Nghiên cứu ứng dụng hạ cholesterol và bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdarifa L, Malvaceae)

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ  *  BÁO CÁO NGHIỆM THU Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 23 thán

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

 * 

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 23 tháng 04 năm 2013)

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ CHOLESTEROL MÁU

VÀ BẢO VỆ GAN CỦA BỘT SẤY PHUN TỪ ĐÀI HOA

BỤP GIẤM ( Hibiscus sabdarif a L Malvaceae)

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Mở đầu: Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) chứa anthocyanin có tác dụng chống

oxy hóa rất tốt và đã được trồng thành công ở Việt Nam đạt tiêu chuẩn VietGAP Hiện nay, đài hoa Bụp giấm được nghiên cứu sản xuất dạng chế phẩm là bột sấy phun, tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của chế phẩm này

Mục tiêu: Xây dựng một số tiêu chuẩn hóa lý, đánh giá tác dụng hạ cholesterol và bảo vệ gan

của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (BSP) trên chuột nhắt

Nội dung: Tiêu chuẩn BSP: Độ ẩm, tro toàn phần, kim loại nặng, định lượng anthocyanin toàn

phần Độc tính cấp: Xác định LD 50 hoặc D max

Đánh giá tác dụng hạ cholesterol trên mô hình tăng lipid bằng tyloxapol (triton WR-1339) tiêm phúc mô 400 mg/kg và bằng cholesterol đường uống 25 mg/kg trong 6 tuần Định lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C và LDL-C trong máu chuột sau thử nghiệm

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan cấp tính bằng ethanol 40%, 5 g/kg x 3 lần mỗi 12 giờ, định lượng AST, ALT, MDA, GSH 4 giờ sau liều ethanol cuối và quan sát vi phẫu gan của các chuột thử nghiệm

Kết quả: BSP đạt độ ẩm 2,83%, tro toàn phần 0,123%, kim loại nặng < 10 ppm (asen, cadimi,

chì, thủy ngân), anthocyanin toàn phần 0,215% BSP không thể hiện độc tính cấp ở liều 8,9 g/kg Liều 0,45 g/kg BSP (1/20 D max ) làm giảm cholesterol 7%, triglycerid 32%, LDL-C 63% (mô hình tiêm tyloxapol), giảm cholesterol 22%, LDL-C 45% (mô hình uống cholesterol) Liều 0,9 g/kg BSP (1/10 D max) làm giảm triglycerid 78% (mô hình tyloxapol), giảm cholesterol 11%, LDL-C 39% (mô hình uống cholesterol) Tuy nhiên, không có sự thay đổi HDL-C giữa các nhóm Về tác dụng bảo vệ gan, BSP liều 0,45 g/kg, làm giảm men gan AST 36%, ALT 33%, MDA 42% và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan

Kết luận: BSP đã thể hiện tác dụng hạ cholesterol máu trên chuột nhắt tăng lipid máu nội sinh

và ngoại sinh ở liều 0,45 g/kg và 0,9 g/kg, tác dụng bảo vệ gan ở liều 0,45 g/kg

Từ khóa: Tăng lipid máu, Hibiscus sabdarifa L Malvaceae, tyloxapol, cholesterol, LD50

ABSTRACT

Background: Hibiscus (Hibiscus sabdarifa L Malvaceae) contains anthocyanin with

antioxidant activity which was cultivated in Vietnam and gained VietGAP standard There is a product from dry powder of Hibiscus calyces, however, none research carries about its effects

Objective: This study was designed to evaluate the hypolipidemic effect of dry powder from

Hibiscus calyces (BSP) in mice

Method: Detemine standards of BSP such as, moisture content, total ash, metal (As, Cd, Pb,

Hg), qualitified determination of anthocyanin total Determine acute toxicity of BSP (LD 50 or

D max) Study the lowering lipidemic effect of BSP in hyperlipidemic mice by tyloxapol (triton WR-1339), i.p., 400 mg/kg and cholesterol, p.o., 25 mg/kg during 6 weeks Quantify total cholesterol, triglyceride, HDL and LDL after studying Study the protective effect in liver of BSP in acute hepatotoxicity mice by ethanol 40%, p.o., 5 g/kg x 3 times each 12 h, quantify level AST, ALT, MDA, GSH 4 hours after the last dose of ethanol and test histopathological liver of mice

Results: BSP gained standards such as, 2.83% moisture content, 0.123% total ash, metal < 10

ppm (As, Cd, Pb, Hg) and 0.215% anthocyanin total BSP did not express acute toxicity in mice at the dose 8.9 g powder/kg The dose 0.45 g/kg BSP (1/20 D max ) showed significantly reduction in serum cholesterol level by 7% and 22% (p < 0.01), triglyceride level by 32% (p < 0.05), LDL level by 63% (p < 0.05) and 45% (p < 0.01) The dose 0.9 g/kg BSP (1/10 D max) also reduced

in serum triglyceride level by 78% (p < 0.05) and cholesterol level by 11%, LDL level by 39% (p < 0.01) However, no significant change in HDL level was observed The dose 0.45 g/kg (1/20 D max ) reduced in AST level by 36%, ALT level by 33%, MDA level by 42% in acute hepatotoxicity

mice

Conclusion: The results indicate that BSP exhibit the hypolipidemic and protective liver effects,

which belong to the used dose in mice

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Rối loạn lipid máu 3

1.1.1 Nguyên nhân 6

1.1.2 Biến chứng 7

1.1.3 Điều trị 7

1.1.4 Hóa dược điều trị rối loạn lipid máu 8

1.2 Đặc điểm bệnh học về gan 10

1.3 Ethanol 11

1.3.1 Chuyển hoá ethanol trong cơ thể 11

1.3.2 Cơ chế gây độc cấp tính 12

1.3.3 Các thuốc bảo vệ gan 13

1.4 Dược liệu nghiên cứu (Bụp giấm - Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) 15

1.4.1 Đặc điểm thực vật 15

1.4.2 Thành phần hóa học 16

1.4.3 Tác dụng dược lý của đài hoa Bụp giấm 17

1.4.4 Công dụng 18

1.5 Mô hình tăng lipid máu 19

1.5.1 Mô hình tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339) 20

1.5.2 Mô hình tăng lipid máu bằng cholesterol đường uống 23

1.6 Mô hình gây tổn thương gan 24

1.6.1 Dùng carbon tetrachlorid (CCl4) gây tổn thương gan 24

1.6.2 Dùng acetaminophen (Paracetamol) gây tổn thương gan 25

1.6.3 Dùng ethanol (EtOH) gây tổn thương gan 25

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Tiêu chuẩn bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 28

