Đa số carotenoid không phân cực, và điều này cho phép có thể chiết tách chúng với các dung môi hữu cơ. Hydrocarbon, ether, acetone, và rượu bậc thấp được sử dụng chủ yếu, mặc dù những dung môi có điểm sôi thấp cũng có thể được sử dụng. Dung môi được khử trùng bằng clo nên được kiểm tra cẩn thận về khả năng nhiễm acid HCl (sẽ phá hủy carotenoid). Gần đây, quá trình chiết với carbon dioxide lỏng hoặc những khí khác được sử dụng.
Vật liệu để chiết tách được cắt nhỏ hoặc ngâm, và được trích ly với acetone. Vật liệu được tách nước và trở nên dễ chiết hơn. Sau khi lọc cặn, quá trình chiết với phần aceton kế tiếp hoặc acetone chứa lượng tăng methanol đến khi dịch chiết không màu. Nếu phần còn lại vẫn còn màu, nên tiến hành một hoặc nhiều lần chiết với dầu ether hoặc hexane, hoặc hỗn hợp những chất này với acetone. Các carotenoid phân cực cao đôi khi cũng có mặt và khó trích ly, bổ sung thêm các bước trích ly với methanol sẽ dẫn đến hiệu quả tốt. Dịch chiết được cô lại dưới áp suất thấp ở nhiệt độ không quá 40ᵒC. Những sắc tố này được chiết với diethyl ether và được rửa với 10% dung dịch natri clorua và sau đó rửa lại với nước. Sau đó lớp mỏng diethyl ether được đem đi sấy khô dưới áp lực giảm , bất kỳ một vết nước nào còn lại sẽ được loại bỏ bằng việc chưng cất azeotropic với benzene/methanol. Hỗn hợp sắc tố được phân lập sẽ được hòa tan trong diethyl ether và sau đó nên được bảo quản trong khí nitơ ở nhiệt độ thấp (-30ᵒC).
Một vài loại mô thực vật có độ sáp cao và trong trường hợp này có thể loại sáp nhanh chóng với chất rửa hydrocarbon. Như vậy, dịch trước khi chiết có thể được kết hợp với dịch chiết chung ở giai đoạn sau. Dòng chiết xuất chính nên được tiếp tục như mô tả ở trên cho đến khi kết quả là không màu, tại thời điểm đó thì dịch chiết được xác định.
Toàn bộ dịch chiết trên gần như chắc chắn có chứa nước, và trong nhiều trường hợp có chất diệp lục. Nước dễ dàng được loại bỏ bằng phương pháp chưng cất azeotropic giảm áp, sử dụng lượng nhỏ methanol và benzene sau khi loại đi phần lớn dung môi chủ yếu.
31
Hầu hết các tiến trình hiện này đều bao gồm bước xà phòng hóa. Carotenoid alcohol thường xuất hiện ở hoa, quả, v.v…như chuỗi dài acid béo ester, và hỗn hợp của những hợp chất có sẵn có thể được đơn giản hóa bằng cách đưa ra các bước xà phòng hóa. Điều này nhằm mục đích loại bỏ glyceride hiện diện, do đó cho phép loại bỏ nhiều chất béo không màu.
Việc xà phòng hóa được thực hiện bằng cách đem dịch chiết sắc tố đi sấy khô ở điều kiện giảm áp, và bổ sung hỗn hợp của diethyl ether và 10% methanol kali hydroxide hoặc natri hydroxide theo tỉ lệ 1:1. Hỗn hợp này sau đó được để yên trong 6h và sau đó bổ sung một lượng diethyl ether và một lượng nước chứa 10% NaCl. Dịch chiết được cô lại, và những vết nước cuối cùng sẽ được loại bỏ bằng chưng cất azeotropic với benzene và methanol ở điều kiện giảm áp. Phần còn lại được hòa tan trong acetone hoặc diethyl ether và được bảo quản trong nitơ ở điều kiện giảm áp. Những kết tủa không màu, thường là sterol hoặc protein, có thể được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc qua lớp đệm sợi thủy tinh. Cuối cùng, những sắc tố này được hòa tan trong acetone và bảo quản ở nhiệt độ thấp. 3.3. Lọc và tách
Carotenoid có thể được tách bằng sắc ký cột, TLC và HPLC. Thỉnh thoảng, nó có thể phân lập những hợp chất chính ở trạng thái tinh khiết bằng việc kết tinh trực tiếp, ví dụ như lycopene từ trái cà chua và capsanthin từ dẫn xuất xà phòng hóa của cây ớt chuông đỏ.
