Để tiến hành lên men cồn, các báo cáo trước đây sử dụng rất nhiều phương pháp khác nhau như lên men bằng hệ vi sinh vật tự do, cố định trên chất mang cellulose khử lignin (DC), cố định trên chất mang gluten dạng viên… Để khảo sát và tìm ra phương án tối ưu cho quá trình lên men cồn từ whey cũng như khảo sát thành phần hợp chất thơm phù hợp với dạng sản phẩm thức uống lên men, người ta đã tiến hành các phương pháp khác nhau để sản xuất thức uống lên men từ whey. Hạt kefir sử dụng trong thí nghiệm có nguồn gốc
từ Thessaloniki, Hi Lạp. Whey được thu nhận tại một nhà máy sữa ở Hy Lạp. Thành
phần của dịch whey được xác định chứa 5% lactose (w/v), 0.3% béo (w/v), 0.7% protein (w/v), và các thành phần vô cơ như tro chiếm 0.5% (w/v).
4.2.1. Khảo sát các phương pháp khác nhau để sản xuất thức uống lên men từ whey sử dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir whey sử dụng hệ vi sinh vật trong hạt kefir
4.2.1.1. Các phương pháp lên men
Lên men từ sinh khối vi sinh vật trong hạt kefir dạng viên
Môi trường nuôi cấy hệ vi sinh vật trong hạt kefir là môi trường whey được bổ sung
115 75ºC trong 15 phút. Sau đó sinh khối ướt sẽ được thu nhận vào cuối pha log bằng phương pháp ly tâm. 10 g sinh khối ướt sẽ được chuyển vào bioreactor có thể tích lên men là 1.5 L. Tiến hành quá trình lên men fed-batch hiếu khí ở 30ºC, môi trường được fed vào bằng bơm nhu động có độ chính xác cao. Môi trường lên men sử dụng là môi trường whey có
bổ sung KH2PO4 và (NH4)2SO4 nồng độ như trên. Tiến hành sục khí vô trùng thông qua
màng lọc vô trùng với vận tốc 4 L/phút. Quá trình lên men kéo dài 7 giờ, sau đó sinh khối ướt kefir hình thành thành dạng viên.
800 mL whey sẽ được tiệt trùng, sau đó cấy giống vào với 16 g sinh khối ướt dạng viên và lên men ở 30ºC cho đến khi giá trị pH đạt 4.7, 4.1, hoặc 3.0.
Cố định hệ vi sinh vật trong kefir trên chất mang DC
Trộn 300 g mạt cưa với 3 L dung dịch NaOH 1%. Huyền phù được gia nhiệt trong 3 giờ ở nhiệt độ sôi, và thể tích nước trong suốt quá trình gia nhiệt được giữ không đổi bằng cách bổ sung thêm nước liên tục. Huyền phù được lọc với phễu lọc Büchner, sau đó phần rắn được rửa nhiều lần với nước nóng ở 80ºC để thu chất mang cellulose khử lignin (DC). Chất mang được tách bớt nước bằng phễu lọc. Như vậy, ta có thể thu nhận được chất mang DC dạng ướt để tiến hành cố định tế bào.
Cho 16 g sinh khối ướt của kefir vào 800 mL môi trường nuôi cấy chứa 12% glucose có pH 4.8 (được điều chỉnh bằng acid sulfuric). Huyền phù này được trộn với 170 g chất mang DC dạng ướt và tiến hành lên men trong 6 giờ. Sau đó, tách phần dịch lỏng, phần rắn được rửa 2 lần, mỗi lần với 400 mL môi trường nuôi cấy chứa glucose. Sau khi tiết
hành lọc thô và lọc dưới phêu Büchner, chất mang DC đã được cố định vi sinh vật sẽ
được sử dụng trực tiếp trong quá trình lên men.
Cho 360 g chất mang DC dạng ướt đã được cố định vi sinh vật vào 800 mL dịch whey tiệt trùng. Sau đó tiến hành lên men tương tự với điều kiện thí nghiệm lên men bằng sinh khối ướt.