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 28

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2 Độc tính cấp của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 30

2.2.1 Súc vật thử nghiệm 30

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3 Tác dụng hạ cholesterol máu của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 34

2.3.1 Súc vật thử nghiệm 34

2.3.2 Hóa chất 34

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4 Tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 35

2.4.1 Súc vật thử nghiệm 35

2.4.2 Hóa chất 35

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.5 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

3.1 Tiêu chuẩn bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 39

3.1.1 Kiểm tra độ màu bằng phương pháp đo quang 39

3.1.2 Định lượng anthocyanin bằng phương pháp đo quang 39

3.1.3 Độ ẩm 39

3.1.4 Tro toàn phần 40

3.1.5 Kim loại nặng 40

3.2 Độc tính cấp của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 41

3.3 Tác dụng hạ cholesterol của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 42

3.3.1 Thử nghiệm tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun trên mô hình tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339) 42

3.3.2 Thử nghiệm tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm trên mô hình uống cholesterol 44

3.4 Tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 46

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

4.1 Kết luận 50

4.2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Apo : Apoprotein

ALT : Alanine aminotransferase

AST : Aspartate aminotransferase

BSP : Bột sấy phun

CETP : Cholesterylester transfer protein

DĐVN : Dƣợc Điển Việt Nam

Dmax : Dose maximum

GSH : Glutathion

HCl : Acid hydrocloric

HDL-C : High density lipoprotein cholesterol

HMG-CoA reductase: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase HTGL : Hepatic triglyceride lipase

IP : Intraperitoneally (tiêm phúc mô)

LCAT : Leucithin cholesterol acyltransferase

SD : Standard Derivatives (độ lệch chuẩn)

SEM : Standard Error of Mean (sai số chuẩn của số trung bình)

TP : Toàn phần

TT : Thuốc thử

VLDL-C : Very low density lipoprotein cholesterol

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339) 22

Bảng 1.2 Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng cholesterol đường uống 23

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu trên mô hình gây tổn thương gan cấp bằng ethanol 26

Bảng 2.1 Các hành vi của chuột cần chú ý trong thời gian theo dõi ………33

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra độ màu bằng phương pháp đo quang của BSP………… 39

Bảng 3.2 Kết quả độ ẩm của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 39

Bảng 3.3 Kết quả tro toàn phần của đài hoa Bụp giấm 40

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 40

Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của BSP 41

Bảng 3.6 Kết quả định lượng cholesterol toàn phần, triglycerid máu, HDL-C và LDL-C của chuột thử nghiệm (mmol/l) 42

Bảng 3.7 Kết quả định lượng cholesterol toàn phần, triglycerid máu, HDL-C và LDL-C của chuột thử nghiệm (mmol/l) 44

Bảng 3.8 Kết quả định lượng AST, ALT, MDA, GSH của chuột thử nghiệm 46

Bảng 3.9 Kết quả vi phẫu gan của các nhóm thử nghiệm (mức độ tăng của các nhóm so với nhóm chứng uống nước cất) 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của lipoprotein 3

Hình 1.2 Cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) 15

Hình 1.3 Vị trí cây Bụp giấm trong bảng phân loại hệ thống thực vật 16

DANH MỤC PHỤ LỤC

PL1 Kết quả định lƣợng lipid máu của các nhóm trong thử nghiệm tác dụng hạ lipid máu của BSP với mô hình tiêm tyloxapol (mmol/l) iPL2 Kết quả định lƣợng lipid máu của các nhóm trong thử nghiệm tác dụng hạ lipid máu của BSP với mô hình uống cholesterol (mmol/l) iiiPL3 Kết quả định lƣợng men gan AST, ALT của các nhóm trong thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan của BSP trên chuột gây độc cấp tính bằng ethanol (U/L) vPL4 Kết quả định lƣợng MDA, GSH của các nhóm trong thử nghiệm tác dụng bảo

vệ gan của BSP trên chuột gây độc cấp tính bằng ethanol viii

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol và bảo vệ gan của bột sấy phun từ

đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae)

Chủ nhiệm đề tài: DS.Lê Thị Lan Phương

Cơ quan chủ trì: Trung Tâm Phát Triển Khoa Học và Công Nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện đề tài: Tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012

giấm trên chuột nhắt trắng

Thử độc tính cấp của bột sấy phun Bụp giấm trên chuột nhắt trắng, xác định được Dmax

Đánh giá tác dụng hạ cholesterol máu

của bột sấy phun Bụp giấm trên chuột

nhắt trắng

Đánh giá tác dụng hạ cholesterol máu của bột sấy phun Bụp giấm trên chuột nhắt trắng với liều 1/20 Dmaxvà 1/10

Dmax trên mô hình tăng lipid máu nội sinh và ngoại sinh

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột

sấy phun Bụp giấm trên mô hình gây

MỞ ĐẦU

Các bệnh lý do oxy hóa đang có xu hướng gia tăng trong xã hội phát triển Trong số

đó, rối loạn chuyển hóa lipid máu, nguyên nhân của các bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành, viêm tụy, … có tỷ lệ ngày càng cao [38], [45], [47]. Chi phí để điều trị những bệnh lý mạn tính này là một gánh nặng không chỉ cho cá nhân mà còn mang tính xã hội và việc sử dụng hóa dược dài ngày để điều trị còn đưa đến nhiều tác dụng phụ nguy hại, đặc biệt là nguy cơ gây viêm gan rất cần được quan tâm Bên cạnh đó, tình trạng tăng men gan, viêm gan do nhiều nguyên nhân khác nhau từ thực phẩm, thuốc…cũng đang ngày càng gia tăng Vì thế, việc tìm kiếm các liệu pháp, thuốc mới có hiệu quả và an toàn hơn là đang là một vấn đề cấp thiết

