Định Danh hệ vi sinh vật trong hạt Kefir bằng phương pháp sinh học phân tử hiện đại và ứng dụng

Mục tiêu của đồ án là “Định danh hệ vi sinh vật trong hạt kefir bằng phươngpháp sinh học phân tử hiện đại và ứng dụng”, gồm các nội dung sau: Định danh hệ vi khuẩn và nấm men trong hạt kefir bằng phương pháp sinh họcphân tử hiện đại. Kỹ thuật cố định hệ vi sinh vật trong hạt kefir và ứng dụng. Ứng dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir để lên men thức uống có cồn từ whey. Tìm hiểu một số ứng dụng khác của hạt kefir.

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN MÔN HỌC

ĐỊNH DANH HỆ VI SINH VẬT TRONG

HẠT KEFIR BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ HIỆN ĐẠI VÀ ỨNG DỤNG

GVHD: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH: NGUYỄN NGỌC DUY

TỐNG THÀNH TRUNG

Tp Hồ Chí Minh, 06/2011

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN KEFIR VÀ HẠT KEFIR 3

1.1 Giới thiệu kefir 3

1.2 Công dụng của sản phẩm kefir 5

1.2.1 Giá trị dinh dưỡng 5

1.2.2 Sản phẩm probiotic tự nhiên 7

1.2.3 Thực phẩm chức năng 8

1.3 Hạt kefir 9

1.3.1 Đặc điểm 9

1.3.2 Hệ vi sinh vật trong hạt kefir 12

1.3.3 Kefiran 19

1.3.4 Bảo quản hạt kefir 23

1.4 Quá trình lên men kefir 27

1.4.1 Bản chất của quá trình lên men 27

1.4.2 Cơ sở của quá trình lên men 28

1.4.3 Quy trình công nghệ sản xuất kefir 39

CHƯƠNG 2 ĐỊNH DANH HỆ VI SINH VẬT TRONG HẠT KEFIR BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ HIỆN ĐẠI 53

2.1 Nghiên cứu hệ vi khuẩn lactic trong hạt kefir bằng phương pháp nuôi cấy tự do và phụ thuộc môi trường 53

2.1.1 Nguyên liệu và phương pháp 55

2.1.2 Kết quả và bàn luận 59

2.1.3 Kết luận 69

2.2 Định danh nấm men và tỷ lệ phân bố của chúng trong hạt kefir Đài Loan 69

2.2.1 Nguyên liệu và phương pháp 70

2.2.2 Kết quả và bàn luận 73

CHƯƠNG 3 KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH HỆ VI SINH VẬT TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG 80

3.1 Giới thiệu kỹ thuật cố định vi sinh vật trong công nghiệp chế biến các sản phẩm từ sữa 80

3.1.1 Các kỹ thuật cố định vi sinh vật trong công nghiệp chế biến các sản phẩm từ sữa 81

3.1.2 Một số ứng dụng phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong công nghiệp chế biến các sản phẩm từ sữa 82

3.1.3 Quá trình lên men sơ bộ sử dụng giống cố định 83

3.2 Các tính chất vi sinh và hóa học của sản phẩm kefir sản xuất bởi hệ vi sinh vật cố định được phân lập từ hạt kefir 85

3.2.1 Nguyên liệu và phương pháp 86

3.2.2 Kết quả và bàn luận 89

3.2.3 Kết luận 102

3.3 Quá trình lên men whey liên tục sử dụng giống kefir cố định trên chất mang cellulose khử lignin (DC) 102

3.3.1 Nguyên liệu và phương pháp 103

3.3.2 Kết quả và bàn luận 106

3.3.3 Kết luận 110

CHƯƠNG 4 ỨNG DỤNG HỆ VI SINH VẬT TRONG HẠT KEFIR TRONG LÊN MEN THỨC UỐNG CÓ CỒN TỪ WHEY 112

4.1 Dịch whey và quá trình lên men cồn từ dịch whey 112

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp lên men khác nhau để sản xuất thức uống lên men từ whey sử dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir 114

4.2.1 Khảo sát các phương pháp khác nhau để sản xuất thức uống lên men từ whey sử dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir 114

4.2.2 Đánh giá cảm quan các sản phẩm lên men whey bởi các phương pháp khác nhau 121

4.3 So sánh sản phẩm lên men bởi sinh khối kefir dạng viên và sinh khối kefir thu nhận từ môi trường tổng hợp 122

4.4 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung mật rỉ đường và dịch chiết nho đen lên sản phẩm lên men whey sử dụng hệ vi sinh vật từ hạt kefir 124

4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung mật rỉ lên quá trình lên men 124

4.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nho đen lên quá trình lên men 131

4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên quá trình lên men hỗn hợp whey - mật rỉ 133 4.5 Tối ưu quá trình lên men cồn từ whey sử dụng sinh khối ướt kefir ở quy mô công nghiệp 136

4.5.1 Tối ưu ở quy mô công nghiệp 136

4.5.2 Kết luận 142

CHƯƠNG 5 TÌM HIỂU MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC CỦA HẠT KEFIR 143

5.1 Dòng sản phẩm kefir bổ sung trái cây 143

5.2 Sử dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir lên men các nguồn nguyên liệu khác nhau 145

5.3 Sử dụng hạt kefir như nấm men để sản xuất bánh mì 148

5.4 Bacteriocin 150

5.5 Ứng dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir để sản xuất protein đơn bào (SCP) 151

5.6 Ứng dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir trong sản xuất phô mai 153

5.7 Sản xuất các chế phẩm giống sử dụng để lên men kefir ở quy mô công nghiệp 156

KẾT LUẬN 158

TÀI LIỆU THAM KHẢO 160

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần của sản phẩm kefir 4

Bảng 1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir 9

Bảng 1.3 Số lượng vi sinh vật (log cfu/g) trong hạt kefir, dịch hoạt hóa và kefir 11

Bảng 1.4 Trình bày tóm lược hệ vi sinh vật thường phân lập được trên hạt kefir có nguồn gốc khác nhau. 15

Bảng 1.5 Hàm lượng các chất trong sữa bò nguyên liệu ở nhiệt độ 25 o C 41

Bảng 1.6 Một số chế độ thanh trùng trong công nghiệp chế biến sữa 46

Bảng 2.1 Các giống vi khuẩn được sử dụng như các mẫu chuẩn cho phản ứng PCR-DGGE 57

Bảng 2.2 Trình tự 16S rDNA của các loài LAB được phân lập từ 3 loại hạt kefir 67

Bảng 2.3 Kết quả định danh các giống nấm men phân lập từ hạt bằng phương pháp hóa sinh và thông tin giải trình tự 26S rDNA các sản phẩm PCR 77

Bảng 3.1 Cố định các vi khuẩn lactic bằng một số chất mang 82

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các chu kỳ lên men đến sự phân bố (%) của vi khuẩn lactic và nấm men trong kefir 99

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các chu kỳ lên men đến các tính chất hóa học của kefir sản xuất bằng giống kefir cố định và bằng hạt kefir 101

Bảng 3.4 Các thông số động học trong quá trình lên men whey liên tục whey sử dụng chất mang DC cố định hệ vi sinh vật trong hạt kefir ở 2 nhiệt độ khác nhau trước và sau quá trình bảo quản lạnh (4ºC, 18 ngày) 108

Bảng 3.5 Các hợp chất thơm trong quá trình lên men whey liên tục sử dụng giống kefir cố định trên chất mang DC ở 2 nhiệt độ khác nhau trước và sau quá trình bảo quản ở 4ºC trong 18 ngày 110

Bảng 4.1 Hàm lượng đường sót và nồng độ cồn của các sản phẩm lên men bằng các phương pháp khác nhau 118

Bảng 4.2 Động học của 20 mẻ lên men whey lặp lại 126

Bảng 4.3 Động học của quá trình lên men hỗn hợp whey – mật rỉ đường ở các nồng độ ban đầu khác nhau 128

Bảng 4.4 Các yếu tố động học của dịch whey-mật rỉ đường sử dụng sinh khối hạt kefir dạng viên khi bổ sung mật rỉ đường vào quá trình lên men whey ở 30ºC 131

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của dịch chiết nho đen và nho trắng lên các yếu tố động học của quá trình lên men whey sử dụng sinh khối kefir dạng viên ở 30ºC 132

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các nồng độ dịch chiết nho đen khác nhau lên động học quá trình lên men whey sử dụng sinh khối kefir dạng viên 134

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên các yếu tố động học của các mẻ lên men whey có bổ sung 1% dịch

chiết nho đen sử dụng sinh khối kefir dạng viên 135

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của pH lên các yếu tố động học của các mẻ lên men whey có bổ sung 1% dịch chiết nho đen sử dụng sinh khối kefir dạng viên 135