Cố định hệ vi sinh vật trong kefir trên chất mang gluten dạng hạt
Huyền phù hóa 16 g sinh khối ướt nấm men kefir vào 800 mL môi trường nuôi cấy có
chứ 12% glucose (w/v), 0.1% (NH4)2SO4 (w/v), 0.1% KH2PO4 (w/v), 0.5% MgSO4 (w/v)
116 sulfuric. Huyền phù được trộn với 170 g hạt gluten và tiến hành lên men đến khi đạt 0.1ºBe. Sau đó, tách phần dịch lỏng, các hạt gluten được rửa 2 lần với 400 mL môi trường nuôi cấy và được đem sử dụng trực tiếp cho quá trình lên men whey.
Cho 400 g chất mang gluten dạng hạt đã được cố định vi sinh vật vào 800 mL dịch
whey tiệt trùng. Sau đó tiến hành lên men tương tự với điều kiện thí nghiệm lên men bằng sinh khối ướt.
4.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nho đen và fructose lên quá trình lên men whey sử dụng sinh khối kefir dạng viên
Hỗn hợp chứa 792 mL whey thanh trùng và 8 mL dịch chiết nho được lên men với 8 g sinh khối ướt kefir đã thu được ở thí nghiệm trên. Dịch chiết nho có hàm lượng chất khô 12 ºBe: 100 g nho sẽ được trích ly với nước nóng ở nhiệt độ 72ºC ít nhất trong 3 giờ.
Tương tự như vậy, whey thanh trùng được bổ sung fructose (2% w/v). Whey sau khi đã bổ sung fructose sẽ được lên men với 18 g sinh khối ướt hạt kefir.
Mỗi hỗn hợp được ủ ở 30ºC cho đến khi pH đạt giá trị 4.1. Động học của các quá trình lên men được xác định bằng hàm lượng chất khô ở những khoảng thời gian khác nhau. Vào cuối mỗi mẻ lên men, các mẫu được lấy đem phân tích ethanol, đương sót và các sản phẩm phụ tạo hương dễ bay hơi.
4.2.1.3. Các phân tích hóa sinh
Định lượng ethanol và đường sót
Ethanol và đường sót được định lượng bằng phương pháp phương pháp HPLC. Tiến hành chạy sắc kí ở áp suất 78-82 atm và tốc độ dòng chảy của pha động là 0.8 mL/phút. Nhiệt độ tiến hành phân tích là ở 60ºC. 0.5 mL mẫu và 1% dung dịch butanol-1 được cho
vào bình định mức, sau đó định mức đến 50 mL bằng nước cất. 40 µL dung dịch đã pha
loãng được tiến hành chạy sắc kí.
Định lượng các hợp chất thơm
Các sản phẩm phụ dễ bay hơi được định lượng bằng phương pháp sắc kí khí. Ethanal,
ethyl acetate, propanol-1, isobutyl ancohol và amyl ancohol (2-methyl butanol-1 và 3- methyl butanol-1) được định lượng sau khi phân tách đẳng nhiệt ở 58ºC.
117
4.2.1.4. Kết quả
Phương pháp thúc đẩy quá trình lên men whey diễn ra nhanh hơn là sử dụng các tế bào cố định. Hình 4.2 thể hiện sự biến đổi nồng độ whey trong quá trình lên men theo 3 phương pháp khác nhau: sử dụng sinh khối ướt, cố định trên chất mang DC, cố định trên chất mang gluten và biến đối nồng độ whey khi sử dụng sinh khối ướt lên men whey có
bổ sung dịch chiết nho đen. Việc cố định nấm men kefir lên chất mang DC sẽ làm cho
quá trình lên men cồn từ whey xảy ra nhanh hơn, rút ngắn thời gian lên men rất nhiều.
Hình 4.2. Động học của quá trình lên men sử dụng các phương pháp khác nhau [14].
