Nghiên cứu quy trình ủ bã sắn với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 để thủy phân tinh bột và cellulose

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ Ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT .... Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến quá trình thủy phân tinh bột .... ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CEL



NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH Ủ BÃ SẮN VỚI CHỦNG VI

KHUẨN BACILLUS SUBTILIS C7 ĐỂ THỦY PHÂN

hiệu trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Thực Phẩm, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền dạy những kiến thức quý giá cho em trong suốt quá trình học tại trường

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Minh Trí và Th.S Phạm Hồng Ngọc Thùy đã hết lòng hướng dẫn, động viên, quan tâm và ủng hộ em hoàn thành đồ án

Em xin gửi lời cảm ơn đến các giáo viên và các bạn tại phòng thí nghiệm Hóa-Vi sinh, Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sinh_Đại học Nha Trang đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Xin gởi lời cám ơn chân thành nhất đến bạn bè và tập thể lớp 51TP-2 đã luôn quan tâm và giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến gia đình đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 10

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY SẮN 10

1.1.1.Phân loại sắn 10

1.1.2.Đặc điểm cấu tạo và thành phần hóa học của củ sắn 11

1.1.2.1.Cấu tạo của củ sắn 11

1.1.2.2.Thành phần hóa học của củ sắn 12

1.1.3.Các sản phẩm được sản xuất từ sắn 14

1.1.3.1.Tinh bột sắn 14

1.1.3.2.Sản phẩm khác 15

1.1.4.Tình hình sản xuất tinh bột sắn trên thế giới và Việt Nam 16

1.1.4.1.Tình hình sản xuất tinh bột sắn trên thế giới 16

1.1.4.2.Tình hình sản xuất tinh bột sắn ở Việt Nam 17

1.1.4.3.Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn hiện nay 19

1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS 21

1.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis 21

1.2.2 Một số nghiên cứu trong nước và thế giới 23

1.3 TỔNG QUAN VỀ AMYLASE VÀ CELLULASE 24

1.3.1 Amylase 24

1.3.1.1 Giới thiệu về tinh bột 24

1.3.1.2 Giới thiệu về amylase 25

1.3.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp amylase từ vi sinh vật 27

1.3.2 Cellulase 29

1.3.2.1 Giới thiệu về cellulose 29

1.3.2.2 Giới thiệu về cellulase 30

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 33

2.1.1 Bacillus subtilis C7 33

2.1.2 Bã sắn 33

2.1.3 Đậu nành 33

2.1.4 Cám gạo 33

2.1.5 Rỉ đường 33

2.1.6 Các hóa chất 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.2.1 Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài 34

2.2.1.1 Xác định hàm lượng cellulose 34

2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường khử: phương pháp Miller 34

2.2.1.3 Xác định hàm lượng tinh bột 34

2.2.1.4 Xác định hoạt độ cellulase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải 35

2.1.1.5 Xác định hoạt độ amylase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải 35

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 35

2.2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 35

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ 37

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ 38

2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước bổ sung 39

2.2.3.5 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường 40

2.2.3.6 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đậu nành bổ sung 41

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 43

2.2.5 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT 44

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân cellulose 44

3.1.1.1 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ cellulase 44

3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất thủy phân cellulose 45

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân tinh bột 46

3.1.2.1 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ amylase 46

3.1.2.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất thủy phân tinh bột 47

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ Ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT 48

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến quá trình thủy phân cellulose 48

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hoạt độ cellulase 48

3.2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất thủy phân cellulose 49

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến quá trình thủy phân tinh bột 50

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hoạt độ amylase 50

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân tinh bột 52

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT 53

3.3.1 Ảnh hưởng của độ ẩm đến quá trình thủy phân cellulose 53

3.3.1.1 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ cellulase 53

3.3.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hiệu suất thủy phân cellulose 54

3.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến quá trình thủy phân tinh bột 55

3.3.2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ amylase 55

3.3.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hiệu suất thủy phân tinh bột 56

3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE 57

3.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt độ cellulase 57

3.4.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hiệu suất thủy phân cellulose 58

3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ ĐẬU NÀNH ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT 59

3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến quá trình thủy phân cellulose 59

3.5.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hoạt độ cellulase 59

3.5.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hiệu suất thủy phân cellulose 60

3.5.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến quá trình thủy phân tinh bột 61

3.5.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hoạt độ amylase 61

3.5.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hiệu suất thủy phân tinh bột 62

3.6 QUY TRÌNH Ủ BÃ SẮN VỚI CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS C7 ĐỂ THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT 63

3.6.1 Sơ đồ quy trình ủ bã sắn với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 để thủy phân cellulose và tinh bột 63

3.6.2 Thuyết minh quy trình 63

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 65

4.1 KẾT LUẬN 65

4.2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 69

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh cây sắn và củ sắn 4

Hình 1.2 Quy trình sản xuất tinh bột sắn 7

Hình 1.3 Hình ảnh bã sắn 12

Hình 1.4 Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần 15

Hình 1.5 Cấu trúc tinh bột 17

Hình 1.6 Cấu tạo amylase 19

Hình 1.7 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 22

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử cellulose 23

Hình 1.9 Cơ chế tác dụng của cellulase lên cellulose 25

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu tổng quát 28

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ 30

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ 31

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước bổ sung 32

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường 33

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đậu nành bổ sung 35

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ cellulase 37

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất thủy phân chất cellulose 38

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ amylase 39

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất thủy phân tinh bột 40

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hoạt độ cellulase 42

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ tới hiệu suất thủy phân cellulose 43

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hoạt độ amylase 44

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất thủy phân tinh bột 45

Hình 3.9 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ cellulase 46

Hình 3.10 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hiệu suất thủy phân cellulose 47

Hình 3.11 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ amylase 48

Hình 3.12 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hiệu suất thủy phân tinh bột 49

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt độ cellulase 50

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hiệu suất thủy phân cellulose 51

Hình 3.15 Ảnh hưởng của độ tỷ lệ đậu nành đến hoạt độ cellulase 52

Hình 3.16 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hiệu suất thủy phân cellulose 53