3.3.1. Sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp chính để phân lập carotenoid trong nhiều năm qua, nhưng hiện nay được sử dụng để tách sơ bộ. Silica gel và nhôm được sử dụng làm pha tĩnh, nhưng có nhiều ứng dụng chuyên biệt khác cũng được tìm thấy, và magnesium oxit, canxi carbonate và sucrose được sử dụng rộng rãi. Dung môi gần như luôn là hỗn hợp của các hydrocarbon béo với các chất phân cực cao như diethyl ether, acetone và các loại alcohol, mặc dù hệ thống chứa chloroform và acetonitrile cũng được sử dụng. Phép rửa cột thường được tiến hành bằng cách sử dụng một hydrocarbon với lượng tăng acetone hoặc methanol.
3.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký trên lớp mỏng silica gel vẫn là cách đơn giản và hữu ích để tách carotenoid. Việc tách các sắc tố phổ biến có thể dễ dàng thực hiện bằng cách sử dụng các hydrocarbon, thông thường là hexane hoặc những chất phân cực như
32
acetone hoặc alcohol. Carotene di chuyển dễ dàng trong các hydrocarbon chưa thay đổi, và β-carotene di chuyển gần mặt trước của dung môi trong hệ thống và có thể được sử dụng như là chất chuẩn. Điều đó mang đến giá trị 1.00 như là giá trị Rβ. Hệ thống TLC tách các sắc tố thành các nhóm chính theo oxy mang nhóm chức năng. Carotenoid hydrocarbon được giữ lại ít nhất, và tiếp theo là mono- alcohol, diol, và sau đó là hợp chất oxy hóa poly. Nhóm epoxy có ảnh hưởng ít hơn hydroxyl trong việc giữ lại. Ứng dụng tương tự đến nhóm carbonyl trong hệ thống dựa trên acetone, nhưng những thay đổi vẫn có thể thấy được qua những ảnh hưởng này với các chất phân cực khác. Bảng 3.1 có giá trị RF thay đổi với 20% acetone, 40% acetone và 20% tert-butanol và kết quả để đáp ứng xu hướng chung được tìm thấy. Carotenoid cũng dễ dàng được tách trong phase đảo của hệ thống TLC. Giá trị RF sử dụng dung môi chứa dầu nhẹ (40-60ᵒC) – acetonitrile-methanol (20:40:40) trên lớp RP-18 cũng được trình bày trong bảng 3.1.
Tất cả các hệ thống trên có thể được sử dụng để tách carotenoid với mức độ thành công khác nhau tùy thuộc vào các hợp chất có mặt trong các trường hợp cụ thể.
Thông tin về cấu trúc có thể thu được trực tiếp từ TLC. Hơi acid hydrochloric làm thay đổi nhanh chóng màu sắc của carotenoid từ vàng đến xanh dương hoặc xanh lá cây. Các hợp chất có nhóm α- hoặc β- có thể phân biệt bằng cách phun bạc nitrate.
