Cellulase là phức hệ thuỷ phân cellulose tạo thành các phân tử đường β- glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ enzyme bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)- glucananse hay enzyme C1, Endo-β-glucananse hay Endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-glucosidase hay cellobioase:
Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydroase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC
nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
Endo1,4-glucanese (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết β-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một các tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác động mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
β-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiase và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của β-glucosidase có lẽ là diều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng cellulase.
Cơ chế tác dụng của cellulase:
Cellulase là một hệ phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau:
Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thuỷ phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme 1,4 glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose.
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng của tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Bacillus subtilis C7
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 được phân lập từ đất và được giữ giống tại phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Công nghệ thực phẩm. Bacillus subtilis C7 có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, cellulase) do đó nó được lựa chọn để ủ với bã sắn nhằm thủy phân tinh bột và cellulose.
2.1.2. Bã sắn
Sau quá trình chế biến tinh bột sắn, bã sắn được thu nhận và làm khô đến hàm lượng ẩm từ 10÷11% để tiến hành nghiên cứu.
2.1.3. Đậu nành
Trong hạt đậu nành có các thành phần hóa học sau : protein (40%), lipid (12÷25%), glucid (10-15%) ; có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F ; cellulose.
Đậu nành được được tiến hành phân loại để loại bỏ các hạt bị hư hỏng, sâu mọt, sau đó tiến hành sấy khô đến hàm lượng ẩm khoảng 10÷11%, xay nhỏ để sử dụng cho nghiên cứu.
2.1.4. Cám gạo
Trong qui trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm chính là gạo thì còn một sản phẩm phụ có giá trị khá cao đó là cám gạo.
Dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng, không có mùi hôi. Độ ẩm của cám không quá 15%.
Cám gạo được sử dụng có độ ẩm khoảng 14 %.
2.1.5. Rỉ đường
Rỉ đường hay rỉ mật, mật rỉ, mật rỉ đường, còn được gọi ngắn gọn là mật, là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô và kết tinh. Đây là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến đường (đường mía, đường nho, đường củ cải).
Trong rỉ đường mía còn một lượng đường nhỏ. Không giống như trong đường tinh luyện, rỉ đường chứa một lượng vết vitamin và một lượng đáng kể một số chất khoáng như canxi, magie, kali và sắt.
Rỉ đường được mua ở Công ty cổ phần đường Ninh Hòa. Có độ ẩm 48% và bảo quản nơi khô ráo trong phòng thí nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu.
2.1.6. Các hóa chất
Sử dụng các hóa chất tinh khiết dùng cho thí nghiệm và môi trường nuôi cấy. H2SO4, NaOH, HCl, NaCl, Tinh bột, Glucose, Thuốc thử Lugol, Agar, CMC, Acid dinitrosalicylic (DNS), Sodium potassium tartrate , Thuốc nhuộm Congo Red.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài 2.2.1.1. Xác định hàm lượng cellulose 2.2.1.1. Xác định hàm lượng cellulose
Cellulose là chất xơ bã còn lại sau khi các gluxit khác như tinh bột, lignin và các sắc tố, các tạp chất bị thủy phân bởi axit và kiềm. Xác định hàm lượng xơ theo TCVN 4329-93.
Nguyên tắc: Dùng dung dịch axit và kiềm với nồng độ nhất định thủy phân và tách khỏi mẫu thử các chất bột đường, protit, dầu mỡ, một phần hemicelulose và lignin còn gọi là xơ thô.
2.2.1.2. Xác định hàm lượng đường khử: phương pháp Miller [18]
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
2.2.1.3. Xác định hàm lượng tinh bột [9]
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit HCl tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành glucose theo phương trình:
(C6H12O5)n + nH2O nC6H12O6
Bằng cách xác định hàm lượng gluose trước và sau khi thủy phân, nhân với hệ số chuyển đổi là 0,9 suy ra được hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu.
2.2.1.4. Xác định hoạt độ cellulase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải
Nguyên tắc: Khi cho cellulase tác dụng lên cơ chất CMC trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường giảm và môi trường trở lên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của cellulase.
2.1.1.5. Xác định hoạt độ amylase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải
Nguyên tắc: Khi cho amylase tác dụng lên cơ chất tinh bột trong môi trường thạch, tinh bột bị phân giải, độ đục của môi trường giảm và môi trường trở lên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của amylase.