Hình 3.17 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hoạt độ amylase 54

Hình 3.18 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến hiệu suất thủy phân tinh bột 55

Hình 3.19 Sơ đồ quy trình ủ bã sắn với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 56

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của củ sắn 6 Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng của thế giới từ năm 1995-2008 10 Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam giai đoạn

1995 - 2008 11

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới, sắn là cây lương thực đứng thứ 3 sau lúa gạo và ngô, là cây dễ chăm sóc và chịu hạn tốt, năng suất ổn định và ít sâu bệnh Sắn thường được trồng ở những vùng đất bạc màu, những nơi đất trống, đồi trọc mà ở đó những cây lương thực khác không phát triển được Cho nên sắn góp phần quan trọng vào việc phủ xanh đất trống đồi trọc và tham gia đắc lực vào quá trình chuyển dịch cơ cấu kinh tế, đặc biệt là vùng trung du miền núi

Sản phẩm của cây sắn được sử dụng trong nhiều lĩnh vực kinh tế và đời sống Sắn là nguồn lương thực trực tiếp cho con người và làm thức ăn gia súc, ngoài ra còn

là nguồn nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp khác như: công nghiệp dược, may mặc, thực phẩm,…Giá trị đích thực của cây sắn được tăng lên sau khi chế biến

Trong quá trình sản xuất tinh bột sắn một số lượng lớn bã sắn sau khi tách lấy tinh bột được phơi làm thức ăn gia súc và một phần được thải ra môi trường Trong

bã sắn vẫn chứa tinh bột, protein Tuy nhiên trong bã sắn có chứa hàm lượng glucozit như metylgucozit, linamarin… gây ngộ độc và hàm lượng cellulose, phytate cao khiến vật nuôi không hấp thu được chất dinh dưỡng Đã có một số nghiên cứu, ứng dụng quy mô nhỏ, mô hình phòng thí nghiệm hay phương pháp thủ công như lên men, bổ sung vi khuẩn lactic vào bã sắn giúp cho vật nuôi hấp thụ tốt hơn

Xuất phát từ mục tiêu nâng cao giá trị sử dụng cho bã sắn để làm thức ăn cho

gia súc nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis và được sự hướng dẫn của TS Nguyễn

Minh Trí em tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu quy trình ủ bã sắn với

chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 để thủy phân tinh bột và cellulose”

Nội dung nghiên cứu:

 Nghiên cứu các thông số chính của quy trình ủ bã sắn với chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis C7 để mức độ thủy phân tinh bột và cellulose cao nhất

 Đề xuất quy trình ủ bã sắn

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp cho ngành khoa học thức ăn chăn nuôi những thông tin cơ bản và hệ thống về phương pháp nghiên cứu khả năng

thủy phân tinh bột và cellulose của chủng vi khuẩn Bacillus subtis C7 trên môi

trường bã sắn Những thông tin này có thể được dùng để tham khảo cho các đề tài ứng dụng và các đề tài cùng lĩnh vực

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Việc sử dụng bã sắn làm thức ăn cho heo sẽ làm giảm giá thành thức ăn hỗn hợp và nâng cao hiệu quả chăn nuôi Vấn đề môi trường đối với trong sản phẩm

thừa sẽ được giải quyết một phần làm hạn chế ô nhiễm ở khu chế xuất

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY SẮN

1.1.1 Phân loại sắn

Sắn là loại cây lương thực có nhiều tinh bột được trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, do có nhiều ưu thế hơn so với các loại cây khác: Sắn rất dễ trồng có thể thích ứng với nhiều nguồn đất, đặc biệt là đất đồi, khí hậu ôn đới và nhiệt đới

ít công chăm sóc mà lại cho năng suất và giá trị kinh tế cao [8]

Phân loại sắn: có rất nhiều cách để phân loại sắn phụ thuộc vào đặc điểm, thời gian sinh trưởng, hàm lượng độc tố… Nhưng nói chung về ý nghĩa kinh tế và tính chất công nghệ trong sản xuất tinh bột thì sắn được chia làm 2 loại chính là sắn đắng

và sắn ngọt Cách chia này phụ thuộc vào hàm lượng bột và độc tố trong củ sắn [5] Sắn đắng (Manihot utilysma) hay còn gọi là sắn dù, sắn say Sắn đắng cây thấp (cây cao không quá 1m), nên ít bị đổ do bão, đốt ngắn, thân cây khi non có màu xanh nhạt, có vỏ gỗ màu nâu sẫm, thịt củ có màu trắng, có hàm lượng tinh bột cao Tuy nhiên hàm lượng độc tố trong sắn cũng khá cao nên khi ăn tươi, luộc, nấu dễ gây ngộ độc

Sắn ngọt (Manihot dulcis), gồm các loại như: sắn vàng, sắn trắng… Có hàm lượng độc tố thấp, về hàm lượng tinh bột biến đổi mạnh giữa các giống sắn Mỗi loại sắn có đặc điểm riêng để phân biệt Sắn vàng hay còn gọi là sắn nghệ, khi non

có màu xanh thẫm, cuống lá có màu đỏ sọc nhạt, vỏ gỗ của củ có màu nâu, vỏ cùi trắng, thịt củ lại có màu vàng nhạt Sắn đỏ có hàm lượng tinh bột thấp nhất chiếm khoảng 20% sắn đỏ có thân cây thấp, khi nhỏ thân có màu xanh thẫm, cuống và gân lá có màu đỏ thẫm, củ dài, to, vỏ gỗ màu nâu đậm, vỏ cùi dày, màu hơi đỏ, thịt củ trắng Sắn trắng thân cao, khi non màu xanh nhạt, cuống lá màu đỏ, củ ngắn và mập, vỏ gỗ màu xám nhạt, thịt củ và vỏ cùi trắng Nói chung so với sắn đắng thì sắn ngọt có hàm lượng tinh bột thấp hơn nhưng ít độc tố nên có thể ăn tươi không bị ngộ độc, dễ chế biến [5]

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo và thành phần hóa học của củ sắn