33
Bảng 3.1. Sắc ký lớp mỏng của carotenoid. Giá trị RF ( β-carotene = 1.00 của hệ thống 1,2 và 3, và giá trị RF cho hệ thống 4
Hệ thống 1: silica gel 60 (0.25nm, Merck, Art. 5721) 20% acetone/p.e Hệ thống 2: silica gel 60 (0.25nm, Merck, Art. 5721) 40% acetone/p.e Hệ thống 3: silica gel 60, 20% tert-butanol/p.e
Hệ thống 4: RP-18 F254, p.e.-acetonitrile-methanol (20:40:40). Dung môi tổng hợp theo thể tích, p.e. = dầu ether (40-60ᵒC).
Nguồn: a, quả Sorbus aucuparia; b, quả Solanum lycopersicum; c, thương mại; d,
Petroselinum crispum; e, hoa Taraxacum officinale.
3.3.3. Sắc ký lỏng hiệu suất cao
Sự ra đời của HPCL dẫn đến cuộc cách mạng trong việc cô lập carotenoid. HPLC được sử dụng trong phân tích carotenoid. Tính sẵn có của hệ thống HPLC, và các chế phẩm thương mại nhồi cột. Cần lưu ý rằng hầu hết hệ thống HPLC hiện nay sử dụng pha đảo vật liệu và cho phép tách nhanh chóng không những các hợp
34
chất mà còn cả các đồng phân cis/trans của chúng, và enantiomer và diastereomer là các dẫn xuất được chuẩn bị sẵn.
3.4. Đặc điểm và xác định
Quang phổ hấp thu ánh sáng khả kiến, quang phổ hồng ngoại, NMR và MS được chứng minh là vô giá trong các trường hợp cụ thể. Trong khi một kỹ thuật cụ thể có tác dụng trong một trường hợp cụ thể, kết quá tốt nhất có thể đạt được khi ta sử dụng kết hợp các phương pháp. Điều này được minh họa cụ thể trong tương quan các khía cạnh hóa học lập thể của carotenoid.
3.4.1. Phổ khả kiến và phổ hồng ngoại
Việc xác định các carotenoid được dựa trên tính chất hấp thụ ánh sáng khả kiến, và kỹ thuật này vẫn được áp dụng rộng rãi. Phổ của ba loại carotenoid được thể hiện trong hình 3.2 và minh họa rõ ràng một số tính chất riêng biệt. Việc bổ sung liên kết đôi liên hợp trong sắc thể mạch hở thay đổi 15nm, trong khi liên kết đôi liên hợp mạch vòng chỉ đến tối đa 5nm. Hiệu quả của chức năng liên hợp ketone thì thường cao hơn so với việc bổ sung liên kết đôi C-C trong cùng một vị trí.
Phổ hồng ngoại là kỹ thuật tiếp theo được giới thiệu. Hồng ngoại cho phép thể hiện trực tiếp các chức năng không liên hợp, như chức năng của alcohol và ether, và carbonyl của bất kỳ loại nào. Những phát hiện ban đầu về sự hiện diện của chức năng allene và acetylene phần lớn là do việc áp dụng phương pháp này.
35
Hình 3.2. quang phổ hấp thu thấy được của β-carotene, γ-carotene và lycopene trong dầu ether.
3.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Một lượng lớn carotenoid được kiểm tra bằng quang phổ NMR. Tuy nhiên, một vài vấn đề nổi bật được đề cập: những thay đổi trong chuỗi ngay lập tức được nhận ra, nhưng điều đó có vai trò đặc biệt trong việc tìm kiếm những nhóm kết thúc bất thường hoặc những đơn vị cấu trúc mà quang phổ NMR đi vào. Ví dụ về
36
điều này được tìm thấy trong các hợp chất như peridinin với một chuỗi không điển hình, và trong cucurbitaxanthin với một nhóm kết thúc phức tạp.
3.4.3. Khối phổ
Là phương pháp nghiên cứu bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó sau khi chuyển chúng thành trạng thái hơi rồi thành ion bằng phương pháp thích hợp. Như vậy, trong phương pháp khối phổ người ta dùng biện pháp “phá hủy” phân tử để nghiên cứu chúng. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích của khối phổ kế.