Trong nguồn nguyên liệu đến từ thiên nhiên vô cùng phong phú của thế giới nói chung và Việt nam nói riêng, có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc có khả năng làm giảm lipid máu đã được chứng minh qua các nghiên cứu và thực tế sử dụng [12] Đặc biệt,

trong số đó có Bụp giấm (Hibiscus sabdarifa L Malvaceae), một loài cây nhiệt đới

có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau và đã được trồng thành công ở Phú Yên, Việt Nam với quy mô rộng và đạt tiêu chuẩn VietGAP Đây không chỉ là nguồn nguyên liệu quý giá cho việc sản xuất chế phẩm mà còn là một phương cách xóa đói giảm nghèo cho nông dân vùng đất khô hạn này Bụp giấm chứa anthocyanin có tác dụng chống oxy hóa rất tốt, ngoài ra còn có alkaloid, chất đường, chất khoáng, acid hữu cơ, Bộ phận thường sử dụng là đài hoa, lá và đôi khi là quả

[26] Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến Bụp giấm như: Tác dụng giảm lipid máu của các polyphenol thông qua sự ức chế quá trình tạo mỡ và thúc đẩy sự thanh thải lipid ở gan, giảm độc tính của Paracetamol trên gan (giảm tế bào số tế bào chết và sự oxy hóa tế bào), hạ huyết áp, [17], [25],[28] Tuy nhiên, ở Việt Nam công trình nghiên cứu về tác dụng của Bụp giấm còn rất ít, chủ yếu là một số nghiên cứu về công dụng của Bụp giấm trong thực phẩm như dùng làm chất màu hoặc lên men làm nước giải khát

Để góp phần đưa sản phẩm từ Bụp giấm vào việc chăm sóc sức khỏe nhân dân, trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol

và bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L

Malvaceae)”, gồm những mục tiêu cụ thể sau:

Xây dựng một số tiêu chuẩn của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm

Đánh giá độc tính cấp đường uống của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt trắng

Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt trắng tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339)

Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt trắng tăng lipid máu bằng cholesterol

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol 40%

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Rối loạn lipid máu

Theo dự đoán, đến năm 2020, trên toàn thế giới, những bệnh mạn tính sẽ chiếm tới 3/4 nguyên nhân gây ra các trường hợp tử vong Trong đó, gần 70% là những bệnh tim mạch, có liên quan đến xơ vữa động mạch Ở nước ta, bệnh vữa xơ động mạch với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, đột tử, nhồi máu cơ tim, nhồi máu não trước đây ít gặp, nay đang có xu hướng tăng nhanh theo nhịp độ phát triển của

xã hội Nguyên nhân của bệnh xơ vữa động mạch chủ yếu là do các rối loạn lipid máu [43]

Đặc điểm sinh lý bệnh [7]

Lipid trong cơ thể được phân bố trong 2 khu vực lớn: Trong tế bào và trong huyết tương Lipid trong tế bào gồm 2 thành phần chính là lipid cấu trúc (tham gia cấu tạo màng tế bào, màng bào quan và màng nhân) và lipid dự trữ (mỡ trung tính: Triglycerid, phospholipid, cholesterol được dự trữ trong các tế bào mỡ) Lipid trong huyết tương không lưu thông dưới dạng tự do, muốn chuyên chở chúng phải kết hợp với các thành phần khác Acid béo tự do (FFA: Free Fatty Acid) gắn kết với các albumin, các triglycerid, phospholipid và cholesterol được chuyên chở dưới hình thức các tiểu phân lipoprotein)

Hình 1.1 Cấu trúc của lipoprotein Lipoprotein được chia làm 5 lớp tùy vào tỷ trọng của chúng: (1) Chylomicron, (2) VLDL-C: Very Low Density Lipoprotein, (3) IDL-C: Intermediate Density Lipoprotein, (4) LDL-C: Low Density Lipoprotein, (5) HDL-C: High Density Lipoprotein

Apoprotein

Cholesterol tự do Phospholipid

Triglycerid, cholesteryl ester

Vận chuyển lipid ngoại sinh

Triglycerid thức ăn được men lipase tụy thủy phân thành acid béo và monoglycerid Tại niêm mạc ruột non, các chất này được hấp thu trong các thể micelle Trong tế bào niêm mạc ruột, tại bộ máy Golgi, triglycerid được tái tạo và cùng cholesteryl ester hình thành phần lõi của chylomicron Sau đó, phospholipid, cholesterol tự do, apo B48, apo AI, apo AII, apo AIV tạo lớp phủ bề mặt thành tiểu phân chylomicron Chylomicron đi vào mạch bạch máu và vận chuyển vào hệ tuần hoàn qua ống ngực Trong huyết tương, HDL-C chuyển apo C, apo E cho chylomicron Khi chylomicron gắn với LPL, apo CII trên bề mặt chylomicron hoạt hóa LPL, LPL hoạt hóa sẽ thủy phân triglycerid thành acid béo và monotriglycerid Acid béo được vận chuyển vào

tế bào mỡ, tế bào cơ để dự trữ dưới dạng triglycerid hoặc sử dụng làm nguồn năng lượng Cơ chế dự trữ triglycerid ở tế bào mỡ này rất quan trọng vì tế bào mỡ không

có khả năng tân tạo mỡ từ glucid như ở gan Một số ít cholesterol ester từ HDL-C đến chylomicron nhờ men CETP Chylomicron mất dần triglycerid trở thành chylomicron tàn dư (chylomicron remnant) Nhờ có apo E trên bề mặt, các tàn dư này được thụ thể tàn dư (hay còn gọi là LDL-C receptor related protein: LRP) ở gan bắt giữ Tế bào gan dị hóa chylomicron tàn dư thành triglycerid dự trữ, cholesteryl ester, còn apo B48 được phân cách thành acid amin Như vậy, triglycerid trong thức

ăn đã được đưa đến mô mỡ và cơ dưới dạng acid béo, còn cholesterol được đưa đến gan để tạo acid mật