1.1.2.1 Cấu tạo của củ sắn [5]

Sắn là loại rễ củ có lõi nối từ thân dọc theo củ đến đuôi củ, củ sắn thường vót hai đầu, kích thước củ dao động trong khoảng khá rộng; chiều dài 0,1÷1m đường kính 2÷8cm tùy thuộc vào giống, điều kiện canh tác, chất đất Đường kính của củ không đều theo chiều dài củ, đầu cuống củ to và nhiều xơ còn đuôi củ nhỏ vuốt và mềm, ít xơ hơn do phát triển sau

Cấu tạo của củ sắn gồm 4 phần chính:

Vỏ gỗ: hay còn gọi là vỏ lụa là lớp bao bọc ngoài cùng của củ sắn, dài khoảng 0,2÷0,6mm, thường chiếm từ 0,5÷3% khối lượng toàn củ sắn Lớp vỏ gỗ dày gồm những tế bào sít, thành dày được cấu tạo chủ yếu từ cellulose và hemicellulose không chứa tinh bột có tác dụng bảo vệ củ sắn khỏi bị tác động của các yếu tố bên ngoài làm hư hỏng, đồng thời có tác dụng phòng mất nước cho củ Trong sản xuất tinh bột lớp vỏ gỗ được loại bỏ

Vỏ cùi: hay vỏ thịt nằm trong lớp vỏ gỗ, lớp vỏ cùi dày hơn lớp vỏ gỗ (khoảng 1÷3mm) chiếm 5÷20% trọng lượng củ Cấu tạo gồm các lớp tế bào mô cứng phủ ngoài, thành phần chủ yếu của lớp này là cenlulose, pectin, tinh bột và chứa nhiều dịch độc khác từ bên ngoài Bên trong lớp tế bào mô cứng là lớp tế bào

mô mềm chứa các hạt tinh bột, nếu không tách thì chế biến khó khăn vì nhiều chất trong mủ ảnh hưởng tới màu sắc của tinh bột

Hình 1.1 Hình ảnh cây sắn và củ sắn

Thịt củ: phần quan trọng nhất của củ sắn chiếm khoảng 77÷94% khối lượng toàn củ sắn Thịt sắn khi mới đào dỡ có màu trắng mịn, nếu bị sây sát hay bảo quản lâu sẽ chuyển sang màu vàng Lớp ngoài cùng của củ sắn là lớp sinh gỗ chỉ mỏng Với củ phát triển bình thường, thu hoạch đúng vụ thì tầng sinh gỗ chỉ xuất hiện khi luộc, còn với củ đào muộn thì thấy rõ hơn Tiếp trong phần sinh gỗ là thịt sắn, gồm các tế bào nhu mô thành mỏng là chính, chứa các hạt tinh bột, nguyên sinh chất, gluxit hòa tan, một lượng nhỏ protein, lipit, các chất khoáng, vitamin và một số enzyme, đây là phần dự trữ chủ yếu các chất dinh dưỡng của củ Trong tế bào thịt củ sắn cũng chứa dịch bào nhưng hàm lượng ít hơn so với trong vỏ cùi (khoảng 0,3÷5%) Ngoài các tế bào nhu mô, trong thịt sắn còn có các tế bào thành cứng mà các thành phần chủ yếu cellulose nên cứng như gỗ gọi là xơ không chứa tinh bột Các tế bào này tạo thành những lớp xơ, thường có nhiều ở đầu cuống Đặc biệt ở sắn lâu năm sẽ hình thành các vòng xơ, mỗi năm một vòng, sắn càng lâu năm cho hiệu suất tinh bột càng thấp Hàm lượng tinh bột phân bố trong lớp thịt sắn không đều, lớp thịt càng gần vỏ hàm lượng tinh bột càng cao, càng gần lõi hàm lượng tinh bột càng thấp

Lõi sắn: Thường nằm ở trung tâm của củ và chạy suốt từ đầu cuống tới đuôi

củ, càng sát cuống thì lõi càng lớn và nhỏ dần về phía đuôi củ Lõi sắn chiếm khoảng 0,3÷1% khối lượng toàn củ sắn Lõi sắn có thành phần chủ yếu là cellulose và một lượng rất nhỏ tinh bột, lõi có chức năng lưu thông nước, chất dinh dưỡng giữa cây và củ

vào tháng 12 và tháng 1 thì hàm lượng tinh bột cao nhất Tháng 9, tháng 10 củ ít tinh bột, hàm lượng nước cao, lượng chất hòa tan lớn, sắn non không chỉ cho hiệu suất thu hồi tinh bột thấp mà còn khó bảo quản tươi Ngược lại thu hoạch vào tháng 3, tháng 4 hàm lượng tinh bột lại giảm vì một phần tinh bột bị phân hủy thành đường để nuôi mầm non khi cây chưa có khả năng quang hợp

Đường: Trong bã sắn chiếm 1,0÷3,1%, chủ yếu là glucose và một ít maltose, saccarose Sắn càng già thì hàm lượng đường càng giảm Trong khi chế biến đường hòa tan trong nước ra theo nước thải

Protein: Protein của củ sắn tới nay chưa được nghiên cứu kỹ vì hàm lượng thấp nên ít ảnh hưởng tới quy trình công nghệ Do đặc điểm nghèo protein, ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới chủ yếu sử dụng sắn để sản xuất tinh bột và protein được thải ra chất thải làm hôi thối gây ô nhiễm môi trường

Độc tố: Trong sắn củ tươi có chứa một lượng hợp chất glucozit linamarin (C10H17O6) nhất là khi củ chưa được thu hoạch bản thân hợp chất này không độc nhưng khi trong môi trường acid (như trong dạ dày sau khi ăn hay trong dịch sản xuất tinh bột) bị phân hủy và giải phóng ra acid HCN là chất độc một lượng nhỏ cũng đủ gây chết người (lượng HCN có thể gây chết người là 1mg/1kg cơ thể)

Độc tố tập trung ở vỏ cùi và dễ hòa tan trong nước, vì vậy khi ăn tươi nên bóc vỏ cùi và ngâm trong nước khoảng 2÷3 giờ để loại độc tố