2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 2.2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tổng quát
Nước Phối trộn Hấp vô trùng Để nguội Ủ Xay nhỏ Bã sắn
o Xác định hoạt độ cellulase và amylase
o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột Đậu nành Cám gạo Rỉ đường Bacillus subtilis C7 Chọn thông số thích hợp Nghiên cứu xác định thời gian ủ Nghiên cứu xác định tỷ lệ đậu nành Nghiên cứu xác định tỷ lệ nước bổ sung Nghiên cứu xác định nhiệt độ ủ Nghiên cứu xác định thành phần môi
Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị nguyên liệu:
• Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 được lấy từ phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ Thực phẩm.
• Bã sắn: bã sắn khô sau khi được thu mua ở cơ sở sản xuất tinh bột tại thành phố Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa được làm khô đến độ ẩm 10÷11% và bảo quản ở điều kiện thường. Sau đó, được xay nhỏ để làm cho bã sắn có kích thước đồng đều, tăng diện tích tiếp xúc với vi khuẩn, thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân bã sắn.
• Đậu nành có độ ẩm trong khoảng từ 10÷11% được bảo quản ở điều kiện thường sau đó tiến hành sấy để tạo độ giòn dễ xay, thúc đẩy phản ứng chuyển hóa các chất tạo điều kiện cho vi khuẩn Bacillus subtilis C7 dễ thủy phân.
• Dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng, không có mùi hôi. Cám gạo được sử dụng có độ ẩm khoảng 14 %.
• Rỉ đường được mua ở Công ty cổ phần đường Ninh Hòa. Có độ ẩm 48% và bảo quản nơi khô ráo trong phòng thí nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu.
Phối trộn:
Mục đích: hòa trộn đều các nguyên liệu với nhau để vi khuẩn có thể sử dụng một cách hiệu quả nhất.
Bã sắn sau đó được đưa đi xác định khối lượng và cho vào bình tam giác, tiếp theo bổ sung 5% bột đậu nành so với khối lượng nguyên liệu ủ, nước được bổ sung với tỷ lệ hỗn hợp/nước là 1/2.
Nghiên cứu bổ sung thêm một số thành phần khác như cám gạo, rỉ đường để tăng thêm chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho vi khuẩn Bacillus subtilis C7 phát
triển và sinh cellulase, amylase thúc đẩy quá trình thủy phân cellulose và tinh bột.
Hấp vô trùng:
Mục đích: để tiêu diệt các vi sinh vật và tạo môi trường thuận lợi cho Bacillus
Đậy nút bông, gói giấy bạc rồi đem đi hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 15 phút.
Làm nguội, bổ sung Bacillus subtilis C7
Sau khi hấp xong, mẫu được làm nguội và bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis C7 vào với mật độ là 106CFU/g hỗn hợp.
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ
Mục đích: xác định được thời gian ủ thích hợp để hiệu quả của quá trình thủy phân cellulose và tinh bột là cao nhất.
Cách tiến hành:
Bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ hỗn hợp (bã sắn và đậu nành)/nước là 1/2. Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ
o Xác định hoạt độ cellulase và amylase
o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột Ủ (giờ) Hấp vô trùng 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Bã sắn Nước Đậu nành Bacillus subtilis C7 Chọn thời gian ủ thích hợp Để nguội Phối trộn
15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7
với mật độ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở nhiệt độ phòng với thời gian ủ từ 0 giờ đến 96 giờ, bước nhảy là 12 giờ.
Tiến hành xác định hoạt độ cellulase, amylase và hiệu suất thủy phân cellulose, tinh bột ở từng thời gian ủ để chọn thời gian ủ thích hợp.
2.2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ
Mục đích: xác định được nhiệt độ thích hợp để Bacillus subtilis C7 sinh
trưởng và phát triển và sinh enzym thủy phân cellulose, tinh bột.
Cách tiến hành:
Bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ hỗn hợp (bã sắn và đậu nành)/nước là 1/2. Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ
o Xác định hoạt độ cellulase và amylase
o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột Ủ ở nhiệt độ Để nguội Hấp vô trùng 25 ± 10C 30 ± 10C 37 ± 10C Bã sắn Nước Đậu nành Bacillus subtilis C7 Chọn nhiệt độ ủ thích hợp Phối trộn
phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7 với mật độ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở các nhiệt độ 25 ± 1, 30 ± 1, 37 ± 1 (0C).