Bảng 4.9 Động học của quá trình lên men whey ở quy mô lớn 141

Bảng 5.1 So sánh thành phần dinh dưỡng giữa sữa đậu nành và sữa bò 147

Bảng 5.2 Ảnh hưởng của việc sử dụng giống vi sinh vật lên các hợp chất thơm 155

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Núi Elbrus ở rặng núi Caucasus - nơi xuất phát của kefir và yoghurt 3

Hình 1.2 Hạt kefir 10

Hình 1.3 Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét 11

Hình 1.4 Đặc điểm hình thái của một số hạt kefir 12

Hình 1.5 Quan sát bên ngoài và bên trong hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét 14

Hình 1.6 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy mối quan hệ cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn trong hạt kefir 17

Hình 1.7 Sự tổng hợp EPS trong hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét 20

Hình 1.8 Cấu trúc của kefiran 22

Hình 1.9 Bảo quản lạnh 25

Hình 1.10 Bảo quản trong nitơ lỏng 26

Hình 1.11 Bảo quản đông khô 27

Hình 1.12 Con đường lên men đồng hình và dị hình ở vi khuẩn lactic 29

Hình 1.13 Lên men lactic đồng hình bằng con đường Embden-Meyerhoff 30

Hình 1.14 Con đường phosphoketolase của vi khuẩn lactic dị hình 31

Hình 1.15 Cơ chế vận chuyển đường lactose sử dụng cho quá trình lên men lactic ở vi khuẩn lacti 32

Hình 1.16 Một số vi khuẩn lactic đồng hình trong hạt kefir 33

Hình 1.17 Vi khuẩn lactic dị hình trong hạt kefir 34

Hình 1.18 Sinh tổng hợp các chất tạo hương từ citrate 35

Hình 1.19 Sinh tổng hợp acetaldehyde ở một số vi khuẩn lactic ưa nhiệt 36

Hình 1.20 Cơ chế quá trình lên men ethanol 38

Hình 1.21 Sơ đồ nguyên lý hiệu chỉnh chất béo 43

Hình 1.22 Sơ đồ quá trình nhân giống vi sinh vật trong sản xuất kefir 47

Hình 1.23 Các quá trình nhân giống hạt kefir 49

Hình 1.24 Quy trình chuẩn bị giống sản xuất kefir trong công nghiệp 50

Hình 2.1 Kết quả DGGE của giống LAB với gradient biến tính từ 30% đến 55% 61

Hình 2.2 Kết quả phân lập các vi khuẩn từ hạt kefir Hisinchu ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 64

Hình 2.3 Phân loại vi khuẩn lactic dựa trên PCR-DGGE phân lập từ hạt kefir Mongolia và hạt kefir Ilan 66

Hình 2.4 Phân tích DGGE các đoạn khuếch đại PCR thu được từ các hạt kefir 68

Hình 2.5 Kết quả định danh hệ nấm men trong hạt kefir bằng phương pháp PCR-DGGE 73 Hình 2.6 Kết quả điện di trên gel gradient biến tính của sản phẩm PCR các nấm men phân lập từ hạt kefir bằng phương pháp nuôi cấy phụ thuộc môi trường và sản phẩm PCR để định danh theo phương pháp nuôi cấy tự do 74 Hình 2.7 Kết quả DGGE các giống chuẩn nghiên cứu và các giống vi sinh vật phân lập từ hạt kefir 76 Hình 3.1 Sơ đồ thiết bị quá trình nuôi cấy và lên men sơ bộ vận hành liên tục sử dụng giống cố định 84 Hình 3.2 Ảnh hưởng của số chu kỳ lên men lên hạt gel cố định vi khuẩn lactic dưới kính hiển vi điện tử quét 91 Hình 3.3 Ảnh hưởng của số chu kỳ lên men lên hạt gel cố định nấm men dưới kính hiển vi điện tử quét 93 Hình 3.4 Ảnh hưởng của số chu kỳ lên men lên hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét 95 Hình 3.5 Ảnh hưởng của số chu kỳ lên men lên số lượng các vi khuẩn lactic và các nấm men trong kefir được sản xuất bởi giống cố định hoặc từ hạt kefir 97 Hình 3.6 Sự ổn định của quá trình vận hành thiết bị lên men dựa trên mối tương quan giữa vận tốc dòng chảy và nhiệt độ trước và sau quá trình bảo quản lạnh (4ºC, 18 ngày) 103 Hình 4.1 Cấu trúc α-lactalbumin và β-lactoglobulin 112 Hình 4.2 Động học của quá trình lên men sử dụng các phương pháp khác nhau 117 Hình 4.3 Ảnh hưởng của pH kết thúc quá trình lên men lên tỷ lệ ethanol, ethyl acetate và amyl ancohol

119

Hình 4.4 Động học của qua trình lên men whey và hỗn hợp whey-fructose lên men bởi sinh khối kefir dạng viên 120 Hình 4.5 Kết quả phép thử phân biệt 121 Hình 4.6 Kết quả phép thử thị hiếu 122 Hình 4.7 So sánh động học của quá trình lên men sử dụng sinh khối kefir dạng viên và sinh khối kefir thu nhận từ môi trường tổng hợp 123 Hình 4.8 Động học của 20 mẻ lên men whey lặp lại 127 Hình 4.9 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô ban đầu lên quá trình lên men hỗn hợp whey – mật rỉ đường 129 Hình 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan ban đầu của hỗn hợp whey-mật rỉ đường lên men bởi sinh khối kefir dạng viên lên tỷ lệ các hợp chất thơm quan trọng 130 Hình 4.11 Ảnh hưởng của dịch chiết nho đen và nho trắng lên động học quá trình lên men cồn từ whey sử dụng sinh khối kefir dạng viên 132 Hình 4.12 Bioreactor 100 L và 11000 L 137 Hình 4.13 Bioreactor 3000 L 138

Hình 4.15 So sánh động học quá trình lên men whey ở các thể tích khác nhau 142 Hình 5.1 Sản phẩm kefir của Vinamilk 143 Hình 5.2 Các dòng sản phẩm kefir bổ sung trái cây trên thế giới 144 Hình 5.3 Sự phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men trên các môi trường sữa bò và sữa đậu nành 148 Hình 5.4 Mặt cắt ngang của phô mai không lên men, phô mai có bổ sung 1 g/L chế phẩm kefir nhiệt khô dạng tự do và phô mai có bổ sung 1 g/L chế phẩm kefir nhiệt khô cố định trên casein 155

MỞ ĐẦU

Kefir là thức uống lên men từ sữa có nguồn gốc ở Đông Âu Sản phẩm có truyền thống lâu đời này được đánh giá là một sản phẩm có hoạt tính probiotic cao Kefir khác với các sản phẩm lên men khác ở chỗ nó được lên men bởi một hệ vi sinh vật cộng sinh bao gồm

vi khuẩn lactic, nấm men và đôi khi có cả vi khuẩn acetobacter gắn với nhau trong phức

hệ protein và polysaccharide gọi là hạt kefir

Hệ vi sinh vật trong hạt kefir rất đa dạng và phong phú Để hiểu biết rõ hơn về quá trình lên men, cơ chế hình thành hạt và đánh giá các ích lợi về mặt sức khỏe của sản phẩm kefir, nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành định danh hệ vi khuẩn và nấm men trong hạt Đồng thời, việc phân lập và định danh hệ vi sinh vật trong hạt kefir cũng nhằm ứng dụng các vi sinh vật này trong nhiều lĩnh vực sản xuất khác nhau Ngay nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, các quy trình định danh hiện đại đã được áp dụng nhằm xác định chính xác hơn các vi sinh vật trong các quần thể như hạt kefir

Hạt kefir giúp cho hệ vi sinh vật giữ được mối quan hệ cộng sinh để nhằm tạo ra các hợp chất thơm đặc trưng cho sản phẩm Đồng thời các chất polysaccharide hình thành trong hạt gọi là kefiran cũng tham gia vào việc tạo cấu trúc sản phẩm Hạt kefir tuy có độ bền cơ học tương đối cao nhưng lại rất dễ bị tác động bởi các điều kiện sản xuất công nghiệp, đặc biệt là tác động khuấy đảo và quá trình rửa hạt Bên cạnh đó, việc tăng sinh số lượng hạt lớn để đưa vào sản xuất kefir ở quy mô công nghiệp lại gặp khá nhiều trở ngại như vấn đề tạp nhiễm, chi phí kinh tế, và sự ổn định của nguồn giống Chính vì vậy, sản phẩm kefir công nghiệp hiện nay thường được sản xuất bằng cách sử dụng các chế phẩm giống vi sinh vật tự do Tuy nhiên, việc sử dụng các chế phẩm giống này lại làm cho sản phẩm sản xuất ra không có các phẩm chất đặc trưng như kefir truyền thống, là do chúng không giữ được mối quan hệ cộng sinh giữa hệ vi sinh vật trong quá trình lên men Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật cố định vi sinh vật và ứng dụng thành công các chế phẩm cố định trong sản xuất thực phẩm, vấn đề nghiên cứu tái tạo hạt kefir để có thể tiến hành lên men liên tục đồng thời tạo ra các sản phẩm có chất lượng tương tự sản phẩm kefir truyền thống đã được đặt ra

