Chuẩn bị nguyên liệu:
Hình 3.19. Sơ đồ quy trình ủ bã sắn với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7
10% đậu nành Tỷ lệ hỗn hợp/nước là 1/2 Phối trộn Hấp vô trùng Làm nguội Ủ 48 giờ ở 37oC Xay nhỏ Bacillus subtilis C7 Bã sắn Sản phẩm
• Bã sắn được xay nhỏ để làm cho bã sắn có kích thước đồng đều, tăng diện tích tiếp xúc với vi khuẩn, thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân bã sắn.
• Đậu nành có độ ẩm trong khoảng từ 10÷11% được xay nhỏ để dinh dưỡng phân bố đều tạo điều kiện cho vi khuẩn Bacillus subtilis C7 sinh trưởng và phát triển.
Phối trộn:
Bã sắn sau khi xay nhỏ được bổ sung thêm 10% đậu nành để cung cấp nguồn cacbon, nitơ, các chất khoáng như Fe, Mg, Zn… cho Bacillus subtilis C7 sinh
trưởng và phát triển tốt nhất.
Hỗn hợp được trộn đều với nước. Bổ sung nước với tỷ lệ hỗn hợp/nước là 1/2 để cung cấp nước cho hoạt động sinh enzyme của Bacillus subtilis C7. Thúc đẩy
quá trình thủy phân tinh bột và cellulose đạt hiệu quả cao.
Hấp vô trùng:
Sau khi phối trộn đều các nguyên liệu tiến hành hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút để tiêu diệt các vi sinh vật và tạo môi trường thuận lợi cho Bacillus subtilis C7 sinh trưởng và phát triển.
Làm nguội, bổ sung Bacillus subtilis C7
Sau khi hấp xong, hỗn hợp được làm nguội và bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis C7 vào với tỷ lệ là 106CFU/g hỗn hợp.
Ủ
Tiến hành ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ để Bacillus subtilis C7 sinh trưởng, phát triển sinh cellulase và amylase thúc đẩy quá trình thủy phân cellulose và tinh bột đạt hiệu suất cao nhất.
Hiệu suất thủy phân tinh bột và cellulose đạt cao nhất sau khi ủ theo quy trình trên lần lượt là 26,17 ± 0,26% và 35,27 ± 2,81%.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu trên, đã tìm ra được các thông số chính của quy trình ủ bã sắn với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 để mức độ thủy phân tinh bột và cellulose đạt hiệu suất cao:
Thời gian ủ là 48 giờ. Nhiệt độ ủ 37oC
Độ ẩm tỷ lệ hỗn hợp/nước là 1/2 Tỷ lệ đậu nành bổ sung 10%
4.2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Tiếp tục nghiên cứu về khả năng thủy phân bã sắn của các chủng vi khuẩn khác để nâng cao giá trị dinh dưỡng của bã sắn và tăng hiệu quả kinh tế cho ngành chăn nuôi phát triển. Đồng thời góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong quá trình sản xuất tinh bột sắn.
Áp dụng nghiên cứu này vào quy mô thực tế hoặc với quy mô phòng thí nghiệm với năng suất lớn hơn. Đặc biệt có thể áp dụng cho các hộ chăn nuôi gia súc hoặc các trang trại để giảm chi phí thức ăn, tăng thêm giá trị kinh tế cho ngành chăn nuôi phát triển.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Hoàng Kim Anh, Ngô Thế Sương, Nguyễn Xích Liên (2006), Tinh bột sắn và
các sản phẩm từ tinh bột sắn, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Hương Giang, Trần Thị Luyến (1998), “Công nghệ enzyme”, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục.
4. Quách Đĩnh, “Sử dụng chế phẩm enzyme trong công nghiệp thực phẩm” (1982)
NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. Bùi Đức Hợi (1983-1985), Chế biến lương thực. Đại học bách khoa Hà Nội. 6. Cao Văn Hùng (2001), Bảo quản và chế biến sắn. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội.
7. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), “Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Penicilium sp. DTQ-HK 1”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 5 (3). 8. Đinh Thế Lộc, Võ Nguyên Quyền, Bùi Thế Hùng (1997), Giáo trình cây lương thực – Tập 2, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội.
9. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học, Tập 1: Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. HCM.
10. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường-Nguyễn Ánh Tuyết-Lê Thị Thủy Tiên-Tạ Thu Hằng-Ngọc Oanh-Nguyễn Thúy Hương-Phan Thị Huyền (2004). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. Tr 319-351. 11. Vũ Văn Ngữ, “Loạn khuẩn đường ruột và tác dụng của lisubtin” (1978), Nhà
xuất bản y học Hà Nội.
12. Lương Đức Phẩm (2011), Sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
13. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
14. Lương Hữu Thành và cộng sự (2002), “Sản xuất phân vi sinh từ bã thải sắn”,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.
15. Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010), Khảo sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Tuyển tập
báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, Đại học Đà Nẵng. 16. Nguyễn Hữu Văn và cộng sự (2009), “Đánh giá giá trịdinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụgia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại”, Trường
Đại học Nông nghiệp - Đại học Huế.
TIẾNG ANH
17. Ashok Pandey và cộng sự (2000), “Biotechnological potential of agro-
industrial residues. II: cassava bagass”, Bioresource Technology 74, 81±87.
18. Miller (1959), Use of dinitro salicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem 31(3), p. 426-428
19. Norio Kimura Yokohamo (1986), “Bacillus subtilis strain and prevention of Aflatoxin contamination in cereals and nut”, Journal of Food Protection, vol.49, No.7, 515-518.
20. S.Gaewchingduang and P.Pengthemkeerati (2010), “Enhancing efficiency for
reducing sugar from cassava bagasse by pretreatment”, World Academy of
Science, Engineering and Technology 70.
21. William A.G. & Withers S. E. (1983), “Bacillus spp. in the rumen ecosystem.
Hemicellulose depolymerase and glycoside hydrolase of Bacillus spp. and rumen isolates growm under anaerobic conditions”, Journal of Applied Bacteriology, 55,
283-292.
22. Shaista Kokab và cộng sự (2003), “Bio-Processing of Banana Peel for
Amylase Production by Bacillus subtilis”, International Journal of Agriculture and
TRANG WEB
23. http://en.wikipedia.org/Bacillus
24.http://tinhbotsanbinhminh.com.vn/index.php?view=detail&newsId=11&option =com_news
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1. Xác định hàm lượng chất xơ theo TCVN 4329-93 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc: Dùng dung dịch axit và kiềm với nồng độ nhất định thủy phân
và tách khỏi mẫu thử các chất bột đường, protit, dầu mỡ, một phần hemixeluloza và lignin còn gọi là xơ thô.
Thiết bị vật liệu và hóa chất:
• Tủ sấy, tủ nung, bình tam giác, phễu lọc, bếp điện, giấy lọc, giấy chỉ thị, cốc nung, bình hút ẩm, cân điện tử có với độ chính xác 0,0002g.
• Dung dịch H2SO4 1,25%, dung dịch NaOH 2,5%.
Cách tiến hành:
Cân 8g mẫu với độ chính xác 0,001g cho vào bình tam giác 250ml rồi rót vào 200ml acid sunfuric 1,25% đã được đun nóng 70 – 80oC, dùng đũa thủy tinh khuấy đều đậy bình bằng nút bông và bao giấy bạc cho kín miệng bình. Đặt bình trên bếp điện và đun đến sôi thật nhanh (trong khoảng 2 phút) tiếp tục đun sôi nhẹ trong 30 ± 1 phút.
Sau khi thủy phân bằng acid, tiến hành lọc dịch còn đang nóng qua phễu lọc với giấy lọc. Dùng bình tia đựng nước cất nóng rửa cặn bám ở giấy lọc cho đến khi dịch lọc đạt trung tính (kiểm tra bằng cách thử với giấy thử pH, tới khi pH không đổi màu).
Rửa cặn trên giấy lọc và chuyển vào bình tam giác 250ml, định mức đến 100ml, sau đó cho vào bình 100 ml dung dịch NaOH 2,5%.
Bao nút bông, giấy bạc kín bình rồi đặt lên bếp điện đun sôi khoảng 2 phút, tiếp tục đun sôi nhẹ trong 30 ± 1 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Rửa cặn trên giấy lọc đến khi pH của dịch lọc đạt trung tính (kiểm tra bằng giấy đo pH). Sau đó tiến hành sấy khô mẫu ở 1050C cho đến khi khối lượng mẫu không đổi. Chuyên toàn bộ mẫu vào cốc nung đã sấy tới khối lượng không đổi và đã xác định khối lượng.