Vận chuyển lipid nội sinh

Sự tạo thành và chuyển hóa VLDL-C: Triglycerid và cholesterol (do gan sản xuất hoặc gan đã lấy từ chylomicron tàn dư) được bao bọc bởi phospholipid, cholesterol

tự do và apo B100 để tạo thành VLDL-C Sự gắn kết này cần Microsomal triglycerid transfer protein (MTP), do đó khi bị đột biến MTP, bệnh nhân sẽ có tình trạng không có betalipoprotein (abetalipoproteinemia) mặc dù sự sản xuất ra apo E0 vẫn bình thường Ở người bình thường, kích thước VLDL-C phụ thuộc vào lượng triglycerid ở tế bào gan (lượng cholesterol không ảnh hưởng đến vấn đề này) Nếu lượng triglycerid nhiều, VLDL-C có kích thước lớn, nếu lượng triglycerid ít, VLDL-

C có kích thước nhỏ Khác với chylomicron, phần lớn cholesterol trong lõi của

VLDL-C là cholesterol tự do Vì tốc độ sản xuất ra B100 tương đối ít thay đổi nên

số lượng VLDL-C lưu hành trong máu cũng ít thay đổi, do đó khi ăn nhiều mỡ hoặc gan sản xuất nhiều triglycerid thì chỉ có kích thước VLDL-C thay đổi mà thôi Ở những bệnh nhân đái tháo đường type 2, béo phì, nghiện rượu, tăng triglycerid có tính gia đình, người ta nhận thấy VLDL-C có kích thước lớn, trong khi các bệnh lý tăng lipid máu phối hợp có tính gia đình, tăng betalipoprotein máu lại có tình trạng tăng số lượng VLDL-C

Sau khi VLDL-C vào máu, nó được HDL-C chuyển giao một số apo E và apo C Khi VLDL-C gắn với LPL, apo CII trên bề mặt của VLDL-C hoạt hóa LPL, sau đó LPL thủy phân triglycerid của VLDL-C thành glycerol và acid béo Acid béo được đưa đến các tế bào để dùng làm năng lượng, tại tế bào mỡ, acid béo lại được kết hợp với glycerol thành triglycerid dự trữ Sau khi thủy phân triglycerid, apo CII rời khỏi VLDL-C và lại bị HDL-C bắt giữ

Sau khi bị lấy bớt triglycerid, VLDL-C xẹp dần Cholesterol, phospholipid, apo E trên bề mặt được chuyển cho HDL-C VLDL-C trở thành IDL-C hay còn gọi là VLDL-C tàn dư (VLDL-C remnant) Một phần nhỏ IDL-C bị gan bắt giữ bởi LDL-

C receptor (nhờ apo B100 và apoE) hoặc remnant receptor (nhờ apoE) Phần lớn IDL-C bị lấy bớt triglycerid, apoprotein trở thành LDL-C Thường thì những IDL-C

có nguồn gốc từ VLDL-C lớn đều bị gan bắt giữ chứ không chuyển thành LDL-C Chỉ có những IDL-C bắt nguồn từ VLDL-C kích thước nhỏ mới chuyển hóa tiếp thành LDL-C nhờ apo E và HTGL Khi thiếu hụt apo E hay HTGL sẽ gây ra tình trạng ứ đọng IDL-C trong huyết tương

Chuyển hóa LDL-C: Đa số VLDL-C được chuyển hóa thành LDL-C LDL-C chỉ có một apoprotein duy nhất đó là apo B100, do đó LDL-C chủ yếu được thanh lọc qua con đường LDL-C receptor (75% LDL-C) LDL-C receptor là một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 160 kDa, có trên bề mặt của hầu hết các tế bào trong cơ thể Tế bào của tuyến thượng thận (nơi cần nhiều cholesterol đến tổng hợp hormone)

có mật độ LDL-C receptor cao nhất Số lượng LDL-C receptor ở tế bào gan nhiều nhất trong cơ thể (2/3 số lượng LDL-C được thanh lọc ở gan) và số lượng này tùy

thuộc vào số lượng LDL-C lưu hành trong máu, nếu LDL-C cao thì số lượng receptor tăng và ngược lại, đây chính là cơ chế điều hòa sự ổn định của cholesterol Khi LDL-C gắn vào LDL-C receptor, cả 2 được đưa vào nội bào, sau đó LDL-C được đưa đến lysosome còn LDL-C receptor quay trở lại bề mặt tế bào để tái sử dụng Tại lysosome, thành phần protein của LDL-C là apo B100 bị thoái hóa thành acid amin hay oligopeptid, cholesterol ester bị thủy phân thành cholesterol tự do và được dùng để tổng hợp màng tế bào, hormone, acid mật, nếu dư thì cholesterol tự do lại được ester hóa để dự trữ dưới dạng những giọt nhỏ, khi đó những LDL-C receptor bị thoái hóa để tránh trường hợp quá tải cholesterol cho tế bào Thời gian bán hủy của nó khá dài (2-3 ngày)

Tóm lại, nếu chylomicron là chiếc xe chuyên chở triglycerid ngoại sinh đến mô mỡ

và cơ, triglycerid, cholesterol ngoại sinh đến gan thì VLDL-C chuyên chở triglycerid nội sinh và LDL-C chuyên chở cholesterol nội sinh đến các tế bào của cơ thể Khi LDL-C dư thừa, LDL-C bị peroxide hóa lipid và được nhận diện qua các thụ thể dọn dẹp (scavenger) của thành mạch và đại thực bào Tiến trình này hình thành những tế bào bọt chứa đầy cholesterol dẫn đến xơ vữa thành mạch

1.1.1 Nguyên nhân

Rối loạn chuyển hóa lipid trong cơ thể biểu hiện bằng rối loạn nồng độ các lipid trong huyết tương như cholesterol và/hoặc triglycerid, sự rối loạn nồng độ các chất này cũng là biểu hiện của sự rối loạn chuyển hóa lipoprotein

Tăng lipid trong huyết tương do tăng tạo thành các lipoprotein giàu triglycerid (chylomicron, VLDL-C)

