muốn đến các quá trình khác của tế bào Đồng thời với việc tăng α- và β-carotene, tocopherol và chất diệp lục giảm, thành phần acid béo

16

thay đổi Để carotenoid tích lũy đến mức cao, cần có một vùng thích hợp Trong trường hợp này, các phân tử kị nước có thể được cô lập trong các túi của tế bào hoặc các giọt lipid trong thể hạt

Hai loại carotenoid, lutein và zeaxanthin, quan trọng trong việc bảo vệ cây khỏi ánh sáng và có tác dụng chống mù lòa do thoái hóa điểm vàng ở người Thoái hóa điểm vàng là nguyên nhân chính gây nên mù lòa ở các nước phát triển Điều này là do

sự suy giảm chức năng của điểm vàng, một phần nhỏ của võng mạc được tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng Điểm vàng được tích tụ zeaxanthin và lutein ở mức cao, có mức tương quan thấp với sự thoái hóa điểm vàng Do đó, có một số phương pháp tiếp cận công nghệ sinh học đang được triển khai để sản xuất nhóm thực phẩm có zeaxanthin và lutein có tỉ lệ cao Ví dụ, đột biến của một loại tảo xanh đơn bào chịu

mặn, Dunaliella salina, làm cho khả năng tích lũy của zeaxanthin như xanthophyll ban đầu Trong trường hợp này, Dunaliella được nuôi để thu β-carotene của các sản

phẩm công nghiệp tự nhiên tại Australia và Israel Khoai tây thường tích tụ lutein và violaxanthin, được biến đổi gen để tích tụ zeaxanthin Antisense và đồng kiềm hãm của zeaxanthin epoxidase khoai tây tăng lượng zeaxanthin 4-130 lần

Astaxanthin là một chất chống oxy hóa mạnh mẽ, và vì thế là thành phần quan trọng trong chế độ ăn uống của con người Tuy nhiên, giá trị chính của astaxanthin là chất bổ sung thức ăn nuôi trồng thủy sản vì cho màu hồng đặc trưng của cá hồi Astaxanthin được sản xuất bởi một số lượng hạn chế sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn biển, nấm men và một số tảo xanh Đối với mục đích thương mại, thường được tổng hợp hóa học Hoa của cây thuốc lá sản xuất ra astaxanthin nhờ gen β-carotene

ketolase (CrtO) của Haematococcus pluvialis Việc bổ sung phương pháp tiếp cận

công nghệ sinh học sử dụng tảo biển và các cây trồng khác đang được triển khai ở một số tổ chức

Việc sản xuất các carotenoid mới được thực hiện bởi các phát kiến gần đây

Carotenoid mới được sản xuất trong Escherichia coli nhờ phân tử “breeding” của vi khuẩn PDS (crtI) và gen β-cyclase (crtY) Sự xáo trộn ngẫu nhiên của hai gen cho

phép sản xuất ra các hợp chất màu khác nhau, bao gồm sự phối trộn các hợp chất 3,4,3’,4’-tetra-dehydro-lycopene, mặc dù không có cấu trúc không gian ba chiều và bị thiếu thông tin về cơ chế xúc tác của enzyme Người ta cũng lần đầu tiên sản xuất ra

carotenoid vòng đơn và torulene từ E coli Torulene không chỉ được sản xuất bởi sinh

vật mới, mà còn bởi một con đường trao đổi chất hoàn toàn mới, khác với cơ chế tìm thấy trong tự nhiên Một nguyên tắc tương tự đã được sử dụng trong một số trường

17

hợp để tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính sinh học và sản xuất các carotenoid khó tổng hợp hay tách chiết

Bảng 2.2 Tên hệ thống của carotenoid

2.4 Sinh tổng hợp và điều khiển

2.4.1 Sinh tổng hợp carotenoid và lạp thể

Enzyme carotenoid không bền trong điều kiện in vitro, phương pháp tiếp cận

nhiễu sinh hóa để hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp carotenoid Do đó, việc giải thích về con đường sinh tổng hợp carotenoid dựa vào con đường di truyền phân tử, và chỉ áp dụng từ năm 1990 rằng sinh tổng hợp carotenoid được mô tả ở mức phân tử

Nhìn chung, việc tăng tích lũy carotenoid, có trong trái cây chín, sự phát triển của hoa xảy ra đồng thời với việc tăng nhiều bản sao của một số bước quan trọng trong con đường này Ví dụ, sự khác biệt trong hoa cúc vạn thọ ở mức độ bản sao của hầu hết gen carotenoid được cho rằng sự phiên mã mRNA hoặc sự ổn định chịu trách nhiệm cho sự khác biệt đáng kể ( lên đến 100 lần ) trong tích lũy carotenoid giữa các giống cây trồng

Tuy nhiên, hiếm có thông tin về cơ chế tích lũy carotenoid trong các mô quang hợp, và hạt giống nảy mầm Không có đơn chất cấu thành của con đường tín hiệu được xác định, nhưng con đường này được quy định chặt chẽ trong suốt quá trình phát triển và đáp ứng với các kích thích của môi trường và tỉ lệ của các xanthophyll khác nhau gây ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại của thực vật và bảo vệ bộ máy quang hợp Để tránh thiệt hại oxy hóa, tổng hợp carotenoid và các chất diệp lục phải được cân bằng chính xác để đáp ứng nhu cầu quang hợp của các điều kiện phát triển khác nhau của thực vật trong ngày và theo mùa

Gen sinh tổng hợp carotenoid ở tảo xanh H pluvialis nhạy cảm với các tác nhân oxy hóa khử, sản xuất ra astaxanthin giá trị cao Bản sao phổ biến của βLCY, PSY,

PDS và βOH tăng cường đáp ứng với sự gia tăng cường độ ánh sáng, một xu hướng

đã được loại trừ bằng việc áp dụng DCMU (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea; oxy hóa plastoquinone) và làm xấu đi khi xử lý DBMIB (2,5-dibromo-6-isopropyl-3-methyl-1,4-benzoquinone; giảm plastoquinone)

Tín hiệu hạt nhân plastid là chủ đề được quan tâm gần đây, chủ yếu tập trung vào

bộ gen-uncouple A thaliana đột biến Magnesium protoporphyrin IX (MP), một tiền

chất của chlorophyll, liên quan đến trường hợp nhất định của tín hiệu hạt nhân Sự tích lũy MP đủ để điều khiển biểu hiện của nhiều gen trong việc đáp ứng norflurazon-gây stress quang oxy hóa Mức độ để carotenoid biểu hiện gen được quy định bởi tín