Trong sản xuất tinh bột, HCN phản ứng với Fe thường có trong nước tạo thành xianat có màu xám đen, do đó không tách dịch nước ra nhanh sẽ ảnh hưởng đến màu sắc tinh bột, làm giảm chất lượng thành phẩm

Sắn bị chảy nhựa sẽ ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sắn cũng như quy trình công nghệ trong quá trình sản xuất tinh bột sắn Sau khi luộc sắn ăn thì bị sượng

1.1.3 Các sản phẩm được sản xuất từ sắn

1.1.3.1 Tinh bột sắn

Cấp nhiệt (lò đốt sử dụng dầu FO)

Hình 1.2 Quy trình sản xuất tinh bột sắn

Nguyên liệu Chà và rửa củ Nước Băm, nghiền/nạo củ

Cô đặc để thu tinh bột có độ ẩm 35-40%

Sấy khí động

Sữa tinh bột sắn Phân ly tách tinh bột

Làm nguội Không khí Rây mịn

Đóng bao Sản phẩm

Trong quá trình sản xuất tinh bột sắn sẽ thải ra một lượng lớn bã sắn bao gồm hai loại:

 Loại thứ nhất là bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ, chiếm tỉ trọng ít và thành phần chủ yếu là cellulose, hemicellulose, cát và sạn Loại này thường được chôn lấp hợp vệ sinh hoặc dùng làm phân bón

 Loại thứ hai là phần bã còn lại sau khi tách tinh bột sắn được gọi là bã sắn Trong loại bã này có chứa phần lớn là cellulose và một phần tinh bột còn sót

lại Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng chủng Bacillus subtilis C7 để chuyển

các thành phần này thành các hợp chất đơn giản và dễ hấp thụ cho gia súc

Tinh bột sắn được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và ngoài thực phẩm

1.1.3.2 Sản phẩm khác

Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và lương thực thực phẩm Củ sắn dùng để ăn tươi, làm thức ăn gia súc, chế biến sắn lát khô, bột sắn nghiền, tinh bột sắn, tinh bột sắn biến tính, các sản phẩm từ tinh bột sắn như bột ngọt, cồn, maltodextrin, lysine, acid citric, xiro glucose và đường glucose tinh thể, mạch nha giàu maltose, hồ vải, hồ giấy, phủ giấy, bìa các tông, bánh kẹo, mì ăn liền, bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai, bánh tráng, hạt trân châu, phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm, sản xuất màng phủ

sinh học, chất giữ ẩm

Thức ăn gia súc: do sự thiếu hụt trầm trọng các loại thức ăn cho gia súc, các công thức dựa trên sắn đã được nghiên cứu phát triển Thức ăn gia súc từ sắn được làm giàu bằng các nguồn protein truyền thống và phi truyền thống

Các sản phẩm phi truyền thống: giá xăng dầu tăng nhanh dẫn đến việc phát triển các loại xe chạy bằng cồn ở nhiều nước trên thế giới Sắn được coi là một trong những loại nguyên liệu dùng để sản xuất cồn nguyên liệu Ngoài ra, cồn sản xuất từ cây sắn sẽ giải quyết vấn nạn thiếu cồn ở nhiều nước trên thế giới

1.1.4 Tình hình sản xuất tinh bột sắn trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1 Tình hình sản xuất tinh bột sắn trên thế giới

Sắn là cây lương thực quan trọng ở nhiều nước trên thế giới Sắn có xuất

xứ từ Trung-Nam Mỹ, sau đó được phát triển sang Châu Phi và Châu Á Hiện nay có trên 100 nước trồng sắn với diện tích khoảng 16 triệu ha, tổng sản lượng 155÷170 triệu tấn/năm tập trung ở những nước có khí hậu nhiệt đới (từ 300 vĩ nam tới 300 vĩ bắc) [5]

Sắn được dùng làm thức ăn lương thực cho người và thức ăn gia súc là chủ yếu: 58% được sử dụng làm lương thực, 28% làm thức ăn gia súc, 3% dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp (như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp chế biến hàng tiêu dùng, công nghiệp hóa dược phẩm…), 15% sản lượng còn lại được sản xuất sang các nước Châu Âu, một số nước Châu Á và Nhật Bản dưới dạng tinh bột sắn, sắn ép viên, sắn lát khô…[5]

Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều hướng gia tăng từ năm 1995 đến nay (Bảng 1.2 dưới đây) Năm 2008, sản lượng sắn thế giới đạt 238,45 triệu tấn củ tươi so với 223,75 triệu tấn năm 2007 và năm 1995 là 161,79 triệu tấn Nước sản xuất sắn nhiều nhất là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn) Nước có năng suất sắn cao nhất là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,87 tấn/ha (FAO, 2008) Việt Nam đứng thứ mười

về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn)

Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng

(Nguồn: Trần Công Khanh tổng hợp từ FAOSTAT qua các năm)

1.1.4.2 Tình hình sản xuất tinh bột sắn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây sắn đã chuyển đổi vai trò từ cây lương thực thành cây công nghiệp với tốc độ cao, năng suất và sản lượng sắn đã tăng nhanh ở thập kỷ đầu của thế kỷ XXI (Bảng 1.3) Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ

Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh của các vùng sinh thái nông nghiệp Diện tích, năng suất và sản lượng sắn Việt Nam qua các năm và phân theo các vùng sinh thái được thể hiện qua Bảng 1.3 Diện tích sắn

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng của thế giới từ năm 1995-2008

nhiều nhất ở vùng Bắc Trung bộ và Duyên hải miền Trung (168,80 ngàn ha) Tây Nguyên là vùng sản xuất sắn lớn thứ hai của cả nước, tập trung chủ yếu ở bốn tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đăk Lăk và Đăk Nông Năm 2008, diện tích sắn của Tây Nguyên đạt 150,100 ha, nhưng năng suất bình quân chỉ đạt 15,7 tấn/ha, tổng sản lượng 2,35 triệu tấn, thấp hơn rất nhiều so với năng suất và sản lượng sắn của vùng Đông Nam Bộ (23,74 tấn/ha và 2,69 triệu tấn) (Tổng cục thống kê, 2009)

(nghìn ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

(Nguồn: Trần Công Khanh tổng hợp từ Niên giám thống kê qua các năm)