Trong khi đó, whey là một sản phẩm phụ của quy trình sản xuất phô mai nhưng lại chiếm khoảng 85÷90% thể tích sữa và chứa 55% thành phần dinh dưỡng của sữa Whey

có chứa một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, là chất thải có BOD và COD cao Vào những năm trước đây, whey là chất thải của ngành công nghiệp sản xuất phô mai, gây ra những vấn đề ô nhiễm môi trường hết sức nghiêm trọng Mỗi năm, ngành công nghiệp phô mai

và casein thải ra 130 triệu tấn whey Do những áp lực về vấn đề môi trường lên ngành công nghiệp sữa, đồng thời hàm lượng lactose và các chất dinh dưỡng còn lại trong whey khá cao; người ta đã bắt đầu nghiên cứu việc xử lý nguồn chất thải này theo những hướng khác nhau Chính vì nhận thấy hệ vi sinh vật trong hạt kefir có những nấm men có khả năng lên men lactose, người ta đã chú ý đến hướng phát triển các sản phẩm xử lý dịch whey sử dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir như: sản xuất cồn nhiên liệu, cồn thực phẩm, thức uống lên men từ whey, sản xuất protein đơn bào… Trong đó, sản phẩm thức uống lên men từ whey có độ cồn thấp đang được chú trọng

Vì vậy, mục tiêu của đồ án là “Định danh hệ vi sinh vật trong hạt kefir bằng phương pháp sinh học phân tử hiện đại và ứng dụng”, gồm các nội dung sau:

 Định danh hệ vi khuẩn và nấm men trong hạt kefir bằng phương pháp sinh học phân tử hiện đại

 Kỹ thuật cố định hệ vi sinh vật trong hạt kefir và ứng dụng

 Ứng dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir để lên men thức uống có cồn từ whey

 Tìm hiểu một số ứng dụng khác của hạt kefir

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN KEFIR VÀ HẠT KEFIR 1.1 Giới thiệu kefir

Cách đây hàng nghìn năm, kefir được biết đến như một thứ nấm dùng chữa bệnh, nó xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng Đây là loại nấm vi khuẩn có thể làm biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men được chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ Dân miền núi Caucasus thuộc nước Xô Viết cũ - nguyên quán của kefir - đã bào chế nó từ sữa của các sinh vật khác nhau và kefir được lên men tự nhiên trong những túi da thú, theo các bộ tộc người ở đây họ xem kefir như là quà tặng của đấng Allah, như nguồn tài sản của gia đình và của bộ tộc, họ tiêu thụ kefir từ thuở ấu thơ và cứ như vậy duy trì từ thế hệ này đến thế hệ khác Họ không hề biết đến bệnh ung thư, bệnh lao, bệnh dạ dày… và họ thọ đến trung bình là 110 tuổi Núi Caucasus

là vùng duy nhất trên địa cầu mà người ta đạt sức khoẻ hoàn toàn ở độ tuổi này Từ rất sớm các bác sĩ Nga đã rất tin tưởng rằng kefir có lợi cho sức khoẻ và có khả năng chữa bệnh [27]

Hình 1.1 Núi Elbrus ở rặng núi Caucasus - nơi xuất phát của kefir và yoghurt [27]

Sản phẩm kefir thương mại đầu tiên được sản xuất từ sữa bò Tuy nhiên, kefir cũng được làm từ các loại sữa khác như cừu, dê, trâu Gần đây, người ta còn sản xuất kefir từ sữa đậu nành [23] Ngoài ra còn dòng sản phẩm kefir có vị ngọt được lên men với nước trái cây

Sản phẩm kefir được những người dân tộc Moslem ở Caucasian xem như một loại thuốc

có thể chữa rất nhiều loại bệnh vào khoảng thế kỉ 18

Kefir cũng được sản xuất dưới những tên gọi khác nhau bao gồm kephir, kiaphur, kefyr, kéfer, képhir, knopon, kepi và kippe [24]

Quá trình sản xuất kefir thủ công được mở rộng ở nhiều nước như Argentina, Đài Loan,

Bồ Đào Nha, Thỗ Nhĩ Kỳ và Pháp Người ta không xác định được rằng tất cả các hạt kefir

có nguồn gốc từ một hạt ban đầu hay không, bởi vì các phân tích vi sinh của các mẫu từ những khu vực khác nhau cho thấy thành phần vi sinh vật khác nhau

FAO/WHO (2001) đã đưa ra định nghĩa của kefir dựa trên hai yếu tố: thành phần vi sinh vật trong hạt kefir và trong sản phẩm cuối cùng Giống được chuẩn bị từ hạt kefir, bao

gồm Lactobacillus kefiri và các loài khác nhau của giống Leuconostoc, Lactococcus và Acetobacter phát triển trong một mối quan hệ chặt chẽ và đặc trưng Hạt kefir cũng bao gồm nấm men lên men lactose (Kluyveromyces marxianus) và nấm men không lên men lactose (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporus, Saccharomyces exiguus)

Không yêu cầu

Tối thiểu 107

Tối thiểu 104

[23]

Hiện tại kefir là một trong những loại sữa lên men rất được yêu thích ở Nga Ngoài ra kefir cũng đang được sản xuất một số lượng lớn ở Tiệp Khắc, Phần Lan, Hungary, Na Uy,

Hà Lan, Thụy Điển, Thụy Sĩ, Đan Mạch, Mĩ, Pháp, Tây Đức, Canada và những nước ở

Nam Á [5]

1.2 Công dụng của sản phẩm kefir

1.2.1 Giá trị dinh dưỡng

Hàm lượng protein, chất béo và các chất khoáng có trong kefir phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu sữa làm ra nó; do đó, kefir vốn đã có giá trị dinh dưỡng cao mà nó còn được xem như là một nguồn cung cấp protein và canxi Keifr cũng được biết đến là một thực phẩm ngon và dễ tiêu hóa, cho phép cơ thể hấp thụ một lượng lớn mà không ảnh hượng xấu đến hệ vi sinh vật đường ruột

Khả năng tiêu hóa: quá trình lên men kefir sẽ làm biến tính và thủy phân một số protein, kết quả tạo ra những cấu trúc nhỏ giúp tiêu hóa dễ dàng trong điều kiện của dịch dạ dày

và dịch ruột Kefir được dùng rộng rãi trong các bệnh viện và viện điều dưỡng ở các nước thuộc khối Liên Xô cũ trước đây, là một phần trong khẩu phần ăn của các bệnh nhân mắc các bệnh về hệ tiêu hóa, bệnh tăng huyết áp, bệnh thiếu máu cục bộ ở tim hoặc các bệnh nhân bị dị ứng Những bệnh nhân mắc bệnh lao phổi nên sử dụng kefir (250 mL/ngày) sẽ kích thích sự tiết dịch và sự hình thành acid trong dạ dày Kefir được khuyến cáo đặc biệt

là nên cho trẻ em và bệnh nhân mắc chứng kém tiêu hóa sử dụng

Giá trị protein: một nghiên cứu được thực hiện trên chuột chứng minh rằng kefir có những giá trị sinh học cao hơn trong sữa, nó được giải thích dựa trên sự tiêu hóa protein tốt hơn cũng như các hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn trong quá trình lên men; cả lượng nitơ tổng và lượng nitơ phi protein trong kefir đều cao hơn trong sữa làm ra nó Kefir giúp tiêu tiêu hóa protein cao hơn yoghurt và cung cấp nhiều giá trị dinh dưỡng hơn; một thí nghiệm chứng minh một công dụng khác của kefir là khả năng tái tạo các mô

ở gan chuột (70%), khi gan bị cắt bỏ một phần Suốt quá trình lên men và bảo quản, lượng amino acid trong kefir tăng lên, đặc biệt là lysine, proline, isoleucine, phenylalanine và arginine Vi khuẩn và nấm men được sử dụng để lên men kefir cũng làm biến đổi L-amino acid tự do của protein trong sữa thành D-amino acid , đặc biệt là D-alanine, D-