Tiến hành xác định hoạt độ cellulase, amylase và hiệu suất thủy phân cellulose, tinh bột ở từng nhiệt độ ủ để chọn thời gian ủ thích hợp.
2.2.3.4. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước bổ sung
Mục đích: nước là môi trường phân tán enzyme và cơ chất, trực tiếp tham gia vào phản ứng thủy phân và ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân.
Cách tiến hành:
Bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành. Sau đó bổ sung nước với các tỷ lệ hỗn hợp/nước lần lượt là 1/1; 1/1,5; 1/2; 1/2,5. Hỗn hợp được
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước bổ sung
o Xác định hoạt độ cellulase và amylase
o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột Bã sắn + đậu nành
Ủ Để nguội Hấp vô trùng 1/1
Bổ sung nước với tỷ lệ hỗn hợp/nước
Chọn tỷ lệ nước bổ sung thích hợp
Bacillus subtilis C7
hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7 với mật độ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở thời gian và nhiệt độ đã chọn.
Tiến hành xác định hoạt độ cellulase, amylase và hiệu suất thủy phân cellulose, tinh bột ở từng tỷ lệ hỗn hợp/nước để chọn tỷ lệ nước thích hợp.
2.2.3.5. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường
Mục đích: Nhằm tìm được môi trường dinh dưỡng phù hợp cho vi khuẩn
Bacillus subtlis C7 phát triển tốt nhất. Để hiệu quả thủy phân đạt mức cao.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường
o Xác định hoạt độ cellulase và amylase
o Xác định hàm lượng cellulose, tinh bột Để nguội Hấp vô trùng Bã sắn Nước 5% đậu nành Cám gạo Đậu nành Rỉ đường Đậu nành Cám gạo, Rỉ đường Đậu nành Đậu nành Ủ Bacillus subtilis C7 Chọn thành phần môi trường thích hợp Bổ sung thêm Phối trộn
Ngoài bã sắn và đậu nành tiến hành nghiên cứu bổ sung một số thành phần khác là cám gạo, rỉ đường để lựa chọn thành phần môi trường thích hợp cho
Bacillus subtilis C7 sinh trưởng và phát triển hoạt động sinh cellulase, amylase thúc đẩy quá trình thủy phân cellulose, tinh bột.
Cách tiến hành:
Bã sắn sau khi xay nhỏ bổ sung thêm lần lượt các thành phần 10% cám gạo + 5% bột đậu nành, 10% rỉ đường + 5% bột đậu nành, 5% cám gạo + 5% rỉ đường + 5% bột đậu nành, 5% bột đậu nành. Nước được bổ sung với tỷ lệ đã chọn.
Hỗn hợp được trộn đều và hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7 với tỷ lệ
106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở thời gian, nhiệt độ đã chọn.
Tiến hành xác định hoạt độ cellulase, amylase và hiệu suất thủy phân cellulose, tinh bột ở từng thành phần môi trường để chọn thành phần môi trường thích hợp.
2.2.3.6. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đậu nành bổ sung
Mục đích: bột đậu nành là nguồn cung cấp cơ chất quan trọng cho vi khuẩn hoạt động như cung cấp nguồn cacbon, nitơ, các khoáng chất thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp enzym nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose, tinh bột.
Cách tiến hành:
Bã sắn sau khi xay nhỏ được bổ sung thêm đậu nành với tỷ lệ lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15% và 20%. Sau đó cho thêm nước với tỷ lệ hỗn hợp/nước đã chọn.
Trộn đều hỗn hợp với nước và đem hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút. Hỗn hợp được để nguội và bổ sung chủng Bacillus subtilis C7 với mật độ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở thời gian, nhiệt độ đã chọn.
Tiến hành xác định hoạt độ cellulase, amylase và hiệu suất thủy phân cellulose, tinh bột ở từng tỷ lệ đậu nành bổ sung và chọn tỷ lệ đậu nành bổ sung thích hợp.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đậu nành bổ sung
o Xác định hoạt độ cellulase và amylase
o Xác định hiệu suất thủy phân cellulose và tinh bột Bã sắn
Ủ Để nguội Hấp vô trùng
0% 5% 10% 15% 20%
Nước Bổ sung đậu nành với tỷ lệ
Chọn tỷ lệ đậu nành bổ sung thích hợp
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần. Kết quả trình bày là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm ± độ tin cậy 95%. Tất cả số liệu thu được trong đồ án được xử lý