Tuy nhiên, thời gian lên men cũng tương đương với thời gian lên men sử dụng sinh khối ướt có bổ sung dịch chiết nho đen. Sự rút ngắn thời gian lên men có thể là do sự hiện diện của cả hệ vi sinh vật trong kefir với mật độ cao trong trường hợp lên men bằng tế bào cố định, và có thể là do sự bổ sung cơ chất dịch chiết nho. Việc sử dụng gluten dạng hạt làm chất mang để cố định nấm men kefir cũng có thể rút ngắn thời gian lên men, tuy nhiên hiệu quả không cao so với sử dụng chất mang DC. Một nhược điểm quan khác
của gluten là lượng amyl alcohol tổng hợp cao trong quá trình lên men whey, đạt 250
ppm. Protein tự nhiên của gluten làm đẩy mạnh quá trình hình thành amyl alcohol, chất này sau đó có thể gây ra độc tính. Mặt khác, quá trình lên men sử dụng nấm men kefir cố định trên chất mang DC sẽ hạn chế lượng sản phẩm phụ bay hơi so với sử dụng nấm men kefir cố định trên gluten. Lượng ethanol tạo thành không có sự khác biệt đáng kể giữa các phương pháp lên men khác nhau. Lên men sử dụng sinh khối ướt được lựa chọn là
118 phương pháp phù hợp để lên men ethanol bởi vì quy trình cố định đôi khi tiến hành không hiệu quả sẽ không thể rút ngắn thời gian lên men, trong khi lượng cồn thu được khi tiến hành lên men bằng hệ vi sinh vật cố định và sinh khối ướt là tương đương nhau. Nếu tiến hành quy trình cố định không hiệu quả, lượng cồn thu được thậm chí còn có thể thấp hơn trường hợp lên men bằng sinh khối ướt. Do vậy, người ta chọn phương pháp tối ưu tiến hành lên men là phương pháp sử dụng sinh khối kefir dạng viên.
Bảng 4.1. Hàm lượng đường sót và nồng độ cồn của các sản phẩm lên men bằng các
phương pháp khác nhau
Đường sót (g/L) Ethanol
(%v/v)
Lactose Glucose Fructose Tổng
DC 1.18 0.11 1.29 2.38
Gluten 0.98 0.20 1.18 2.40
Sinh khối dạng viên 1.21 0.27 1.48 2.18
1% dịch chiết nho 0.92 0.14 1.06 2.45 2% fructose 3.38 0.23 1.73 5.34 3.42 pH 4.7 10.09 4.29 14.38 1.78 pH 4.1 4.66 0.61 5.27 2.15 pH 3.0 2.80 0.76 3.56 2.28 [14]
pH cũng là một nhân tố quan trọng có thể ảnh hưởng mạnh đến lượng sản phẩm lên
men thu được trong quá trình lên men. pH ảnh hưởng đến lượng CO2 tạo thành trong quá trình lên men kefir. Hơn nữa, thời gian lên men glucose và hàm lượng các hợp chất bay hơi tạo thành chịu ảnh hưởng đáng kể bởi giá trị pH của môi trường. Điều này sẽ ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm [12]. Bảng 4.1 thể hiện lượng đường tổng, lactose, glucose và hàm lượng ethanol của sản phẩm kefir whey lên men kết thúc ở các giá trị pH 3.0, 4.1 và 4.7. Lượng đường tổng, lactose và glucose khi kết thúc quá trình lên men ở pH 4.7 cao hơn rất nhiều so với các mẫu kefir whey kết thúc ở pH 4.1 và 3.0. Kết quả này cho thấy quá trình lên men kết thúc ở pH 4.7 chưa xảy ra hoàn toàn. Hình 4.3 thể hiện phần trăm của ba sản phẩm phụ bay hơi chính (acetaldehyde, ethyl acetate, và rượu
amylic) của quá trình lên men ở các giá trị pH cuối 3.0, 4.1 và 4.7. Rượu amylic (2-
119 lệ rượu amylic trong trường hợp pH 4.1 giảm đáng kể so với trong trường hợp kết thúc quá trình lên men ở pH 3.0, và thấp hơn pH 4.7 rất nhiều. Mặt khác, nồng độ ethyl acetate tạo thành trong trường hợp pH 4.1 lại cao hơn khi kết thúc quá trình lên men ở pH 3.0 và pH 4.7. Từ các kết quả trên ta có thể kết luận pH 4.1 là pH tối ưu cho các sản phẩm lên men, dựa trên thành phần các sản phẩm phụ.