Sự chuyển hóa lactose: kefir chứa một hệ vi sinh vật đa dạng có khả năng hỗ trợ tiêu hóa lactose Những người không có khả năng tiêu hóa lactose là do thiếu enzyme β-galactosidase (EC 3.2.1.23) trong ruột hoặc enzyme lactase, enzyme chịu trách nhiệm thủy phân lactose thành glucose và galactose Những sản phẩm sữa lên men mang lại những hy vọng cho họ vì có một số vi sinh vật trong quá trình lên men tham gia vào quá trình sản xuất enzyme lactase So với các sản phẩm như yoghurt, sữa lên men từ

acidophilus và bifidus thì hàm lượng lactose trong kefir ít hơn sau 14 ngày lên men và

bảo quản

Acid lactic được tìm thấy hầu hết trong các sản phẩn sữa lên men, kết quả hoạt động của

vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình Acid lactic có thể tồn tại ở dạng đồng phân L-(+) và D-(-) L-(+) acid lactic thường được chuyển hóa trong cơ thể còn D-(-) acid lactic thì ít được chuyển hóa trong cơ thể; đặc biệt sự vượt quá D-(-) acid lactic có thể dẫn đến sự mất cân bằng các cơ chế chuyển hóa trong cơ thể WHO khuyến cáo không nên sử dụng những sản phẩm dinh dưỡng chứa nhiều D-(-) acid lactic; trong khi đó kefir chứa chủ yếu

là L-(+) acid lactic, còn tỷ lệ L-(+) acid lactic/D-(-) acid lactic trong yohgurt là 58:42 [24]

Hàm lượng vitamin: sữa bò được biết đến như môi trường hòa tan tốt nhất các vitamin, ngoại trừ acid ascorbic và vitamin B12 Một số nghiên cứu đã định lượng các vitamin trong kefir để xác định có sự thay đổi nào không giữa sữa lên men và sữa nguyên liệu, nhưng những kết quả thu được thì không chắc chắn Một trong những nghiên cứu đầu tiên

về vitamin B12 trong kefir cho thấy rằng, cả trong giai đoạn lên men và ủ chín thì vitamin

B12 đều giảm [24] Alm đã sử dụng các hạt kefir thương mại để sản xuất kefir và kết quả

là lượng acid folic trong kefir tăng lên so với sữa ban đầu, nhưng nồng độ vitamin B6, B12

và biotin giảm Bossi và cộng sự đã sản xuất kefir trong phòng thí nghiệm, kết quả thu được là lượng vitamin A, thiamin, riboflavin, nicotinamide và vitamin C giảm so với sữa ban đầu Kneifel và Mayer sử dụng 10 nguồn hạt kefir khác nhau thu được từ các gia đình

ở Áo, sản phẩm kefir làm tăng pyridoxine (9/10), vitamin B12 (5/10) và acid folic (7/10)

so với nguồn sữa bò ban đầu Hầu hết các mẫu kefir có lượng acid folic cao hơn 20% so với lượng acid folic có trong sữa nguyên liệu Lượng thiamin (8/10), riboflavin (10/10), niacin (8/10), acid pantothenic (7/10) và acid orotic hoặc vitamin B13 (9/10) trong sản phẩm kefir thì thấp hơn so với sữa ban đầu Khi so sánh các nguồn nguyên liệu sữa khác

nhau (bò, cừu, dê và ngựa), kefir lên men từ sữa cừu thì lượng thiamin, pyridoxine và acid folic tăng cao nhất; trái lại, kefir lên men từ sữa dê thì lượng thiamin, riboflavin, vitamin

B12, niacin, acid pantothenic và acid orotic giảm nhiều nhất Nguồn nguyên liệu sữa ảnh hưởng đến sự phát triển của các vi sinh vật trong kefir dẫn đến những thay đổi về lượng vitamin trong kefir Ngoài ra, lượng protein tổng trong kefir có thể tăng lên nếu sữa ban đầu có bổng sung muối natri caseinate; một số vi khuẩn được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ban đầu cũng giúp làm tăng lượng acid folic và vitamin B12 [24] Như vậy, sản phẩm kefir có chứa rất nhiều vitamin B1,vitamin B12, acid folic và vitamin K so với sữa nguyên liệu ban đầu, đây là nguồn biotin rất tốt giúp cho sự đồng hóa các loại vitamin B khác cho cơ thể Vì thế mà kefir giúp cơ thể giảm đi sự lão hóa của tế bào da, cung cấp nguồn năng lượng và kéo dài tuổi thọ cho con người [53]

1.2.2 Sản phẩm probiotic tự nhiên

Kefir là một sản phẩm probiotic tự nhiên Probiotic là thực phẩm chứa vi sinh vật sống,

có lợi cho sức khỏe [50] Theo một vài định nghĩa khác, một sản phẩm probiotic là một sản phẩm có chứa vi sinh vật sống mang lại những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường sự cân bằng của hệ vi sinh vật, các vi sinh vật này thường được sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men Thuật ngữ probiotic được sử dụng vào năm 1965 khi nó được định nghĩa cho bất kì vật chất hay vi sinh vật nào tham gia vào sự cân bằng của hệ

vi sinh vật đường ruột, ban đầu là cho các vật nuôi Vào đầu thế kỉ 20, Metchnikoff đã đưa ra định nghĩa của ông về probiotic (1907) và ông đã tin rằng sự phân bố của hệ vi sinh vật phức tạp trong ruột kết có ảnh hưởng bất lợi tới vật chủ vì chúng sinh ra các độc

tố cho cơ thể Sau đó, người ta đã xem xét lại quan điểm này và cho rằng việc cung cấp vi sinh vật sống bổ sung cho cơ thể mang lại nhiều lợi ích cho con người Kể từ đó, các sản phẩm sữa lên men trở thành nguồn thực phẩm thông dụng Gần đây, probiotic được định nghĩa là “những sinh vật sống trong đường ruột với một số lượng nhất định nào đó, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe ngoài những giá trị dinh dưỡng vốn có của nó” [51]

Như vậy, ta thấy không phải bất kì sản phẩm lên men nào có chứa vi khuẩn lactic cũng được xem là sản phẩm probiotic, chỉ một số ít vi khuẩn được xếp vào nhóm này Trong số

đó, kefir có chứa hai loài vi khuẩn lactic là Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei Tuy mật độ vi sinh vật hai loài này chưa phải là cao so với một số sản phẩm

men từ hệ vi sinh vật tự do và cố định tái tạo hạt kefir nhân tạo, ta hoàn toàn có thể chủ động nâng cao chất lượng probiotic của dòng sản phẩm này Kefir chứa nhiều vi khuẩn hoạt động, các vi khuẩn này cộng sinh thành một hệ vi sinh vật trong đó có nhiều giống vi sinh vật có khả năng chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác, phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột và hỗ trợ hệ tiêu hóa [51]

Kefir còn loại trừ các chất độc không mong muốn trong cơ thể, ngăn ngừa sự oxy hóa Kefir còn giúp giảm cholesterol trong máu, kích thích hệ miễn dịch tạo ra kháng thể, giúp giảm stress và giảm căng thẳng do có độ rượu nhẹ [51]

Đây là một sản phẩm cao cấp hơn yoghurt bởi vì yoghurt được làm trong thời gian ngắn, chứa ít vi khuẩn có hoạt tính mạnh Hệ vi khuẩn trong yoghurt sẽ giảm dần vài ngày trong hệ tiêu hóa Còn kefir thì chứa nhiều hệ vi sinh vật probiotic hơn, hơn thế nữa những vi sinh vật có mặt trong kefir được tạo từ một chuỗi vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, các chủng vi sinh vật này sẽ giúp tiêu diệt hay bất hoạt các vi sinh vật gây bệnh [53]

Ngày nay, kefir thường được những người dị ứng với lactose sử dụng thay thế cho nguồn các sản phẩm từ sữa Ngoài ra, nó còn thường được các bà mẹ bổ sung cho trẻ sơ sinh nhằm hỗ trợ cho hệ hoạt động của hệ tiêu hóa trẻ em Vậy kefir là một sản phẩm probiotic tự nhiên, là thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao cũng như đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe

Bảng 1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir

Hình 1.2 Hạt kefir [9, 59]

A – Hạt kefir khô B – Hạt kefir tươi Trong sản xuất kefir, người ta sử dụng tổ hợp giống vi sinh vật dưới dạng hạt kefir Hạt kefir có dạng thùy, hình dạng không ổn định, màu sắc từ trắng đến vàng nhạt, nhớt nhưng kết cấu rắn chắc, hạt thường kết thành chùm tương tự như một bông cải nhỏ, dài 1-3 cm, với đường kính trung bình 0.3-2 cm [23, 24] Thành phần hóa học hạt kefir bao gồm 89-90% nước, 0.2% lipid, 3% protein, 6% đường (chủ yếu là polysaccharide) và 0.7% chất tro [24] Hạt kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi protein và polysaccharide