Trong môi trường MS, phân tử ion dễ dàng được xác định bởi việc mất đi 92 và 106 đơn vị khối lương, tương ứng với các yếu tố của toluene và xylene tương ứng. Mô hình bình thường của việc phân hủy cho thấy các ion do mất các chức năng hiện có, ví dụ 18 (H2O), 31 (OMe), 32 (MeOH), 43 (MeCO), 59 (MeCOO), 60 (MeCOOH) và kết quả thu được từ việc tách chuỗi liên hợp. Những tính năng không bình thường trong chuỗi liên hợp dễ dàng lộ ra bởi MS, ví dụ loroxanthin. Gần đây, lợi thế duy nhất của hệ thống LC/MS đã được sử dụng với hiệu quả tốt nhất.
3.4.4. Nghiên cứu hóa học lập thể
Việc áp dụng ORD/CD trong những điều kiện cụ thể đòi hỏi sự có mặt của những hợp chất tinh khiết để cung cấp quang phổ tốt. Việc cải tiến kỹ thuật sắc ký có thể giúp xác định các đồng phân quang học và hỗn hợp isomeric. Một ví dụ điển hình được tìm thấy trong lactucaxanthin, một đồng phân của lutein trong rau diếp.
Nghiên cứu hóa học lập thể đã chứng minh những ưu điểm tuyệt vời của kỹ thuật hiện đại, với NMR đóng vai trò quan trọng. Phương pháp xác định các đồng phân dinochrome sử dụng các NMR thực nghiệm khác nhau (DQF-COSY, NOESY, HSQC, HMBC) để tìm hiểu tính chính xác của tương quan hóa học lập thể trong mỗi phân tử. Một vài dữ liệu NOESY quan trong từ công việc này được cung cấp cho dinochrome A trong hình 3.3.
37
Hình 3.3 Cấu trúc của dinochrome A. 3.4.5. Hóa học vi lượng
Hóa học vi lượng có vai trò quan trọng trong hóa học carotenoid, mặc dù các hợp chất có tính nhạy cảm cao và tương đối ít phản ứng được áp dụng, và điều quan trọng là đã đơn giản hóa quá trinh oxy hóa và sử dụng phương pháp tạo tủa, và dẫn xuất của chức năng alcohol đến ester và ether.
3.4.6. Định lượng
Định lượng carotenoid được thực hiện dễ dàng bằng việc hấp thu ánh sáng khả kiến, cũng như trong dung dịch hoặc bằng mật độ quang trên các tấm TLC. Một yêu cầu để cho kết quả chính xác là thông tin về những hợp chất tinh khiết được đo.
38 Chương 4: VAI TRÕ CỦA CAROTENOID ĐỐI VỚI CON NGƯỜI
4.1. Vai trò của carotenoid trong việc duy trì sức khỏe con người
Carotenoid được công nhận khả năng chống oxy hóa tốt nhất , đặc biệt là trong các membrane, vì chúng là các sắc tố nằm trong màng. Hydrogen peroxide, oxy nguyên tử, nitrogen oxide, superoxide anion tác động có hại cho cơ thể bằng hai con đường nội sinh và ngoại sinh có thể được bất hoạt bởi carotenoid; trên thực tế, carotenoid được xem là chất giải độc sinh học tốt nhất của oxy phân tử (Boileau et al., 1999; Paiva & Russell, 1999), và có thể phản ứng với hầu hết các gốc tự do có thể sẽ gặp phải trong hệ thống sinh học. Các carotenoid chứa hệ thống 9 nối đôi liên hợp và chính điều này chịu trách nhiệm hấp thụ ánh sáng khả kiến tạo thành màu cam, vàng và đỏ của carotenoid – hệ thống 9 liên kết đôi liên hợp – cũng được tìm thấy trong huyết thanh người và trong mô. Một tính năng thứ hai phổ biến trong chế độ ăn uống carotenoid được hấp thụ bởi con người (và có thể được tìm thấy trong mô và huyết thanh người) là một vòng β-ionone thay thế ở cuối của chuỗi liên kết đôi liên hợp (Boileau et al., 1999).