Tăng lipid trong huyết tương do giảm dị hóa triglycerid qua trung gian lipoprotein lipase

Tăng lipid trong huyết tương do giảm dị hóa các sản phẩm tàn dư của Chylomicron

và VLDL-C

Tăng lipid trong huyết tương do giảm dị hóa lipoprotein giàu cholesterol

Tăng lipid huyết tương do rối loạn nhiều giai đoạn điều hòa chuyển hóa lipoprotein

1.1.2 Biến chứng

Càng ngày người ta càng chú ý đến vấn đề rối loạn chuyển hóa lipid vì nó có liên quan mật thiết đến bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành và viêm tụy LDL-C tăng cao sẽ ứ đọng ở thành mạch máu thu hút các đại thực bào đến, gây tổn thương thành mạch Triglycerid tăng quá cao lại gây nên tổn thương và làm suy giảm chức năng của tụy Ngược lại, lipoprotein trong huyết tương quá thấp cũng gây nên các rối loạn chức năng khác của cơ thể

Ngày nay, sự thành lập mảng xơ vữa đã được biết rõ hơn, dường như do tăng cholesterol máu và được thúc đẩy bởi các yếu tố nguy cơ như tăng huyết áp, hút thuốc, tiểu đường, stress và các yếu tố di truyền Mảng xơ vữa được tạo thành từ các

tế bào bọt (foam cell), trong đó có lõi là đại thực bào, LDL-C oxy hóa và lớp mủ sợi (fibrous) ở bên ngoài Lớp mủ sợi được thành lập do đáp ứng viêm và tăng sinh mô sợi dưới tác dụng của cytokin và yếu tố tăng trưởng tiết từ tiểu cầu, đại thực bào, tế bào nội mô Dưới áp suất của dòng máu, các mảng xơ vữa nứt ra, tạo điều kiện cho tiểu cầu gắn vào để hình thành máu khối dẫn đến nghẽn mạch, đau thắt ngực không

ổn định, thậm chí nhồi máu cơ tim

1.1.3 Điều trị [43]

Theo hướng dẫn của ICSI (Institute for Clinical Systems Improvement) năm 2009 Đánh giá mức độ bệnh và nguy cơ rối loạn lipid máu:

Đo nồng độ lipid máu (triglycerid, cholesterol toàn phần, HDL-C, LDL-C)

Cân nhắc nguy cơ bệnh mạch vành (CHD) hoặc các yếu tố nguy cơ bệnh tim mạch khác

Đánh giá nguy cơ cấp hai của bất thường lipid máu như đái tháo đường, suy tuyến giáp

Đề ra mức lipid mục tiêu dựa trên yếu tố nguy cơ

Bước 1: Giáo dục bệnh nhân nâng cao chất lượng cuộc sống, bao gồm: Chế độ ăn, luyện tập thể dục, kiểm soát cân nặng, hạn chế hút thuốc và uống thức uống có cồn, thực phẩm

bổ sung sterol và stanol ester, dầu cá (acid béo omega-3), vitamin E bổ sung

Bước 2: Trị liệu bằng thuốc: Statin kèm theo kiểm soát độ an toàn và các triệu chứng

cơ, chất gắn với acid mật, aspirin, niacin, fibrat (acid fibric), chất ức chế hấp thu cholesterol chọn lọc, điều trị kết hợp, ethyl ester của acid béo omega-3 và dầu cá

Mục đích của điều trị là làm giảm cholesterol toàn phần và LDL-C để ngăn chặn sự phát triển của mảng xơ vữa mới trong mạch vành, làm ngừng tiến triển các mảng xơ vữa đã thành lập và làm tiêu biến các tổn thương Các nghiên cứu cho thấy điều trị bằng chế độ ăn uống và bằng thuốc đã làm giảm tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ tử vong của CDH (Coronary heart disease = bệnh tim mạch vành)

1.1.4 Hóa dược điều trị rối loạn lipid máu [1], [36]

Niacin (nicotinic acid)

Cơ chế tác động: Ở liều cao, niacin ức chế huy động acid béo từ mô mỡ ngoại biên

về gan nên làm giảm tổng hợp và bài tiết VLDL-C khỏi tế bào gan gây giảm triglycerid máu, giảm LDL-C máu, tăng HDL-C máu

Chỉ định: Trị tất cả các dạng tăng lipoprotein máu (trừ dạng thiếu lipoprotein lipase) đặc biệt là dạng tăng triglycerid nặng kèm tăng chylomicron máu hoặc giảm HDL-C Thuốc này rẻ tiền nhất, trị nhiều dạng rối loạn lipid máu nhưng kém dung nạp nhất Tác dụng phụ: Hầu hết bệnh nhân dung nạp kém làm giới hạn trị liệu Niacin tinh thể gây chứng đỏ bừng, gây buồn nôn, khó chịu, làm trầm trọng hơn tình trạng loét

dạ dày, gout, tăng đường máu ở bệnh nhân tiểu đường Suy giảm chức năng gan là tác dụng phụ hiếm gặp nhưng cần quan tâm, thường xảy ra ở dạng phóng thích kéo dài SR

Fibrat (acid fibric)

Cơ chế tác động: Làm giảm VLDL-C do giảm bài tiết ở gan và tăng thoái hóa thông qua lipoprotein lipase nên giảm triglycerid máu (40%), tăng HDL-C máu (20%), tác dụng trên LDL-C thay đổi Nhìn chung, fibrat làm giảm LDL-C khoảng 10%, với bệnh nhân tăng cholesterol máu và tăng triglycerid máu [40]

Tác dụng phụ: Fibrat dễ dung nạp Tác dụng phụ thường gặp nhất là buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy (4-5%) Hiếm gặp hơn là sỏi mật, viêm gan, viêm cơ, phát ban, chóng mặt

Resin gắn mật: Colestipol, cholestyramin, colesevelam

Là nhựa trao đổi anion trùng hợp rất lớn, không hấp thu, không tan trong nước

Cơ chế tác động: Tác dụng chủ yếu là gắn với acid mật ở ruột nên tăng cường sử dụng cholesterol ở gan để tổng hợp acid mật mới bù vào chỗ đã mất Cơ chế bù gây tăng tổng hợp receptor LDL-C (để đưa cholesterol vào tế bào) nên giảm LDL-C máu (15-30%) Sự tăng tổng hợp cholesterol đưa đến tăng sản xuất VLDL-C từ gan Vì resin làm hơi tăng TG máu, cần thận trọng với các đối tượng có triglycerid cao (>