Giống này bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacilli, Lactococci, Leuconostoc ) và nấm men Đôi khi, còn tìm thấy vi khuẩn Acetobacter aceti và Acetobacter racens cùng với

các vi sinh vật khác tổ chức thành khối cầu vi sinh vật Từ hàng nghìn năm qua sự tiêu thụ

đã chứng minh được rằng hệ vi sinh vật trong kefir là không gây bệnh mà còn có khả

năng ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Shigella Các

chủng vi khuẩn trong hạt kefir có một vũ khí đắc lực là bacteriocin có khả năng ức chế và tiêu diệt dần nhóm vi khuẩn gây bệnh với cơ chế tác động lên thành tế bào [44]

Hạt được giữ bằng cách chuyển chúng hằng ngày vào trong sữa và khi hạt phát triển chừng khoảng 20 giờ thì nó sẽ tăng khối lượng 25% Hạt phải được tăng sinh theo cách này để giữ khả năng phát triển của chúng, bởi vì những hạt cũ và khô thì khó hoặc không thể tăng sinh được [23]

Sự thay đổi của hạt: Tăng sinh hạt trong sữa và bảo quản chúng trong vòng 3 tháng ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4°C đều làm thay đổi thành phần vi sinh vật trong hạt Hơn nữa, khi rửa hạt trong nước cũng làm giảm khả năng phát triển của hạt; các công ty sản xuất hạt kefir thương mại thì hạt kefir giữ được sự phát triển tốt là nhờ vào việc cấy chuyền và

chỉ nên thay thế hạt nếu khả năng lên men của hạt bị suy giảm Bảo quản ở nhiệt độ thấp

là cách tốt nhất để duy trì hạt trong thời gian dài, bảo quản hạt ở -80°C hay -20°C trong

120 ngày thì hạt không bị thay đổi các đặc tính lên men so với hạt không được bảo quản Tuy nhiên, hạt bảo quản ở -4°C thì không sản xuất ra được hạt kefir đạt tiêu chuẩn sau quá trình rã đông Tăng sinh kefir trong sữa đậu nành thì kefir đạt kích thước nhỏ hơn hạt kefir được tăng sinh trong sữa bò [23]

Hình 1.3 Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét [23]

Sự phân bố của vi sinh vật trong hạt kefir gần như không đổi theo thời gian, mặc dù những thay đổi khí hậu có thể ảnh hưởng đến tính chất lưu biến của sản phẩm Các phân tích cho thấy thành phần vi sinh vật trong bản thân hạt, trong dịch hoạt hóa (mother culture) và trong sản phẩm cuối cùng không giống nhau Điều này giải thích một phần tại sao quá trình sản xuất kefir nên bắt đầu từ hạt, bởi vì sản phẩm cuối cùng có số lượng và

tỷ lệ vi sinh vật không giống như trong hạt

Bảng 1.3 Số lượng vi sinh vật (log cfu/g) trong hạt kefir, dịch hoạt hóa và kefir

Lactococci Lactobacilli Nấm men Hạt kefir

Dịch hoạt hóa

Kefir

7.37 8.43 8.54

8.94 7.65 7.45

8.30 5.58 5.24

[23] Hình 1.4 là các dạng khác nhau của hạt kefir từ dạng miếng mỏng (Hình 1.4a) đến dạng cuộn (Hình 1.4b, c) và dạng bông cải nhỏ (Hình 1.4d, e, f)

Những cấu trúc này đều co giãn và tương đối dai Cấu trúc được mô tả trong hình 1.4

phẳng với các nếp gấp cuộn xảy ra tiếp sau đó là do bởi sự tăng độ dày khi nhân đôi số lượng vi sinh vật và tích lũy các carbohydrate không tan Dưới kính hiển vi điện tử quét,

Lactobacilli chiếm ưu thế ở bên ngoài hạt kefir và nấm men ở trung tâm hạt kefir, nhưng

do quá trình cuộn thì đôi khi bề mặt bên ngoài lại trở thành bên trong Do đó người ta mong đợi rằng dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt có thể phát hiện các vi khuẩn

Lactobacilli dạng cong dài chiếm ưu thế ở bên trong cấu trúc hạt kefir [46, 54]

Hình 1.4 Đặc điểm hình thái của một số hạt kefir [54]

1.3.2 Hệ vi sinh vật trong hạt kefir

Hạt kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi chất polisacharide, phức hệ này được cho vào sữa để sản xuất thức uống kefir Thông thường, sau quá trình lên men người ta

thực hiện quá trình thanh trùng; vì vậy, nấm men và vi khuẩn sống vẫn tồn tại trong sản phẩm kefir Để hiểu được quá trình lên men cũng như đánh giá được những lợi ích sức khỏe của sản phẩm kefir, các nhà khoa học đã nghiên cứu rất nhiều về hệ vi sinh vật trong hạt và trong sản phẩm Quá trình phân lập và định danh vi sinh vật trong hạt kefir và trong kefir phụ thuộc rất nhiều vào việc lựa chọn môi trường phân lập phù hợp

Các vi khuẩn chính trong hạt kefir thuộc 4 giống: Lactobacilli, Lactococci, Leuconostoc

và Acetobacter Acetobacter cũng thường được đề cập tới, nhưng cũng có nhiều nghiên

cứu không nhắc đến giống vi sinh vật này trong hạt kefir Một vài nhóm nghiên cứu còn

đặt vấn đề liệu Acetobacter có phải là vi sinh vật tạp nhiễm trong hạt kefir hay không [23] Nhóm nghiên cứu của Farnworth đã xác định được sự hiện diện của Acetobacter

trong hạt kefir với số lượng rất ít, điều này giải thích tại sao nhiều nhóm nghiên cứu khác không thể phát hiện ra chúng [24]

Nhóm vi khuẩn Lactobacilli chiếm khoảng 65-80% tổng số vi sinh vật trong hạt, chúng gồm những loài ưa ấm và ưa nhiệt Nhóm Lactococci chiếm 20% tổng số tế bào Nấm

men chiếm 5-10% trong tổng số vi sinh vật trong hạt bao gồm những loài lên men hoặc không lên men được đường lactose [5]

Mật độ nhóm vi khuẩn lactic Lactobacilli đạt 108-5x109 (cfu/g) gồm nhóm lên men

đồng hình và dị hình Nhóm vi khuẩn lactic Lactococcus và Leuconostoc với mật độ 108

-109 (cfu/g) và nấm men với mật độ 106 – 108 (cfu/g) gồm nhóm nấm men có khả năng chuyển hóa đường lactose và nhóm nấm men không có khả năng chuyển hóa đường lactose Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phát hiện sự hiện diện của nhóm vi khuẩn

Acetobacter với mật độ 105-106 (cfu/g) Tỉ lệ vi khuẩn lactic : nấm men thường đạt là 250:1

Hệ vi sinh vật trong hạt kefir xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau thì khác nhau, thậm chí cùng một vùng nhưng khi hạt kefir được thu nhận từ các nhà khác nhau cũng có hệ vi sinh vật khác nhau, mật độ vi sinh vật khác nhau

Ngoài ra, sự phân bố hệ vi sinh vật trên hạt kefir cũng rất phức tạp, có sự khác biệt giữa vùng này và vùng khác, cũng như giữa bên trong và bên ngoài hạt Điều đó được thể hiện qua một số hình ảnh minh họa ở hình 1.5

Có sự khác biệt về sự phân bố nấm men và Lactobacilli Ở vùng nấm men chiếm ưu thế thì có ít Lactobacilli và ở vùng Lactobacilli chiếm ưu thế thì có ít nấm men Nấm men

không phân bố dày đặc ở bên ngoài hạt kefir, chủ yếu tồn tại ở bên trong hạt Các loài nấm men lên men được đường lactose thường được tìm thấy tại các vị trí gần bề mặt hạt kefir Ngược lại, các loài nấm men không lên men được đường lactose lại tìm thấy tại các

vị trí sâu bên trong tâm hạt [23]

Hình 1.5 Quan sát bên ngoài và bên trong hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét [56]

A, C Bên trong hạt kefir B, D Bên ngoài hạt kefir

Bảng 1.4 Trình bày tóm lược hệ vi sinh vật thường phân lập được trên hạt kefir có nguồn gốc khác nhau

pseudoplantarum Lactobacillus paracasei subsp paracasei Lactobacillus cellobiosus

Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subsp lactis Lactobacillus fructivorans