Cân xác định khối lượng của cốc sau khi đựng mẫu, tiến hành vô cơ hóa mẫu trên bếp điện trong tủ host và cho vào tủ nung ở 550 ± 250C nung trong 2 giờ để nguội trong bình hút ẩm và cân xác định khối lượng.
Cách tính kết quả:
Hàm lượng xơ thô (X) trong mẫu thức ăn được tính bằng công thức sau:
Trong đó:
m là khối lượng xơ thô trong mẫu tính bằng g, bằng khối lượng chén lọc với mẫu trước khi nung trừ khối lượng chén lọc với mẫu sau nung.
m1là khối lượng mẫu thử tính bằng g.
Kết quả cuối cùng là trung bình giữa hai lần phân tích song song, nếu như sai khác hai lần phân tích không quá:
0,4 (tuyệt đối) khi xơ thô trong mẫu thấp hơn 10%;
4% (tương đối so với trung bình) nếu hàm lượng xơ thô trong mẫu lớn hơn 10%.
2.Xác định hàm lượng đường khử: phương pháp Miller [21]
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường
khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Hóa chất:
Thuốc thử DNS: cân 1 g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml.
Dung dịch glucose mẫu (1000µg/ml): cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít. Cách tiến hành: Dựng đồ thị chuẩn glucose: m m1 x 100 X (%)=
Từ dung dịch glucose 1000 (µg/ml), pha các dung dịch glucose có nồng độ từ 50 – 1000 (µg/ml).
Bảng 1. Xây dựng đường chuẩn glucose
Cho 0,5ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5ml thuốc thử DNS. Đun nóng cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với ống đối chứng là nước cất.
Bảng 1.2. Kết quả đo ΔOD 540nm ở các nồng độ đường khác nhau
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose. Nồng độ Glucose (µg/ml) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Thể tích dung dịch glucose mẫu (ml) 0 20 40 60 40 50 60 70 80 90 100 Nước cất 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Nồng độ Glucose (µg/ml) Số lần 400 500 600 700 800 900 1000 ΔOD540nm 1 0,0762 0,1209 0,1569 0,2096 0,2428 0,286 0,3301 2 0,0765 0,1208 0,1572 0,2099 0,2429 0,2859 0,3309 3 0,0768 0,121 0,1572 0,2100 0,2431 0,2856 0,331 Giá trị TB 0,0765 0,1209 0,1571 0,2098 0,2429 0,2858 0,3307 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu thí nghiệm
Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đường chuẩn glucose.
Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng, sau đó hàm lượng tinh bột được xác định dựa vào hàm lượng đường.
3. Xác định hàm lượng tinh bột [8]
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit HCl tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành glucose theo phương trình:
(C6H12O5)n + nH2O nC6H12O6
Bằng cách xác định hàm lượng glucose trước và sau khi thủy phân, nhân với hệ số chuyển đổi là 0,9 suy ra được hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu.
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu: cân một lượng mẫu, tính sao cho dung dịch đường bột pha loãng có nồng độ từ 4-10% tính bằng đường glucose. Lấy 50ml dung dịch đường bột 4-10% vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho vào 5ml HCl tinh khiết (D=1,19). Đậy nút bông, bao giấy bạc và đun cách thủy trong vòng 3 giờ để tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành đường. Kiểm tra xem hết tinh bột trong mẫu chưa bằng cách thử với thuốc thử lugol.
Hình 1.1. Xây dựng đường chuẩn Glucose theo phương pháp Miller
y = 0.000x - 0.091 R² = 0.998 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 500 1000 1500 Δ OD540 n m Nồng độ glucose (µg/ml)
Sau khi thủy phân xong, trung hòa lại dịch bằng NaOH đến pH 5-6. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml thêm nước cho đến vạch, lắc đều và lọc qua giấy lọc. Lấy 1ml dịch lọc đem đi xác định hàm lượng glucose tạo thành theo phương pháp DNS, từ đó suy ra hàm lượng tinh bột tương ứng.