Hình 4.3. Ảnh hưởng của pH kết thúc quá trình lên men lên tỷ lệ ethanol, ethyl acetate
và amyl ancohol [14].
Để tăng hương vị cho whey lên men, người ta tìm cách bổ sung nguồn cơ chất cho vi sinh vật vào nguyên liệu ban đầu. Cơ chất bổ sung có thể được vi sinh vật tổng hợp các hợp chất bay hơi tạo nên hương vị thơm ngon cho sản phẩm whey lên men. Theo một số nghiên cứu [12], hệ vi sinh vật trong hạt kefir có thể dễ dàng lên men fructose, đồng thời hình thành các hợp chất bay hơi góp phần vào thành phần hương cho sản phẩm. Dựa trên nghiên cứu đó, người ta đã quyết định khảo sát quá trình lên men whey có bổ sung
fructose sử dụng sinh khối ướt kefir. Tỷ lệ bổ sung đường không được phép quá cao
nhằm có thể kéo dài thời gian lên men mà không thay đổi đáng kể hàm lượng ethanol
trong sản phẩm. Bồ sung lượng fructose quá cao có thể làm tăng hàm lượng ethanol trong sản phẩm; trong khi đối với sản phẩm kefir, yêu cầu của sản phẩm chỉ là thoảng mùi cồn nhẹ. Hình 4.4 thể hiện ảnh hưởng của việc bổ sung fructose với tỷ lệ 2% lên thời gian lên men.
120
Hình 4.4. Động học của qua trình lên men whey và hỗn hợp whey-fructose lên men bởi sinh khối kefir dạng viên [14].
Vì fructose là một loại đường dễ lên men men [12], nó không làm cho khoảng thời gian lên men tăng lên đáng kể. Việc bổ sung fructose lại có thể làm tăng các giá trị cảm quan trong sản phẩm như làm tăng đáng kể các sản phẩm phụ tạo hương (hình 4.5). Tương tự,
việc bổ sung dịch chiết nho có thể làm tăng hàm lượng ethanol, ethyl acetate và amyl
ancohol hình thành trong quá trình lên men lên 1%. Lượng các sản phẩm phụ dễ bay hơi này đều tăng trong quá trình lên men whey có bổ sung fructose hay dịch chiết nho, nhưng trong trường hợp bổ sung fructose, quá trình sinh tổng hợp chất thơm đạt được cao hơn bởi vì hàm lượng đường ban đầu cao hơn. Tuy vậy, phần trăm ethanl và ethyl acetate trong tổng số các hợp chất thơm của sản phẩm lại tương tự nhau. Ngược lại, phần trăm amyl ancohol trong tổng số các hợp chất thơm tạo thành trong quá trình lên men whey lại cao hơn rất nhiều lần so với sản phẩm trong quá trình lên men whey có bổ sung fructose hoặc dịch chiết nho. Do đó, giá trị cảm quan về mặt hương vị của sản phẩm lên men whey không bổ sung cơ chất sử dụng sinh khối ướt kefir có thể không đạt yêu cầu. Thời gian để lên men whey bổ sung fructose dài hơn và hàm lượng ethanol trong sản phẩm cao hơn (bảng 4.1). Ethanol ảnh hưởng đến vị của sản phẩm và có thể dẫn đến sự tạo thành vị lạ cho sản phẩm lên men.
121