Lactobacillus helveticus subsp lactis Lactobacillus hilgardii

Lactobacillus kefiri Lactobacillus kefiranofaciens subsp

kefirgranum Lactobacillus kefirgranum Lactobacillus parakefir sp

Lactobacillus lactis Lactobacillus plantarum

STREPTOCOCCACEAE

Lactococcus lactis subsp lactis Lactococcus lactis subsp lactis blovar diacetylactis

Latococcus lactis subsp cremoris Streptococcus lactis

Streptococcus salivarius subsp

thermophilus

LEUCONOSTOCACEAE VÀ ENTEROCOCCACEAE

Enterococcus durans Leuconostoc cremoris Leuconostoc mesenteroides

[5, 24]

1.3.2.1 Thuyết cộng sinh

Hệ vi sinh vật trong kefir là một ví dụ minh chứng cho tính cộng sinh của vi sinh vật Mối quan hệ cộng sinh của hệ vi sinh vật trên hạt kefir được minh họa trong một số nghiên cứu sau đây:

Tính cộng sinh giữa vi khuẩn lactic và nấm men được thể hiện rõ rệt trong thí nghiệm nuôi cấy chúng độc lập Khi chúng được tách rời như những giống thuần chủng thì không thể phát triển trong sữa hay hoạt tính lên men có thể giảm ngay so với khi nuôi cấy tổ

hợp Lactobacillus kefir phát triển tốt hơn khi có nấm men Candida kefir được bổ sung

vào sữa Sự hiện diện của nấm men trong hỗn hợp với nhiệt độ lên men là 21-230C thúc

đẩy sự phát triển Streptococci dị hình tạo các hợp chất thơm Sự phát triển của vi khuẩn

lactic thúc đẩy sự phát triển của nấm men và vi khuẩn acetic Nấm men đóng vai trò quan trọng trong sản phẩm sữa lên men, chúng cung cấp một số chất dinh dưỡng cần thiết cho

sự phát triển như amino acid và vitamin, thay đổi pH, tạo CO2, ethanol Nấm men trong kefir thì ít được nghiên cứu hơn vi khuẩn trong kefir, mặc dù rõ ràng nấm men cung cấp môi trường phát triển cho vi khuẩn và sản phẩm chuyển hóa đóng góp vai trò tạo hương

vị và cảm quan cho sản phẩm Tính chất của nấm men trong kefir rất đa dạng; ví dụ, một

số loại nấm men thì có khả năng lên men lactose, trong khi đó một số thì không Một số thì hiện diện bên ngoài hạt kefir còn một số thì nằm sâu bên trong Nấm men hiện diện ở những vị trí khác nhau của hạt kefir có thể chúng thực hiện các quá trình lên men khác nhau [39, 41]

Trong kefir, nấm men là yếu tố chìa khóa của quá trình lên men, nó tạo ra tính chất đặc trưng cho sản phẩm kefir và ngay cả khi số lượng nấm men trong sản phẩm cuối cùng ít hơn trong hạt, chúng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng hệ vi sinh vật trong hạt

Tuy vậy, sự phát triển của nấm men không được kích thích ở những nơi vi khuẩn có mặt Khi hai loại này được cấy chung với nhau, lượng acid lactic, glycerol và ethanol tăng lên Sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn phân lập từ hạt kefir tăng lên nếu ta bổ sung dịch chiết nấm men vào môi trường nuôi cấy, cho thấy nấm men trong hạt kefir là yếu tố cần thiết cho sự toàn vẹn và khả năng sống sót của hệ vi sinh vật trong hạt kefir Các vitamin, amino acid và một số yếu tố cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn được sản

xuất bởi nấm men, trong khi các sản phẩm cuối của các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn là nguồn năng lượng cho nấm men [24]

Hình 1.6 cho thấy mối quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm men, các vi khuẩn bao quanh tế bào nấm men; khoảng cách giữa chúng cho thấy được một số tương tác vật lý và hóa học

Quan hệ cộng sinh còn được thể hiện giữa các nhóm vi khuẩn lactic Trong suốt quá

trình lên men khoảng 24 giờ thì vi khuẩn Streptococci đồng hình phát triển nhanh làm giảm pH, pH thấp này thích hợp cho sự phát triển của Lactobacilli, nhưng lúc này Streptoccocci giảm đi [39, 41]

Hình 1.6 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy mối quan hệ cộng sinh giữa

nấm men và vi khuẩn trong hạt kefir [24]

Chính mối quan hệ cộng sinh đã giúp cho hạt giữ được trạng thái không thay đổi, hệ vi sinh vật trong hạt và trong kefir ổn định theo thời gian mặc dù chất lượng sữa khác nhau,

sự tồn tại tiềm tàng các chất kháng sinh cũng như những cơ chất ứng chế khác Thành phần vi sinh vật trong hạt và trong kefir không giống nhau bởi vì các điều kiện (pH và những điều kiện khác) trong quá trình lên men Sự phân bố của vi sinh vật trong hạt cũng

có thể là một yếu tố gây ra điều đó Nấm men thường được tìm thấy ở phía trong hạt,

trong kefir thường thấp hơn trong hạt, trong khi vi khuẩn lactococci chiếm đa số trong sản

phẩm cuối Bởi vì kefir được lên men bởi hệ vi sinh vật hết sức phức tạp nên người ta không thể sử dụng sản phẩm cuối để lên men các mẻ kefir tiếp theo (như yoghurt) [24]

1.3.2.2 Chu kỳ phát triển của giống kefir

Hạt kefir là những giống gốc tự nhiên, chúng được hình thành từ những màng bao bọc mỏng không theo một quy tắc nào cả, bao gồm hỗn hợp protein, lipid và polysaccharide Những màng bao bọc phát triển với hình dạng không nhất định, hình thành các thùy phức tạp và không đồng đều, các thùy này lại có xu hướng trở về nguyên bản tạo thành cấu trúc sinh học bao gồm nhiều thùy con bao quanh Với dấu hiệu phát triển đặc biệt như thế chúng hình thành những hạt con, mỗi tiểu thùy được kết nối với nhau ở phần giữa, xòe ra trong khi nó được gắn với các điểm trung tâm của hạt giống mẹ

Nhờ sự xuất hiện đó mà các hạt con tách ra có mẫu hình phát triển giống như hạt mẹ ban đầu Một vài hạt kefir cũng tách ra giống với cấu trúc vật lý của não người, tuyến tụy

và các cơ quan bên trong Sau một thời gian có thể do chấn thương hoặc những tác động bên ngoài, một phần thùy con gắn với hạt mẹ bị tách ra thành hạt tự do Những hạt con này lại tiếp tục nhân giống thành hạt mẹ Chu kỳ phát triển được lặp lại với chu trình gần giống nhau (tự nhân giống) Trong vài trường hợp đặc biệt, có những hạt không thể cho ra bất cứ hạt con nào trong một thời gian dài mà thay vào đó, chúng hình thành nên một khối lớn (khối hạt kefir)

Bề mặt ngoài của hạt biến đổi từ dạng phẳng đến không đồng đều gồm nhiều thứ phức tạp, có những chỗ lồi lõm rải rác khắp bề mặt Một vài hạt có thể có những vùng rộng phẳng, trong khi từ mẻ tương tự có thể có những hạt có bề mặt không đồng đều Nếu điều kiện thuận lợi, sau một thời gian, những hạt nhẵn này thường trở lại dạng nguyên thể, sau

đó hình thành các hạt bao quanh, nơi mà có thể nhân giống lên Thường ở những vùng không phẳng, xù xì thường có sự hoạt động mạnh của nấm men, trong khi ở vùng phẳng

vi khuẩn lại chiếm ưu thế Nấm men hình thành những khóm nhỏ nhô ra trên bề mặt,

Streptococci thì bện vào nhau với các vi khuẩn khác chứ không hình thành dạng cụm

Ở sâu bên trong hạt, Lactobacilli chiếm ưu thế và có rất ít tế bào nấm men, chúng được

gói gọn trong dịch polysaccharide, các vi khuẩn hình que và nấm men hình thành các cụm

riêng biệt bên ngoài và bên trong hạt Trong đó Lactobacilli kefiranoficients được xem là

nguyên nhân hình thành polysaccharide hòa tan kefiran Trong khi đó Lactobacilli acidophilus là nguyên nhân hình thành vỏ bọc bên ngoài polysaccharide mà có thể giúp

hạt co giãn Một số nghiên cứu cho rằng vi khuẩn có thể gây ra sự nhân giống hạt kefir vì

việc nhân giống của hạt không xảy ra khi vắng mặt Lactobacilli kefiranoficients - là vi

khuẩn sinh ra kefiran ở trung tâm hạt [22, 27, 40]