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam giai đoạn 1995 - 2008

Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm nhìn đến năm 2020 Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô

và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi

và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính Diện tích sắn của Việt Nam

dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái [24]

1.1.4.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn hiện nay

Bã sắn được thải ra trong quá trình sản xuất tinh bột và tập trung nhiều tại Đồng Nai, Gia Lai, Tây Ninh và Bình Phước Theo ước tính, một nhà máy chế biến có công suất 30÷100 tấn/ngày thì sẽ sản xuất được 7,5÷25 tấn tinh bột, kèm theo đó là 12÷48 tấn bã Thứ phế thải này thường được phơi khô thành từng luống trắng xoá trên đồng ruộng và dùng để bổ sung cellulose cho gia súc, gia cầm Tuy nhiên, do khó tiêu và không mùi nên bã sắn không hấp dẫn đối với vật nuôi Nếu trời mưa vài ngày thì bã sắn thối rữa, bốc mùi hôi thối Đến khi trời nắng lên thì nấm mốc độc hại phát triển và theo gió phân tán khắp nơi, ảnh hưởng tới môi trường và sức khoẻ con người

Hình 1.3 Hình ảnh bã sắn b

(a) Bã sắn tươi (b) Bã sắn khô

a

Hiện nay, bã sắn tại các nhà máy sản xuất tinh bột sắn được bán cho các doanh nghiệp hoặc người dân chăn nuôi nhỏ với giá rất rẻ khoảng 800 đồng/kg bã tươi và 2000 đồng/kg bã khô Với giá thành như vậy thì việc sử dụng bã sắn để sản xuất các sản phẩm khác là hoàn toàn thuận lợi, vừa giải quyết được vấn đề môi trường, vừa tăng thêm giá trị sử dụng và kinh tế cho bã sắn

Bã sắn được sử dụng để sản xuất ra các sản phẩm sau:

• Thức ăn cho động vật nhai lại

• Sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao từ bã sắn

• Sản xuất cồn sinh học

• Tạo chất dính cho sản xuất diêm

• Dùng làm phân bón

• Sản xuất ethanol sinh học

Bã sắn là dạng phế liệu của ngành công nghiệp sử dụng các nguyên liệu nông nghiệp có sản lượng lớn và phổ biến trên thế giới Nền công nghiệp sản xuất tinh bột sắn ở một số nước đã đạt đến con số hàng nghìn tấn sắn củ mỗi ngày, đồng nghĩa với việc thải ra hàng trăm tấn bã sắn mỗi ngày Đây có thể là vấn nạn của môi trường nếu không có biện pháp xử lý Hiện nay, nhờ sự phát triển của ngành công nghệ sinh học mà nguồn phế liệu này đang có xu hướng trở thành nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác và ngày càng có nhiều nghiên cứu tập trung đến vấn đề này Một số nghiên cứu tiêu biểu như:

Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả và Bùi Văn Lợi (2009) [16] đã tiến hành khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại Kết quả cho thấy ủ chua là biện pháp phù hợp để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ Hàm lượng HCN giảm đáng kể sau 21 ngày ủ nên có thể sử dụng một lượng lớn

bã sắn ủ trong khẩu phần cho gia súc nhai lại mà không gây ngộ độc

Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) và Nguyễn Kiều Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) [14] đã sử dụng chế phẩm vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi

trường Nông nghiệp cung cấp (thành phần chính gồm xạ khuẩn, nấm men, vi khuẩn với hoạt tính phân giải cellulose, tinh bột và phân giải phosphatase khó tan), sau đó cho ủ cùng bã sắn theo phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm các nguyên liệu phụ như rỉ mật, ure, kali, super lân, vôi bột để làm thức ăn cho gia súc

Trên thế giới, một số nước nhờ sự tiến bộ, phát triển của khoa học công nghệ sinh học đã ứng dụng các tiềm năng sinh học vào quá trình nâng cao giá trị cho các phế liệu của ngành nông - công nghiệp như bã sắn, bã cà phê, bã táo ép, bã đậu nành, Một số công trình nghiên cứu điển hình như:

S.Gaewchingduang và P Pengthemkeerati (2010) [20] đã chỉ ra các biện pháp

xử lý bã sắn nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa thành đường khi thủy phân bã sắn bằng enzyme và bằng acid Kết quả cho thấy khi thủy phân bã sắn bằng enzyme thì xử lý nhiệt ở 1300C trong 30 phút sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi đường, trong khi đối với thủy phân bằng acid là 1200C trong 60 phút

Ở Việt Nam, bã sắn chủ yếu sử dụng để làm thức ăn gia súc trực tiếp, ủ chua hay phơi khô nhưng chất lượng không cao Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tận dụng và nâng cao chất lượng bã sắn từ quá trình sản xuất tinh bột thủ công hoặc bán công nghiệp bằng cách dùng men thuốc bắc, sau 12 ngày lên men có thể tăng tỷ lệ protein của bã sắn lên tới 8 - 9 lần, trung bình tăng 4 - 5 lần

Năm 1995, Nguyễn Thị Xuân Sâm dùng hỗn hợp hai giống Phanerochaete

chrysosporium và Endomycopsis fibuligera để lên men trong môi trường 70% bã sắn,

30% chất dinh dưỡng đã thu được chế phẩm có hàm lượng protein 15-17%, không chứa độc tố và đã được thử nghiệm làm thức ăn cho gia súc có hiệu quả

Năm 1995, Nguyễn Thạc Hoà cũng sử dụng hai chủng trên để lên men trên môi trường gồm bã sắn 75-80%, cám gạo 15-20% và các muối vô cơ bổ sung làm thức ăn gia súc

1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS

1.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis

Bacillus là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que (hay còn được gọi là

trực khuẩn) thuộc về họ Bacillaceae bộ Bacillales lớp Bacilli ngành Firmicules

và giới Bacteria Chúng sống ở khắp nơi trong tự nhiên và có khả năng sinh

bào tử [23]

Bacillus là vi khuẩn Gram dương tính và catalase dương tính, sử dụng khí

oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Qua

kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn

những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu [23]