Thuốc ức chế HMG-COA REDUCTASE (Statin)

Cơ chế tác dụng: Dạng hoạt tính của statin có cơ cấu giống chất trung gian CoA là dạng khử, là chất phát sinh trong quá trình tổng hợp cholesterol nên statin ức chế HMG-CoA reductase vì vậy ức chế tổng hợp cholesterol Thiếu cholesterol phát sinh cơ chế bù tăng tổng hợp LDL-C-R nên giảm LDL-C máu, tăng HDL-C và giảm triglycerid máu Ngoài tác dụng giảm cholesterol, statin còn làm giảm sưng viêm, chống tăng sinh và chống oxy hóa nên làm giảm nguy cơ bệnh mạch vành, đột quỵ, Alzheimer và cải thiện tỉ trọng xương của phụ nữ sau mãn kinh

HMG-Chỉ định: Trị rối loạn lipid máu do tăng LDL-C máu Là thuốc hạ LDL-C máu mạnh nhất, an toàn cao, được chấp nhận nhiều nhất Statin sử dụng riêng lẻ hoặc phối hợp với resin hoặc niacin Vì tăng tốc độ tổng hợp cholesterol xảy ra vào ban đêm nên thuốc được dùng vào bữa ăn tối, ngày 1 lần Mức độ hoạt tính của các statin:

Rosuvastatin > Atorvastatin > Simvastatin > Lovastatin > Cerivastatin > Pravastatin

Giữa những tiểu thuỳ gan có các tĩnh mạch cửa (portal vein), từ đó máu đổ vào các mao mạch kiểu xoang (liver sinusoid) nằm giữa bè tế bào gan, và cuối cùng chảy vào tĩnh mạch trung tâm (central vein) ở giữa tiểu thuỳ gan Sau đó máu đổ vào tĩnh mạch gan (hepatic vein) rồi vào tĩnh mạch chủ bụng Giữa các tiểu thuỳ gan cũng có các tiểu động mạch gan, cung cấp máu cho mô ở vách tiểu thuỳ và và các mao mạch kiểu xoang Ngoài ra còn có các mao mạch bạch huyết

Chung quanh tĩnh mạch trung tâm là các bè tế bào gan (bè Remark), xếp theo hình nan hoa Mỗi bè tế bào gan gồm hai lớp tế bào gan (hepatocyte), và giữa các tế bào gan là các tiểu quản mật (bile canaliculus) Các tiểu quản mật này đổ vào ống mật nhỏ (bile ductule), rồi đổ vào ống mật (bile duct) nằm giữa các tiểu thuỳ gan Các ống mật lớn dần và hình thành ống gan (hepatic duct) phải và trái, sau đó rời gan Như vậy, các tế bào gan tiếp xúc một mặt với các tiểu quản mật, một mặt tiếp xúc với máu tĩnh mạch cửa Các mao mạch kiểu xoang được lót bởi một lớp tế bào nội

mô (endothelial cell) và các tế bào Kupffer (Kupffer cell) Lớp nội mô có những cửa

sổ lớn nên các chất từ huyết tương khuếch tán vào khoảng Disse (space of Disse)

giữa các tế bào nội mô và tế bào gan Ngoài ba loại tế bào chính trên, trong mô gan còn có tế bào hình sao (stellate cell), tế bào Pit (Pit cell), tế bào giết tự nhiên (natural killer cell), tế bào ống mật, tế bào cơ trơn [8] Tế bào gan chiếm khoảng 2/3 tổng số lượng tế bào trong gan và 4/5 tổng thể tích gan Chúng chứa nhiều ty thể kích thước lớn, cũng như các tiêu thể và peroxisome Chức năng chính của các tế bào gan là tham gia quá trình chuyển hoá lipid, carbohydrat và protein trong cơ thể Các tế bào này cũng sản xuất các protein huyết thanh như albumin, các yếu tố đông máu và transferring Ngoài ra, các tế bào gan sản xuất vào bài tiết mật, cholesterol, các hormon steroid và đóng vai trò quan trọng trong giải độc các chất lạ sinh học (xenobiotics) thông qua hệ thống cytochrom P450. [52]

Gan đóng vai trò quan trọng trong việc khử chất độc nội và ngoại sinh Quá trình khử độc có hai cơ chế: cố định thải trừ và biến đổi hoá học Như một số kim loại (muối, đồng, chì…) các chất màu (dẫn xuất của phtaleim) vào cơ thể bị gan giữ lại rồi thải nguyên vẹn qua mật Quá trình khử độc bằng biến đổi hoá học có thể theo nhiều phản ứng khác nhau để tạo thành chất ít độc hơn và đào thải ra ngoài

1.3 Ethanol

1.3.1 Chuyển hoá ethanol trong cơ thể

Ethanol (ethyl alcohol, CH3–CH2–OH) là một hợp chất hữu cơ, dễ cháy, không màu

ở nhiệt độ phòng, có khối lượng phân tử là 46 Dalton, trọng lượng riêng là 790 mg/mL, và tạo ra 7,1kcal/g khi oxy hóa Ở người lớn khỏe mạnh, đỉnh hấp thu xảy

ra khoảng 30 phút sau khi uống [6] Ethanol được hấp thu qua đường tiêu hoá bằng

cơ chế khuyếch tán đơn giản [10], với từ 50 đến 85% ở tá tràng và phần trên của ruột non Sau hấp thu, rượu tan trong máu và nước, do có khối lượng phân tử nhỏ nên được phân bố đồng nhất vào tất cả các mô Vì vậy, có thể xác định nồng độ rượu trong bất cứ dịch sinh lý nào [43] Khoảng 85-98% lượng rượu hấp thu sẽ được chuyển hóa oxy hoá ban đầu tại gan tạo cacbon dioxid và nước, phần còn lại (2-10%) sẽ được thải ra nguyên vẹn qua phổi và thận [33]