Cơ chế phức tạp về sự hình thành cấu trúc gian bào vi sinh vật trong hạt kefir hiện nay chưa được giải thích rõ ràng Người ta khám phá được gel hòa tan polysaccharide trong hạt kefir với tên gọi là kefiran (KGF-C) Kefiran hình thành ở trung tâm hạt, với điều kiện kỵ khí thuận lợi cho việc tổng hợp kefiran có sự hiện diện của ethanol Một vài loài

Lactobaccilli khác cũng sinh ra polysaccharide như Lactobaccilli brevis [25, 29, 31]

Hình 1.7 Sự tổng hợp EPS trong hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử quét [10]

1.3.3.2 Một số nghiên cứu về kefiran

Người ta quan sát cấu trúc của hạt kefir và sớm phát hiện ra rằng một vài vi khuẩn được bao bọc bởi một polysaccharide La Riviére đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về polysaccharide này và đặt tên cho nó là kefiran

Các nghiên cứu cho thấy galactose thay thế bởi O ở vị trí C số 6 cũng tồn tại trong cấu trúc kefiran Kefiran là hợp chất có nguồn gốc chỉ từ hạt kefir, nhưng vẫn chưa xác định được có hay không một polysaccharide khác hoặc những đồng phân của kefiran tồn tại trong hạt kefir hay trong sản phẩm kefir Lượng polysaccharide trong hạt kefir có thể lên đến 34%, hạt kefir sấy khô bao gồm chất gian bào khoảng 45% là kefiran, trong khi lượng polysaccharide trong sản phẩm cuối cùng chỉ chứa 0.2 đến 0.7% polysaccharide [24, 25,

29, 31]

Lb brevis là vi khuẩn đầu tiên được cho là sản xuất ra kefiran Lb kefir cũng được cho

là vi khuẩn chịu trách nhiệm sản xuất kefiran Người ta đã phân lập vi khuẩn sản xuất

exopolysaccharide và đặt tên Lactobacillus kefiranofaciens Lactobacillus sp KPB – 167B, Lactobacillus kefirgranum và Lactobacillus parakefir là những vi sinh vật chịu

trách nhiệm sản xuất kefiran

Yokoi đã phân lập được 5 loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp polysaccharide thuộc

giống Lactobacillus từ hạt kefir thương mại Yokoi cũng đưa ra danh sách các vi khuẩn

sản xuất kefiran, điều đó cho thấy sự phức tạp của mối quan hệ phân loại các vi khuẩn phân lập từ kefir và cho thấy những vi khuẩn khác tìm thấy trong hạt kefir có thể có khả năng sản xuất kefiran - giống polysaccharide ở những hạt có nguồn gốc khác nhau

Nhóm của Toba cố gắng tạo ra một sản phẩm sữa lên men, sử dụng kefiran sản xuất bởi

Lb kefiranofaciens được phân lập từ hạt kefir, nhưng những sản phẩm ấy lại ít được

người tiêu dùng chấp nhận

Nhiều nhóm nghiên cứu cố gắng tìm ra các môi trường và điều kiện tăng trưởng để tối

ưu cho việc sản xuất kefiran Kết quả đã tạo ra 80 mg polysaccharide trên 1 lít môi trường Sử dụng môi trường tăng trưởng dựa trên dịch whey có bổ sung thêm glucose và trypticase peptone so với môi trường tăng trưởng dựa trên dịch whey tiêu chuẩn Các báo cáo đã xác định rằng độ nhớt của sản phẩm cuối cùng tỷ lệ với thành phần polysacchaside

5 loại vi khuẩn được Yokoi phân lập có khả năng sản xuất từ 273 đến 406 mg polysaccharide tổng cộng trên 1 lít môi trường (bao gồm polysaccharide tự do và polysaccharide liên kết - bao bọc vi sinh vật) với môi trường vẫn là môi trường tăng trưởng dựa trên dịch whey Hạt kefir có thể được sử dụng để sản xuất exopolysaccharide

từ whey tách protein

Sử dụng môi trường MRSL (Man, Rogusa, Sharp Lactose) có chứa 10% lactose, sau 4 ngày cấy giống thì có thể sản xuất 2.04 g polysaccharide trên 1 lít môi trường

Cũng với môi trường trên, có thể sản xuất ra lượng lớn kefiran theo mẻ (2 g/L) từ vi

khuẩn Lactobacillus phân lập từ hạt kefir thu được ở Ý

Gần đây, người ta có thể sử dụng phương pháp lên men fed-batch với môi trường có bổ sung dịch chiết nấm men để đạt được nồng độ kefiran là 5.41 g/L sau 87 giờ khi sử dụng

1.3.3.3 Tính chất và công dụng

Các Exopolysaccharide (EPS) là các carbohydrate trên bề mặt tế bào, được cho là có các đặc tính bảo vệ và thích nghi của chính các vi khuẩn sản xuất ra chúng; chúng không liên kết chặt với màng tế bào nên dễ dàng bị rửa trôi vào môi trường

Kefiran là một loại EPS được tìm thấy trong hạt kefir, những hạt kefir khác nhau có thể chứa nhiều loại EPS khác nhau

Kefiran chứa D-glucose và D-galactose với tỷ lệ 1:1 Phản ứng phân giải liên kết hydro tiến hành bởi phân tích NMR được sử dụng để xác định công thức của kefiran (Hình 1.8) Cấu trúc gồm một chuỗi mà mỗi đơn vị gồm 6 hay 7 gốc đường lặp lại, các đơn vị này thường gồm 5 gốc đường thông thường và 1-2 gốc còn lại được gắn ngẫu nhiên Nhưng thực tế cấu trúc kefiran có thể còn phúc tạp hơn [23]

Hình 1.8 Cấu trúc của kefiran [23]

Kefiran có tỷ lệ glucose:galactose là 1:1 và có góc quay quang +68.0° Kefiran cũng có thể có tỷ lệ glucose:galactose là 0.9:1.1 và góc quay quang +54.0° Kefiran tan nhanh trong nước nóng, tan chậm trong nước lạnh và trở thành dung dịch nhớt ở nồng độ 2% Carboxylmethyl kefiran có độ nhớt gấp 14 lần kefiran Kefiran có thể tạo gel yếu khi thêm vào К-carrageenan 1% với tỉ lệ kefiran : К-carrageenan là 1:4, với nhiệt độ gel hóa

và nhiệt độ nóng chảy gần giống với gel guar /К-carrageenan Kefiran sản xuất từ sữa bò đạt gần gấp đôi sữa đậu nành [23]

Một thử nghiệm trên chuột đã phát hiện tính kháng ung bướu của kefiran Trong thử nghiệm này kefiran được cung cấp từ đường miệng của chuột và kết quả cho thấy kích thước khối u đã giảm đi rõ [37, 40, 48]

Một nghiên cứu cũng cho thấy khả năng ức chế đáng kể của kefiran đến sự hình thành các khối u Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả kháng viêm của kefiran là 34±15% [48] Một thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế các tế bào cảm ứng ovalbumin gây viêm phổi của kefiran trên chuột bị hen suyển [40]

1.3.4 Bảo quản hạt kefir

Mục đích của quá trình bảo quản hạt kefir là sau quá trình bảo quản, các tính trạng của hạt không bị mất hoặc giảm Để làm được điều đó, người ta tiến hành các biện pháp dựa trên nguyên tắc làm giảm quá trình trao đổi chất và hô hấp của vi sinh vật Các yếu tố tác động mạnh lên hai quá trình này được quan tâm nhiều nhất là: nhiệt độ, độ ẩm và lượng không khí tiếp xúc trực tiếp [1]

Chế phẩm giống được bảo quản tốt thì sẽ có tác dụng sinh, lý, hóa y như ban đầu nếu gặp được điều kiện môi trường dinh dưỡng thích hợp Hạt kefir khi đem bảo quản phải ở trạng thái sinh lý tốt Hoạt tính của kefir phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và hoạt tính của các hạt quyết định chất lượng của sữa lên men

Các phương pháp thường được sử dụng bảo quản hạt kefir là làm khô bằng không khí, bảo quản lạnh, phương pháp đông sâu và đông khô Các nghiên cứu cho thấy, hạt kefir truyền thống làm khô bằng không khí và đông khô giữ được hoạt tính từ 12 ÷ 18 tháng Hạt kefir bảo quản bằng bằng phương pháp lạnh sâu ở -20oC có thể giữ hoạt tính từ 7 ÷ 8 tháng; trong khi các hạt được bảo quản lạnh sẽ giảm hoạt tính sau khoảng 10 ngày [55]

Làm khô bằng không khí (air-drying)

Đây là cách bảo quản đơn giản nhất, làm khô hạt kefir bằng không khí trong thiết bị vô trùng, sau đó gói trong giấy và giữ nơi khô mát Hạt kefir được bảo quản bằng cách sấy bằng không khí khô thì giữ được hoạt tính của chúng đến 12-18 tháng