Các loài Bacillus sp đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật

quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men bia hiện đại, đến sinh học phân tử, y - dược chữa các bệnh hiểm nghèo,

mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu

Chính vì vậy đã có nhiều nghiên cứu sâu về Bacillus sp cũng như mở rộng ứng

dụng của chúng đối với đời sống con người

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị

khí không bắt buộc, catalase dương tính Loài này có mặt ở khắp mọi nơi trong

tự nhiên: trong đất, nước, không khí và tồn tại cả trong những môi trường sống khắc nghiệt, nhưng dễ tìm thấy trong đất và trong các chất hữu cơ bị thối rữa Đây là loài vi khuẩn có khả năng tạo bào tử trong điều kiện môi trường có nhiệt

độ cao và khô [4]

Hình 1.4 Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis

dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần

Bacillus subtilis: khuẩn lạc khô, không màu hay có màu xám nhạt, trắng, hơi

nhăn hay tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch Trực khuẩn ngắn nhỏ kích thước từ 3÷5x0,6 nhiều khi nối lại thành sợi dài, ngắn khác nhau và có thể đứng riêng

rẽ Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36÷500C, tối đa là 600C Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao, có hình bầu dục, phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm

Bacillus subtilis là chủng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại

bào như protease, amylase, phytase, cellulase có giá trị kinh tế, thương mại cao nên được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm

1.2.2 Một số nghiên cứu trong nước và thế giới

Bacillus subtilis ngày càng cho thấy vai trò của chúng trong các ngành công

nghiệp như dệt, thuộc da, thực phẩm, y học , bằng chứng là có rất nhiều công

trình nghiên cứu về Bacillus subtilis công bố khả năng sinh enzyme ngoại bào và

việc sử dụng các loại enzyme này vào mục đích thương mại cho các ngành công

nghiệp Một số công trình nghiên cứu tiêu biểu về Bacillus subtilis:

Vũ Văn Ngữ (1982) và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm

Coli_subtly (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu

chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt [11]

Norio Kimura Yokohamo (1940) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm Bacillus

subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergilus flavus, Aspergillus paraciticu [19]

Sự bổ sung 0,02% canxi (10 mM) hoặc peptone (1%) và chiết xuất nấm men (0,5%) cùng 2% nguồn tinh bột hòa tan như là nguồn cacbon duy nhất cũng đã cải

thiện sự tăng trưởng và tổng hợp amylase của chủng Bacillus chịu nhiệt bởi

Suman S and Ramesh K (2010)

Shaista Kokab và cộng sự (2003) đã sử dụng vỏ chuối cắt nhỏ trong môi trường rắn (SSF) để khảo sát quá trình lên men sinh tổng hợp α - amylase từ

Bacillus subtilis [22]

1.3 TỔNG QUAN VỀ AMYLASE VÀ CELLULASE

1.3.1 Amylase

1.3.1.1 Giới thiệu về tinh bột

Tinh bột là một phức hợp polyme của amylose (20-30%) và amylopectin 80%) Đây là hai α-polysaccarit Chúng đều có gốc α-D-glucose tạo nên, nhưng tính chất hóa học lại khác nhau

(70-Amylose có khối lượng phân tử tương đối thấp (từ 50.000 đến 160.000), có khoảng 200-1000 gốc D-glucose Những gốc này liên kết với nhau nhờ mối α-1,4-glucozit Amylose là một mạch xoắn dài không phân nhánh, tác dụng với iot cho màu xanh

Amylopectin có khối lượng phân tử từ 400.000 đến hàng triệu hoặc cao hơn nữa, gồm 600-6.000 gốc D-glucose liên kết bằng mối liên kết α-1,4 và α-1,6-glucozit Amylopectin là một mạch có nhiều nhánh, khi tác dụng với iot cho màu tím đỏ Dịch tinh bột khi đun nóng tới nhiệt độ 70÷800C sẽ bị hồ hóa, có nghĩa là hạt tinh bột trương nở, chín và dính

Dưới tác dụng của axit hoặc enzyme, tinh bột sẽ bị thủy phân Nhưng sự thủy phân này của hai loại này cũng khác nhau Với axit đặc và áp suất cao sản phẩm thủy phân

Hình 1.5 Cấu trúc tinh bột

này là glucose Thủy phân tinh bột bằng amylase đa dạng hơn, không cần axit mạnh, không cần áp suất cao, nhiệt độ cũng không quá cao mà vẫn thực hiện được

Tinh bột là nguồn cơ chất tự nhiên phổ biến của amylase Nhiều vi sinh vật chứa enzyme này có khả năng thủy phân tinh bột nhưng hầu hết đều cần quá trình

hồ hóa trước tiên Cấu trúc tinh bột liên quan đến cơ chất lignocelluloses Thường thì tinh bột được tạo thành từ 2 dạng polymer với tỉ lệ khác nhau là amylase và amylopectin Amylose là polymer của glucose với liên kết α-1,4-glucosis, chủ yếu

là mạch thẳng Amylopectin gồm liên kết giống amylase nhưng có thêm mạch nhánh liên kết bởi α-1,6-glucozit

1.3.1.2 Giới thiệu về amylase

Amylase là enzyme có khả năng xúc tác thủy phân tinh bột thành các sản phẩm khác nhau bao gồm dextrin và các polyme có kích thước nhỏ hơn được tạo thành từ các đơn vị glucose Các enzyme này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh mì, sản xuất các loại kẹo, công nghệ sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất mật tinh bột, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy Trên thế giới, amylase được sản xuất từ nguồn vi sinh vật chiếm khoảng 25 - 30%

Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, người ta phân chia amylase làm 3 loại: α - amylase, β - amylase và γ - amylase [2]

 α - amylase

α amylase là một trong những enzyme thương mại quan trọng nhất, α amylase xúc tác thủy phân liên kết α - 1,4 glucoside nội mạch ở bất kỳ vị trí nào trong phân tử tinh bột

-α - amylase tương đối bền với các tác dụng của nhiệt Đặc biệt -α - amylase của nhiều vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, chúng có thể giữ được hoạt tính ở 70-