Khoảng 50 loại carotenoid được xác định trong khẩu phần ăn của con người, và 34 loại được xác định trong huyết thanh người. β-carotene, lycopene, và lutein là những carotenoid phổ biến nhất trong chế độ ăn, và cũng thường xuyên được phát hiện trong mô và huyết thanh, mặc dù nồng độ khác nhau (Khachik et al., 1997). β-carotene được nghiên cứu nhiều nhất, và là carotenoid phổ biến nhất trong khẩu phần ăn ở hầu hết các nước; tuy nhiên, lycopene thì nhiều hơn ở Mỹ. Nồng độ carotenoid trong huyết thanh được trình bày (trong một đơn vị nồng độ µmol/l: lycopene 0.13-0.82; lutein + zeaxanthin, 0.16-0.72; β-carotene, 0.09-0.91; β-cryptoxanthin 0.05-0.38; α- carotene 0.02-0.22 ) có thể liên quan với giới tính, lối sống và các yếu tố sinh lý (Boileau et al., 1999).
Độ dài chuỗi polyene của phân tử carotenoid tương quan với khả năng loại oxy nguyên tử hiệu quả, trong đó lycopene hiệu quả nhất trong các loại carotenoid. Carotenoid cũng có thể bảo vệ tế bào khỏi tác hại oxy hóa bằng cách sử dụng cơ chế thay thế. β-carotene có thể chấm dứt quá trình oxy hóa chất béo như một chất chống oxy hóa; cả β-carotene và lutein bảo vệ tế bào khỏi quá trình peroxyl hóa và tổn thương màng bằng cách làm giảm lactate dehydrogenase của tế bào.
39
Carotenoid thoát ra từ thức ăn do động tác nhai, hoạt động của dạ dày và men tiêu hóa (Deming & Erdman, 1999). Carotenoid là các lipid không phân cực không thể hòa tan trong dung môi là nước, sự hấp thụ trong đường ruột con người xảy ra nhờ sự hiện diện của acid mật và hình thành micelle, và các micelle khuếch tán qua tế bào thành ruột. Bởi vì chất béo trong ruột non kích thích tiết mật từ túi mật của bàng quang (tăng kích thước và tính ổn định của các micelle), chế độ ăn uống hấp thu chất béo giúp nâng cao sự hòa tan và hấp thu carotenoid. Sau đó vận chuyển carotenoid trong huyết thanh xảy ra trong lipoprotein, với nhiều carotenoid phân cực như xanthophyll, và carotenoid hydrocarbon như β-carotene trong lõi kỵ nước (Parker, 1996).
Kể từ khi kết hợp được với các thành phần khác như protein, hoạt tính sinh học của chúng thay đổi. Hoạt tính sinh học tương đối được ước tính ít hơn 10% (nguyên liệu các loại rau tươi) đến hơn 50% khi chuẩn bị trong dầu. Carotenoid có trong tất cả các cấu hình trans trong rau quả tươi, nhưng quá trình chế biến có thể thúc đẩy quá trình isomer hóa, và các đồng phân khác xuất hiện trong các chất chuyển hóa thu hồi sau khi uống. Lycopene được tiêu thụ chủ yếu ở dạng trans trong thực phẩm, nhưng được phát hiện gần như duy nhất đồng phân cis trong các mô của người (Boileau et al., 2002; Platz et al., 2003). Các đồng phân cụ thể liên quan đến các phản ứng sinh học khác nhau, từ đó cung cấp hiểu biết về nguy cơ hoặc quá trình phát sinh bệnh.
Mặc dù nhiệt và quá trình chế biến thực phẩm có xu hướng tăng hoạt tính sinh hoc