và phụ thuộc môi trường [16]
Kefir không giống với các sản phẩm sữa lên men khác vì kefir được lên men bởi một hệ vi sinh vật cộng sinh trong một phức hệ - hạt kefir. Sự ổn định về giống là rất cần thiết cho việc sản xuất thức uống kefir chất lượng ở quy mô công nghiệp. Trong khi đó, việc lên men kefir từ hạt gây ra nhiều khó khăn để giữ bền vững hệ vi sinh vật trong hạt kefir.
Việc phân lập và định danh được các vi khuẩn trong hạt kefir cũng như trong sản phẩm
kefir bằng các phương pháp nhanh là một công việc quan trọng giúp điều khiển chất lượng của sản phẩm kefir. Mặt khác, việc xác định hệ vi sinh vật trong hạt kefir một cách đầy đủ sẽ giúp chúng ta biết được các hợp chất có hoạt tính sinh học được sinh tổng hợp trong hạt - tham gia một phần vào cơ chế hình thành hạt.
Nhiều vi khuẩn lactic trong hạt kefir và trong sản phẩm kefir đã được phân lập và định
danh bằng các phương pháp sinh lý và sinh hóa, bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lb.
brevis, Lb. paracasei subsp. paracesei, Lb. delbrueckii subsp., Lb. helveticus, Lb. kefiri,
Lb. kefiranofaciens, Lb. plantarum, Leuconostoc mesenteroide subsp., Streptococcus
thermophilus. Các kết quả nghiên cứu này cho thấy LAB có mặt trong các giống kefir rất
đa dạng. Với sự phát triển nhanh của sinh học phân tử, nhiều phương pháp khác nhau dựa trên bộ gen đặc trưng giúp phân loại và định danh nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Trong
các quy trình định danh vi khuẩn phổ biến, không thể dựa trên kiểu hình để hình thành
các lớp phân loại cơ bản. Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (Random Amplified Polymorphic DNA-RAPD) và đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP) được thực hiện để phân loại LAB từ các hạt kefir. Cả hai phương pháp này đều dựa trên phương pháp nuôi cấy phụ thuộc môi trường để định danh các giống đã phân lập, các giống này có thể phát triển trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc. Tuy nhiên, những nhược điểm của những phương pháp này
bao gồm khả năng tái sinh kém,các kết quả thí nghiệm không rõ ràng, tốn nhiều công sức
54 PCR-phân tích sản phẩm trên gel gradient biến tính (PCR-DGGE) dựa trên phản ứng khuếch đại rRNA và điện di sản phẩm PCR trong gel polyacrlamide có chứa chất biến tính đã được làm tăng gradient nồng độ. Gần đây, các phân tích DGGE được nhận ra là
một trong những kỹ thuật phù hợp nhất và được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu hệ vi
sinh vật trong các mẫu thực phẩm và môi trường. Việc lựa chọn cặp mồi tối ưu cho phản ứng PCR trong phân tích DGGE giúp xác định được rõ ràng các vi sinh vật mục tiêu. Sự tương đồng của cặp mồi là điểm quyết định ảnh hưởng đến kết quả của phân tích cả hệ vi sinh vật, đặc biệt là sự khác nhau của LAB. Vùng V3 của 16S rDNA là vùng mục tiêu phổ biến nhất để bắt đầu nghiên cứu một hệ vi sinh vật nào đó.
Phương pháp điện di trên gel gradient biến tính (DGGE)
Điện di trên gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE) là một kỹ thuật có khả năng phân biệt các phân đoạn DNA cùng độ dài như khác nhau về thành phần nucleotide. Trên gel DGGE, các phân đoạn DNA sợi kép bị nóng chảy không
hoàn toàn ở những vị trí khác nhau do gradient các chất biến tính, kết quả là chúng di
chuyển tới những vị trí khác nhau trên gel. Các phân đoạn DNA nóng chảy ở những vùng
nóng chảy nhất định, nghĩa là các cặp base ở đây duỗi xoắn ở nhiệt độ nóng chảy tương
ứng. Khi một vùng có nhiệt độ nóng chảy thấp nhất tiến đến nhiệt độ nóng chảy của nó ở vị trí đặc biệt trên gel gradient biến tính thì một sự biến đổi của chuỗi xoắn sẽ xuất hiện và sự di chuyển của các phân tử gần như dừng lại. Sự khác nhau của các trình tự nucleotide trong những vùng như vậy sẽ gây ra nhiệt độ nóng chảy và các trình tự khác nhau sẽ phải ngừng di chuyển ở các vị trí khác nhau trên gel.
Khi sử dụng kỹ thuật DGGE, khoảng 50% sự khác nhau của các trình tự nucleotide có thể được phát hiện trong những phân đoạn DNA có kích thước phân tử > 500 bp. Tỷ lệ này có thể tăng lên tới gần 100% nếu gắn thêm trình tự giàu GC (còn được gọi là kẹp GC)
vào một đầu của phân đoạn DNA. Một trình tự giàu guanine và cytosine được bổ sung
vào đầu 5’ của mồi PCR, sau khi tiến hành PCR, kẹp GC đó sẽ được đưa vào sản phẩm
PCR. Trình tự giàu GC này làm nhiệm vụ như là vùng nóng chảy cao để ngăn cản sự
phân tách hoàn toàn của 2 sợi DNA thành những sợi đơn. Độ dài của kẹp GC trong khoảng 30-50 bp. Những vạch DGGE có thể được quan sát dưới ánh sáng UV bằng mắt thường sau khi đã nhuộm với EtBr. Người ta cũng có thể nhuộm gel bằng nitrate bạc, nhưng không được sử dụng cho các thí nghiệp lai phân tử.
55 Trước khi phân tích DGGE của những phân đoạn DNA, phải xác định được tác động nóng chảy của phân đoạn DNA đó. Hơn nữa, để thu nhận được sự phân tích tốt nhất cần phải tối ưu hóa gradient và nhiệt độ của quy trình chạy điện di. Tác động nóng chảy của phân đoạn DNA và gradient tối ưu có thể được xác định bằng thực nghiệm với những gel gradient vuông góc. Thời gian tối ưu cho điện di được xác định bằng điện di trên gel gradient song song.
Từ những ứng dụng đầu tiên của DGGE trong nghiên cứu hệ sinh thái vi sinh vật tự
nhiên, người ta đã tìm ra nhiều ứng dụng của kỹ thuật này trong việc kiểm tra các quần thể vi sinh vật trong những khu phức tạp từ hệ thống tự nhiên đến nhân tạo. Hơn nữa kỹ thuật này tránh được khó khăn trong việc nuôi cấy – phân lập, mà đó chính là nhân tố chọn lọc rất quan trọng, vì vậy DGGE hiện được sử dụng khá phổ biến để nghiên cứu đa dạng quần thể vi sinh vật [7].
Để biết được những giới hạn của các phương pháp kiểu hình, mục đích của nghiên cứu này là tạo điều kiện thuận lợi cho phương pháp PCR-DGGE để định danh nhanh LAB và nghiên cứu sự phân bố của chúng trong cả hai phương pháp, nuôi cấy tự do và phụ thuộc môi trường trong 3 hạt kefir khác nhau. Định danh thành công các vi sinh vật tồn tại trong các giống kefir giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hình thành hạt kefir, cũng như những đặc tính thiết thực có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe con người.