90oC Tính bền nhiệt của α - amylase là do sự có mặt của canxi trong phân tử enzyme, ở đây canxi giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme

α - amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu, α-amylase của nấm mốc hoạt động mạnh ở pH = 4,5 - 4,9; của vi khuẩn ở pH = 5,9 - 6,1 Nếu

pH<3, đa số α - amylase bị vô hoạt hoàn toàn, trừ α - amylase của Aspergillus

niger có thể chịu được pH = 2,5 - 3,8

 β - amylase

β - amylase là một exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose Do enzyme này không thủy phân được liên kết α - 1,6 glucoside ở amylopectin nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 - 60% maltose Hầu hết β - amylase

có nguồn gốc từ thực vật

β - amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β - amylase bị vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 70oC Tuy nhiên, trong dịch nấu với nhiệt độ là 60-65oC pH môi trường là 4,5 - 5 thì β - amylase sẽ hoạt động mạnh hơn

 γ - amylase

γ - amylase là enzyme thủy phân liên kết α - 1,4 và α - 1,6 glucoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra đường glucose γ - amylase cũng có khả năng thuỷ phân cả maltose và dextrin

Đa số γ - amylase đều thuộc loại enzyme acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng

pH = 3,5 - 5,5 Nhiệt độ hoạt động tối thích là 50 - 60oC Hầu hết γ - amylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70oC

Hình 1.6 Cấu tạo amylase

1.3.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp amylase từ vi sinh vật [10] Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng

Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng của phương pháp nuôi bề sâu có thể

là muối vô cơ hay các hợp chất hữu cơ chứa nitơ Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật tạo amylase người ta dùng muối vô cơ

Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và

ức chế tổng hợp α-amylase

Sự tạo glucoamylase cũng như α-amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao (0,25-0,4%) khi làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo amylase người ta thường dùng (NH4)2HPO4 Nhiều nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, casein, nước chiết ngô) Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành amylase Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzyme cực lớn Sự thiếu hụt cấu tử này không thể bù đắp bằng sự dư thừa của cấu tử kia Tỷ lượng tối ưu của cacbon và nitơ (C:N) cho sinh tổng hợp amylase là 10:1 ÷ 40:1 Nói cách khác, hàm lượng cacbon trong môi trường phải 100-400 lần hơn hàm lượng nitơ

Ảnh hưởng của amino acid

Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme Mặt khác các amino acid lại không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ

có giá trị lớn hơn và cho những chất lượng mới Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp amylase do mấy nguyên nhân sau: Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nitơ và là nguồn năng lượng Nhiều vi sinh vật có thể đồng hóa trực tiếp amino acid (Kônvalov, 1967) Một số amino acid riêng lẻ (glutamic acid, aspartic acid…) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác

và trong quá trình chuyển amine hóa Nhờ một số amino acid trước hết là glutamic acid và aspstic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng CO2 (Araiet al, 1968)

Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như pantotenic acid, biotin, folic acid,… các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn Ngoài ra có những nhận xét cho rằng sự sinh tổng hợp ARN trong một

số tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi (Kurland, Marloe, 1962)

Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số thì ức chế quá trình này, một số khác lại không có ảnh hưởng gì cả

Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng

Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme của vi sinh vật Trong số các cấu tử vô cơ của môi trường nuôi

Bacillus subtilis và vi sinh vật khác cho hoạt lực amylase cao cần phải có muối của

mangan, kẽm cùng các nguyên tố vi lượng khác

Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi Khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lượng gluco amylase giảm xuống hàng chục lần (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu của muối này cho sinh tổng hợp α-amylase và gluco amylase là 0,05%

Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzyme (adenosine-phosphat, thiamine), đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học Phospho ảnh hưởng trực tiến đến tới sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzyme amylase

Các muối phospho thường được dùng với nồng độ cao tới 0,15M Hoạt độ amylase và oligo-1,6-glucosidase tăng cao khi có 0,1% KH2PO4, còn hoạt độ gluco amylase tăng cực lớn khi có 0,2% muối này

α-Calcium cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzyme này Calcium còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của proteinase (Hsiu et amiloza, 1964) Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca trong môi trường là 0,01-0,05%

Nhiều nguyên tố vi lượng có ảnh hưởng tới sự sinh khối và tổng hợp các amylase Ngoài Ca2+ ra, trong phân tử α-amylase của Bacillus subtilis còn chứa các

ion Zn2+ Zn2+ là cầu nối để tạo thành dimer của α-amylase Bacillus subtilis Sự có

mặt của Zn2+ trong dimer là đặc điểm khác biệt của α-amylase

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật

và sự tạo thành các enzyme amylase Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm các hoạt lực enzyme amylase Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi

thuộc giống Aspergillus là 30-320C Bacillus subtilis môi trường thích hợp nhất và tạo

nhiều amylase ở nhiệt độ 370C

Độ ẩm của môi trường

Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo amylase

1.3.2 Cellulase

1.3.2.1 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra người ta thường thấy chúng có nhiều ở tế bào của một số loài vi sinh vật Ở tế bào thực vật và một số tế

bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi

Hình 1.7 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-Dglucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 1800C và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường

và được cấu tạo như hình 1.8

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase [7]

1.3.2.2 Giới thiệu về cellulase

Cellulase là phức hệ thuỷ phân cellulose tạo thành các phân tử đường glucose Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ enzyme bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C1, Endo-β-glucananse hay Endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-glucosidase hay cellobioase:

β- Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydroase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử cellulose

nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt

 Endo1,4-glucanese (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết β-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một các tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác động mạnh lên cellodextrin Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose

 β-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiase và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên Chức năng của β-glucosidase có lẽ là diều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng cellulase

Cơ chế tác dụng của cellulase:

Cellulase là một hệ phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose

Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme 1,4 glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng của tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên

có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Hình 1.9 Cơ chế tác dụng của cellulase lên cellulose

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Đậu nành được được tiến hành phân loại để loại bỏ các hạt bị hư hỏng, sâu mọt, sau đó tiến hành sấy khô đến hàm lượng ẩm khoảng 10÷11%, xay nhỏ để sử dụng cho nghiên cứu