Cách tính kết quả
Hàm lượng tinh bột của nguyên liệu:
A (%)=
A: hàm lượng tinh bột (%) a : nồng độ glucose (mg/ml) n: sầ lần pha loãng (lần) m: khối lượng mẫu (g)
0,9: hệ số chuyển đổi glucose thành tinh bột
4. Xác định hoạt độ cellulase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải
Chuẩn bị môi trường kiểm tra Cellulase
- CMC: 0,5gam - Agar: 1,5gam - Nước cất: đủ 100ml
Đun CMC với nước cho tan trước, sau đó định mức cho đủ 100 ml rồi cho agar vào đun sau cho tan agar. Sau đó đổ vào đĩa petri (100 ml môi trường đổ được 4 đĩa petri).
Pha chế thuốc nhuộm Congo Red
Cách pha: 1g CMC + 100ml nước cất, khuấy cho tan hết sau đó cho vào bình.
Cách tiến hành
Cân 1g mẫu cho vào 9ml nước và lắc đều. Sau đó đục lỗ (giếng) trên môi
trường (1 đĩa có thể đục được tối đa 8 - 9 giếng). Một mẫu kiểm tra hoạt độ
enzyme cần làm 2 giếng. Nhỏ dung dịch cần kiểm tra hoạt độ enzyme vào và ủ
a*V*n*0,9
khoảng 12 - 24 giờ. Nhuộm với Congo Red, đo đường kính vòng trong và suy ra được hoạt độ của cellulase.
1.3. Xác định hoạt độ amylase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường kiểm tra hoạt độ amylase
- Tinh bột: 0,5gam - Agar: 1,5gam - Nước cất: đủ 100ml
Tiến hành đun cho tan các thành phần môi trường rồi đổ vào đĩa petri (100 ml môi trường đổ được 4 đĩa petri)
Pha chế thuốc thử Lugol
Cách pha: 1g I2 + 2g KI cho vào 100ml nước cất, khuấy cho tan hết (chỗ tối), sau đó đổ vào lọ tối màu, tránh ánh sáng và thoáng mát.
Cách tiến hành:
Cân 1g mẫu cho vào 9ml nước và lắc đều. Sau đó đục lỗ (giếng) trên môi
trường (1 đĩa có thể đục được tối đa 8 - 9 giếng). Một mẫu kiểm tra hoạt độ
enzyme cần làm 2 giếng. Nhỏ dung dịch cần kiểm tra hoạt độ enzyme vào và ủ
khoảng 12 - 24 giờ. Nhuộm với thuốc thử Lugol, đo đường kính vòng trong và suy ra được hoạt độ của amylase.
PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.1. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ TỚI QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE VÀ TINH BỘT
Thời gian (giờ) 12 24 36 48 60 72 84 96
Thí nghiệm 1 5,5 6,5 8 8,5 6,5 5,5 4,75 4,25 Thí nghiệm 2 5,5 6,5 8,25 8,5 7 5,75 4,5 4,5 Thí nghiệm 3 5,75 6 8,25 8,25 6,5 5,75 4,5 4 Đường kính vòng phân giải cellulose, mm 5,58± 0,36b 6,33± 0,72c 8,17± 0,36d 8,42± 0,36d 6,67± 0,72c 5,67± 0,36b 4,58± 0,36a 4,25± 0,62a
Giá trị biểu thị là trung bình (n=3) ± độ tin cậy 95% kèm theo chữ cái khác nhau thể hiện sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Phân tích Anova để tìm sự khác nhau có ý nghĩa của đường kính vòng phân giải cellulose ở các mẫu có thời gian ủ khác nhau.
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ bã sắn tới hàm lượng cellulose Thời gian (giờ) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Thí nghiệm 1 18,05 16,43 15,63 14,08 12,30 12,48 12,43 12,70 18,05 Thí nghiệm 2 18,04 16,43 15,57 14,18 12,40 12,41 12,33 12,32 18,04 Thí nghiệm 3 18,23 16,62 15,79 14,37 12,49 12,50 12,31 12,66 18,23 Hàm lượng cellulose,g % chất khô 18,11± 0,26 16,49 ±0,27 15,67± 0,28 14,21± 0,36 12,40± 0,24 12,46± 0,11 12,26± 0,15 12,56± 0,51 12,47± 0,11
Giá trị biểu thị là trung bình (n=3) ± độ tin cậy 95% (p<0,05).
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ bã sắn tới hiệu suất thủy phân cellulose
Giá trị biểu thị là trung bình (n=3) ± độ tin cậy 95% kèm theo chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Thời gian (giờ) 12 24 36 48 60 72 84 96 Thí nghiệm 1 8,96 13,41 21,99 31,89 30,69 31,15 30,78 31,07