Ít nhất có ba hệ thống enzym tham gia vào quá trình oxy hoá ethanol thành acetaldehyd tại gan, đó là men alcohol dehydrogenase, hệ thống oxy hoá ethanol thuộc microsome (MEOS) và men catalase, nhưng trên thực tế chỉ alcohol

dehydrogenase đóng vai trò chính Quá trình oxy hoá ethanol được thực hiện qua ba giai đoạn Đầu tiên, ethanol được oxy hoá phần lớn trong bào tương thành acetaldehyd xúc tác bởi men alcohol dehydrogenase (ADH) và một phần qua con đường MEOS xúc tác bởi men CYP2E1 Sau đó, acetaldehyd tiếp tục được oxy hoá thành acetat dưới sự xúc tác của men aldehyd dehydrogenase (ALDH), và cuối cùng các acetat này được giải phóng vào máu, rồi được oxy hoá thành cacbon dioxid và nước tại các mô ngoại biên Ngoài các con đường chính được nêu trên, ethanol còn được chuyển hoá một phần nhỏ qua con đường không oxy hoá để tạo thành các ethyl ester acid béo [15],[33]

1.3.2 Cơ chế gây độc cấp tính

Trong bệnh cảnh lạm dụng rượu cấp, ảnh hưởng của rượu lên hệ thống thần kinh trung ương thể hiện nổi trội nhất Đối với gan, các nghiên cứu trên bệnh cảnh lạm dụng rượu cấp chỉ cho thấy một số các tế bào bị ảnh hưởng, khác với các cơ chế sinh bệnh đa dạng trong tổn thương gan do lạm dụng rượu mạn tính Bảng 1.1

Trong những cơ chế được đề cập ở trên, biến đổi trên hệ thống oxy hoá khử đóng vai trò then chốt và liên quan đến nhiều cơ chế gây tổn thương gan cấp tính do rượu Trong quá trình chuyển hoá rượu quá mức qua phản ứng có sự tham gia của men ADH và ALDH, bước đầu sẽ làm tăng NADH và thay đổi tỷ số NADH+/NAD trong bào tương và ty thể NADH tăng cao trong tế bào dẫn đến sự ức chế quá trình β-oxy hoá chất béo, làm tăng tổng hợp các acid béo, triglycerid và glycerol-3-P, cơ chế chính dẫn đến tình trạng gan nhiễm mỡ Quá trình chuyển hoá rượu sinh ra các ROS bao gồm các superoxid, gốc tự do hydroxyl, và hydrogen peroxid Bên cạnh đó, ethanol làm thay đổi cấu trúc màng ty thể, ngăn chặn sự hấp thu glutathion (một chất chống oxy hoá tự nhiên của cơ thể) vào trong ty thể, gây khiếm khuyết hệ thống chống oxy hoá của ty thể Một khi khả năng chống oxy hoá của tế bào không đủ để chống đỡ các ROS, một stress oxy hoá sẽ xảy bên trong gan Tích tụ các ROS trong gan sẽ gây oxy hoá DNA, oxy hoá protein và bất thường tổng hợp protein, cũng như bất thường hệ thống màng tế bào, dẫn đến tổn thương gan

Bảng 1.1 Cơ chế ảnh hưởng của lạm dụng rượu cấp lên các loại tế bào gan [32]

Mất cân bằng chuyển hoá chất béo

Sự ức chế đáp ứng chống virus gây ra bởi IFN-α lên các virus hướng gan kể cả virus viêm gan C

Làm acetyl hoá histone H3 dẫn đến tăng biểu hiện gen tế bào gan Hạn chế sự tổng hợp protein của gan

Ngăn chặn sự tái sinh của gan sau các thủ thuật phẫu thuật gan từng phần và ức chế hoạt tính của chất kích thích tế bào gan (HSS) bằng cách ngăn chặn chu trình của tế bào gan

Tế bào

Kuffer

Quá trình khởi sự (mồi) nhờ ức chế lipopolysaccharide, giúp tăng

cường giải phóng CC-chemokin in vitro; sự biểu hiện tăng cường

điều hòa của RNA thông tin CC-chemokine; việc khởi sự sử dụng

KC giúp tăng cường giải phóng RANTES Làm giảm độ nhạy của quá trình tổng hợp CC-chemokine, gây ra bởi HIV-1 gp120

Điều hoà sự tổng hợp KC và RANTES, gây ra bởi HIV-1 gp120 Điều hoà sự tổng hợp các gốc oxy phản ứng

Điều hoàn sự dung nạp các lipopolysaccharide

Tế bào

hình sao

Làm mất cân bằng điện thế oxy hoá khử do tăng phóng thích các gốc oxy phản ứng trên sự giảm GSH

1.3.3 Các thuốc bảo vệ gan

Hiện nay một số thuốc bảo vệ gan được chia làm 3 nhóm một cách tương đối: 1- Thuốc chống tác nhân độc gan (Anti Hepatotoxic agent)

2- Thuốc hướng gan (Hepatotropic agent): hỗ trợ hoặc thúc đẩy sự tái tạo mô gan

3- Thuốc bảo vệ gan (Hepatoprotective agent): ngăn chặn các tổn thương gan bằng nhiều cơ chế Do đó, thuốc bảo vệ gan có thể là thuốc chống tác nhân độc gan hoặc thuốc hướng gan, nhưng không ngược lại

Các thuốc bảo vệ gan có thể là các thuốc tổng hợp hoặc thuốc có nguồn gốc tự nhiên, trong đó có dược liệu và các hoạt chất của nó Hiện nay có khoảng 170 thành phần thực vật ly trích từ 110 cây thuốc thuộc 55 họ được báo cáo có hoạt tính bảo vệ gan Điển hình đó là các hoạt chất như coumarin, curcuminoid, lignan, tinh dầu và terpenoid… [44]

Trong các bệnh cảnh tổn thương gan do quá trình chuyển hoá rượu, cũng như các xenobiotic nói chung thì các thành phần chống oxy hoá trong thực vật, đặc biệt là vitamin, flavonoid và acid phenoic, đóng vai trò quan trọng ngăn chặn thay đổi cân bằng trạng thái oxy hoá khử của cơ thể