2.1.4 Cám gạo

Trong qui trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm chính là gạo thì còn một sản phẩm phụ có giá trị khá cao đó là cám gạo

Dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng, không có mùi hôi Độ

ẩm của cám không quá 15%

Cám gạo được sử dụng có độ ẩm khoảng 14 %

2.1.5 Rỉ đường

Rỉ đường hay rỉ mật, mật rỉ, mật rỉ đường, còn được gọi ngắn gọn là mật, là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô và kết tinh Đây là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến đường (đường mía, đường nho, đường củ cải)

Trong rỉ đường mía còn một lượng đường nhỏ Không giống như trong đường tinh luyện, rỉ đường chứa một lượng vết vitamin và một lượng đáng kể một số chất khoáng như canxi, magie, kali và sắt

Rỉ đường được mua ở Công ty cổ phần đường Ninh Hòa Có độ ẩm 48% và bảo quản nơi khô ráo trong phòng thí nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu

2.1.6 Các hóa chất

Sử dụng các hóa chất tinh khiết dùng cho thí nghiệm và môi trường nuôi cấy

H2SO4, NaOH, HCl, NaCl, Tinh bột, Glucose, Thuốc thử Lugol, Agar, CMC, Acid dinitrosalicylic (DNS), Sodium potassium tartrate , Thuốc nhuộm Congo Red

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài

2.2.1.1 Xác định hàm lượng cellulose

Cellulose là chất xơ bã còn lại sau khi các gluxit khác như tinh bột, lignin và các sắc tố, các tạp chất bị thủy phân bởi axit và kiềm Xác định hàm lượng xơ theo TCVN 4329-93

Nguyên tắc: Dùng dung dịch axit và kiềm với nồng độ nhất định thủy phân và tách khỏi mẫu thử các chất bột đường, protit, dầu mỡ, một phần hemicelulose và lignin còn gọi là xơ thô

2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường khử: phương pháp Miller [18]

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

2.2.1.3 Xác định hàm lượng tinh bột [9]

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit HCl tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành glucose theo phương trình:

(C6H12O5)n + nH2O nC6H12O6 Bằng cách xác định hàm lượng gluose trước và sau khi thủy phân, nhân với

hệ số chuyển đổi là 0,9 suy ra được hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu

2.2.1.4 Xác định hoạt độ cellulase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải

Nguyên tắc: Khi cho cellulase tác dụng lên cơ chất CMC trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường giảm và môi trường trở lên trong suốt Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của cellulase

2.1.1.5 Xác định hoạt độ amylase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải

Nguyên tắc: Khi cho amylase tác dụng lên cơ chất tinh bột trong môi trường thạch, tinh bột bị phân giải, độ đục của môi trường giảm và môi trường trở lên trong suốt Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của amylase

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tổng quát

o Xác định hoạt độ cellulase và amylase

o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột

Đậu nành Cám gạo

Nghiên cứu xác định tỷ

lệ nước bổ sung

Nghiên cứu xác định nhiệt

độ ủ

Nghiên cứu xác định thành phần môi

Thuyết minh quy trình:

Chuẩn bị nguyên liệu:

• Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 được lấy từ phòng thí nghiệm Vi sinh

khoa Công nghệ Thực phẩm

• Bã sắn: bã sắn khô sau khi được thu mua ở cơ sở sản xuất tinh bột tại thành phố Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa được làm khô đến độ ẩm 10÷11% và bảo quản ở điều kiện thường Sau đó, được xay nhỏ để làm cho bã sắn có kích thước đồng đều, tăng diện tích tiếp xúc với vi khuẩn, thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân bã sắn

• Đậu nành có độ ẩm trong khoảng từ 10÷11% được bảo quản ở điều kiện thường sau đó tiến hành sấy để tạo độ giòn dễ xay, thúc đẩy phản ứng chuyển hóa

các chất tạo điều kiện cho vi khuẩn Bacillus subtilis C7 dễ thủy phân

• Dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng, không có mùi hôi Cám gạo được sử dụng có độ ẩm khoảng 14 %

• Rỉ đường được mua ở Công ty cổ phần đường Ninh Hòa Có độ ẩm 48%

và bảo quản nơi khô ráo trong phòng thí nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu

Nghiên cứu bổ sung thêm một số thành phần khác như cám gạo, rỉ đường để

tăng thêm chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho vi khuẩn Bacillus subtilis C7 phát

triển và sinh cellulase, amylase thúc đẩy quá trình thủy phân cellulose và tinh bột

Hấp vô trùng:

Mục đích: để tiêu diệt các vi sinh vật và tạo môi trường thuận lợi cho Bacillus

subtilis C7 sinh trưởng và phát triển

Đậy nút bông, gói giấy bạc rồi đem đi hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 15 phút

Làm nguội, bổ sung Bacillus subtilis C7

Sau khi hấp xong, mẫu được làm nguội và bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis

C7 vào với mật độ là 106CFU/g hỗn hợp

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ

Mục đích: xác định được thời gian ủ thích hợp để hiệu quả của quá trình thủy phân cellulose và tinh bột là cao nhất

Cách tiến hành:

Bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ hỗn hợp (bã sắn và đậu nành)/nước là 1/2 Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ

o Xác định hoạt độ cellulase và amylase

o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột

Ủ (giờ) Hấp vô trùng

15 phút Sau đó, hỗn hợp được làm nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7

với mật độ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở nhiệt độ phòng với thời gian ủ từ

0 giờ đến 96 giờ, bước nhảy là 12 giờ

Tiến hành xác định hoạt độ cellulase, amylase và hiệu suất thủy phân cellulose, tinh bột ở từng thời gian ủ để chọn thời gian ủ thích hợp

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ

Mục đích: xác định được nhiệt độ thích hợp để Bacillus subtilis C7 sinh

trưởng và phát triển và sinh enzym thủy phân cellulose, tinh bột

Cách tiến hành:

Bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ hỗn hợp (bã sắn và đậu nành)/nước là 1/2 Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ

o Xác định hoạt độ cellulase và amylase

o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột

Ủ ở nhiệt độ

Để nguộiHấp vô trùng