Thí nghiệm cho thấy, sau thời gian bảo quản từ 1 tháng trở lên, nếu ta đem hạt làm khô

sản phẩm sẽ không có pH, độ chua, lượng acid lactic so với hạt kefir tươi Tuy nhiên, với thời gian lên men lâu hơn (18 giờ), sản phẩm sẽ đạt chất lượng như sản phẩm lên men từ hạt tươi Vì vậy, sau thời gian bảo quản cần phải ngâm chúng vào nước, lọc sạch, sau đó hoạt hóa Khi thực hiện hoạt hóa hạt kefir trong môi trường sữa tươi trong 24 giờ ở điều kiện 250C, rồi thay môi trường mới, quá trình này thực hiện 6 lần liên tiếp trước khi đem nuôi cấy Hầu hết các phương pháp đều đề nghị nên rửa giống trước khi sử dụng, nhưng một số khác lại không cho phép, họ cho rằng hệ vi sinh vật có lợi bên ngoài hạt kefir sẽ bị xáo trộn hoặc bị tiêu diệt hoàn toàn trong nước có chlorine hay flourine và không nên rửa giống ngoại trừ mục đích làm khô hay muốn ngừng lên men trong thời gian ngắn

Hạt kefir được làm khô bằng không khí thì có màu hơi nâu và mùi hôi, cấu trúc dai bởi

vì mất độ ẩm Nấm sợi cũng phát triển trên bề mặt hạt kefir làm khô bằng không khí khoảng 2 tuần sau khi sấy [55]

Phương pháp bảo quản lạnh (refrigerating)

Một cách trữ giống khác là đặt hạt ở điều kiện lạnh một thời gian dài mà không có vấn

đề gì đến việc tái kích hoạt giống

Hạt kefir ướt giữ lạnh ở 40C hoặc hạt kefir khô giữ ở nhiệt độ phòng, hạt kefir khô giữ được hoạt tính khoảng 12-18 tháng, trong khi đó hạt ướt chỉ giữ được 8-10 ngày Thời gian đầu, hạt ướt bảo quản lạnh có khả năng lên men sản phẩm có pH, độ chua, lượng lactose gần như hạt kefir tươi Tuy nhiên, với thời gian bảo quản lâu hơn, từ 1 tháng trở lên, tính chất sản phẩm lên men từ hạt ướt không còn được giữ như ban đầu nữa, nguyên nhân là do sự thay đổi thành phần của hệ vi sinh vật trong hạt kefir Chính vì nguyên nhân

đó, hạt ướt bảo quản lạnh không có thời gian bảo quản lâu dài

Bảo quản lạnh hạt kefir vẫn giữ được hình dạng điển hình, màu sắc và độ đàn hồi tự nhiên và khối lượng của hạt kefir tươi ban đầu Tuy nhiên, sau 10 ngày bảo quản hạt kefir được giữ lạnh có một lượng acid và mùi cồn [55]

Hình 1.9 Bảo quản lạnh [48]

Phương pháp đông sâu (freezing)

Nguyên lý: sự phát triển của vi sinh vật trong hạt kefir bị ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu

(-1960C đến -200C) Với phương pháp này, tế bào vi sinh vật có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này, người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ đông sâu và làm tan nhanh như glycerin 15%; huyết thanh ngựa; dung dịch saccharose 10% + gelatin 1%, pH 6.8-7; dung dịch glucose hoặc lactose 10%; DMSO (dimethyl sulfoxide)

Việc bảo quản theo phương pháp đông sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -200C, -300C, -400C, -700C, -1400C và -1960C Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -200C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Đặc biệt với phương pháp bảo quản đông sâu trong nitơ lỏng (-1960C) là phương pháp ưu thế hơn cả Hiện nay, ở Việt Nam chúng ta thường chỉ có điều kiện bảo quản đến nhiệt độ tối đa là -800C

Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quý mà không thích hợp với phương pháp đông khô [55]

Hình 1.10 Bảo quản trong nitơ lỏng [48]

Phương pháp đông khô (freeze drying/ lyophilization)

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu, tức là nước bị thăng hoa, nhiệt độ của mẫu được hạ thấp xuống dưới điểm đông đặc (dưới -100C) và được đặt trong bình chân không có áp suất gần với áp suất chân không tuyệt đối, khi đó nước thoát ra khỏi mẫu ở trạng thái rắn, tức là thăng hoa ẩm Ở đây hạt kefir được giữ trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao Phương pháp bảo quản này làm cho hạt và tế bào vi sinh vật mất nước ở trạng thái tự do nhưng có khả năng chống chịu cao đối với nhiều tác động của môi trường, giúp bảo quản hạt trong thời gian dài, giống vi sinh vật không sợ bị thoái hóa Hạt kefir được đông khô cũng giữ được hình dạng và màu sắc của hat kefir tươi nhưng hạt có

vẻ giòn hơn nhiều

Khi sử dụng phương pháp đông khô, việc quan trọng là phải lựa chọn chất bảo vệ thích hợp, chất bảo vệ phải đáp ứng được hai yêu cầu sau: thứ nhất, đảm bảo sự sống sót của hệ

vi sinh vật; thứ hai, phải duy trì được sự cộng sinh Trong đó, việc đảm bảo sự tồn tại của

hệ vi sinh vật cộng sinh trong hạt là điều kiện tiên quyết

Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô thể dịch trực tiếp Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ, hỗn hợp chất bảo vệ và hạt kefir được

làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông khô Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là: tuổi của vi sinh vật bảo quản, thành phần dung dịch chất bảo vệ, tốc độ đông khô, nhiệt độ đông khô thấp nhất, khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu

Phương pháp này nhanh, thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu và thời gian bảo quản lâu Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị

Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hóa trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các tính năng sinh học [48]

Hình 1.11 Bảo quản đông khô [48]

1.4 Quá trình lên men kefir

1.4.1 Bản chất của quá trình lên men

Mặc dù kefir thương mại được sản xuất là từ sữa bò, nhưng nó cũng có thể được làm từ sữa cừu, dê và trâu Hơn thế nữa, gần đây người ta còn sản xuất kefir từ sữa đậu nành Kích thước của hạt kefir có ảnh hưởng đến pH, tính dẻo và số lượng vi sinh vật trong sản phẩm cuối Người ta thấy rằng tỉ lệ hạt kefir và sữa là 1:30 đến 1:50 là tối ưu cho sự

khuẩn lactic đồng hình Streptococci phát triển khá nhanh vào lúc ban đầu làm cho pH môi trường giảm xuống Việc giảm pH này tạo thuận lợi cho sự phát triển của Lactobacilli và đây là nguyên nhân làm Streptococci đồng hình giảm số lượng.Và sự hiện diện của nấm

men trong hỗn hợp, cùng với nhiệt độ lên men 21-23 0C đã kích thích sự phát triển

Streptococci dị hình tạo mùi thơm cho sản phẩm Trong quá trình lên men sự gia tăng của

vi khuẩn lactic tạo điều kiện cho sự phát triển của nấm men và vi khuẩn sinh acetic

Ngày nay các vi khuẩn lactic và nấm men đông khô đã được bán rộng rãi trên thị trường Trong vài trường hợp người ta còn thêm vào một số chủng vi sinh vật bên ngoài

để có được sản phẩm với những đặc điểm mong ước Người ta thấy rằng sản phẩm cuối cùng lên men từ những hạt kefir cho số lượng vi sinh vật đa dạng và nhiều hơn so với kefir lên men từ hỗn hợp vi sinh vật riêng lẻ [5, 23]

1.4.2 Cơ sở của quá trình lên men

Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa gồm các quá trình lên men lactic và lên men ethanol

1.4.2.1 Lên men lactic

Trong công nghệ vi sinh vật, nhìn chung các vi khuẩn lactic đồng hình luôn chiếm ưu thế Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất một số thực phẩm lên men truyền thống như phô mai, yoghurt,… trong đó có kefir, các vi khuẩn lactic dị hình lại được xét đến nhằm mục đích đa dạng hóa các chỉ tiêu về mùi, vị và cấu trúc cho sản phẩm

Hình 1.12 Con đường lên men đồng hình và dị hình ở vi khuẩn lactic [9]

Cơ chế của quá trình lên men lactic đồng hình có thể được tóm tắt ở hình 1.13

Phosphoketolase pathway

DỊ HÌNH ĐỒNG HÌNH

Hình 1.13 Lên men lactic đồng hình bằng con đường Embden-Meyerhoff [47]

Cơ chế tổng quát của quá trình lên men lactic dị hình của vi khuẩn lactic được thể hiện

ở hình 1.14