Silymarin là một flavonolignan ly trích từ hạt của cây Cúc gai Silybum marianum

(L.) Gaertn Hiện nay, silymarin được sử dụng khá phổ biến nhờ vào tác dụng bảo

vệ gan qua nhiều cơ chế đã được nghiên cứu chứng minh, bao gồm [37]:

Chống oxy hóa và ức chế quá trình peroxide lipid

Kích thích enzyme rRNA polymerase và quá trình tổng hợp protein, nhằm tăng khả năng tái sinh của tế bào gan

Tăng cường chức năng giải độc của gan trong pha I

Tăng sự liên hợp các gốc glucuronic trong trường hợp thiếu hụt glutathione Tác dụng kháng viêm gồm các cơ chế: Ức chế sự tổng hợp leukotrien và prostaglandin, ức chế các tế bào Kupffer, cố định sự di chuyển tế bào mast và ức chế sự xâm ập của bạch cầu đa nhân trung tính

Làm chậm hoặc thậm chí làm đảo ngược sự xơ hóa bằng cách làm giảm sự biến đổi của các tế bào stellate thành các nguyên bào sợi cơ

Chống các tác nhân gây ung thư bằng sự ức chế các men chuyển phụ thuộc cyclin và ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư

Tác dụng điều biến miễn dịch (immunomodulatory effect) trên các bệnh lý của gan

Chỉ định của silymarin là giúp hỗ trợ điều trị viêm gan cấp và mãn tính, suy gan, gan nhiễm mỡ, nó còn giúp bảo vệ tế bào gan và phục hồi chức năng gan cho những người uống rượu, bia, bị ngộ độc thực phẩm, hoá chất Ngoài ra, nó còn dùng cho người đang sử dụng các thuốc có hại tới tế bào gan hoặc những người có rối loạn chức năng gan với biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, ăn khó tiêu, vàng da, dị ứng, táo bón

1.4 Dược liệu nghiên cứu (Bụp giấm Hibiscus sabdariffa L Malvaceae)

1.4.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Hibiscus sabdariffa L thuộc họ Bông: Malvaceae

Đặc điểm thực vật: Cây sống một năm, cao 1,5 - 2m, phân nhánh gần gốc, màu tím nhạt Lá hình trứng, nguyên hay chia thùy chân vịt, thùy 3 – 5, hình ngọn giáo dài, nhọn, có răng, cuống lá dài 5 – 10 cm Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như không có cuống Đài con có 8 – 12 mảnh hình chỉ, phần dưới hợp, có lông nhỏ Đài hợp, có lông nhỏ, phiến nhọn dần, nửa dưới màu tím nhạt Tràng màu vàng, hồng hay đỏ, có khi trắng Quả nang, hình trứng, có lông thô, mang đài tồn tại; hạt hình thận [48]

Hình 1.2 Cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae)

Bộ phận dùng: Lá, hạt, đài hoa Đài hoa phơi khô bảo quản được lâu, sau khi ngâm nước lại trở lại trạng thái tươi Sinh thái: Mọc rãi rác trên các bãi hoang ven đường Thường được trồng Ra hoa từ tháng 7 đến tháng 10 Phân bố: Trung Quốc, Ấn Độ, Lảo, Việt Nam (Kontum, Gialai, Phú Yên, Bình Thuận…)

Hibiscus sabdariffa L Malvaceae

Hình 1.3 Vị trí cây Bụp giấm trong bảng phân loại hệ thống thực vật

1.4.2 Thành phần hóa học

Cả lá, đài hoa Bụp giấm đều chứa nhiều acid và protein Các acid chính tan trong nước là acid citric, acid malic, acid tartric, acid hibisci Hoa chứa một chất màu vàng loại flavonol glucosid là hibiscitrin, hibiscetin, gossypitrin và sabdaritrin Hạt chứa 7,6% nước, 22,3% dầu, 24% protein, 13,5% chất xơ, 7% chất khoáng Dầu hột Bụp giấm tương tự như dầu hột bông vải có tác dụng chống nấm và bệnh ngoài da Dầu chứa vitamin và các chất béo không no, có tác dụng tốt đối với người cao tuổi

và người kiêng ăn

Đài hoa của Bụp giấm được sử dụng nhiều nhất do có chứa nhiều các acid hữu cơ, vitamin C và đặc biệt là anthocyanin với hàm lượng đạt 1,5g/kg đài hoa khô, trong

đó, delphinidin và cyanidin là hai anthocyanin chính chiếm 71% và 29% Hạt Bụp

giấm chứa nhiều protein, chất béo và đường Lá được sử dụng phổ biến làm thực phẩm (nghiên cứu năm 2009 của Mady Cisse và các cộng sự về thành phần và tác dụng của Bụp giấm) [26]

Nghiên cứu của Titilauo O Fakeye và cộng sự vào năm 2009 định lượng hàm lượng anthocyanin (cyanidin-3-glycosid) trong các dịch chiết cho thấy: hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết cồn 100% ít nhất 1,23 mg/g, trong khi đó, hàm lượng tìm thấy trong dịch chiết cồn 50% và dịch chiết nước lần lượt là 3,83 mg/g và 3,22 mg/g. [41]

Tính vị, tác dụng [48]

Nước hãm đài hoa chứa nhiều acid hữu cơ có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, lọc máu, giảm áp suất mạch và kích thích nhu động ruột, lại có tác dụng kháng khuẩn và nhuận tràng Lá cũng có tác dụng lợi tiểu, an thần, làm mát Quả chống bệnh scorbut

1.4.3 Tác dụng dược lý của đài hoa Bụp giấm

Tác dụng hạ huyết áp

Thử nghiệm với trà đài hoa Bụp giấm cho hiệu quả giảm huyết áp tâm thu 11.2% và huyết áp tâm trương 10.7% So sánh hiệu quả và mức độ dung nạp của dịch chiết chuẩn trên bệnh nhân tăng huyết áp mức độ trung bình nhẹ cho thấy mức độ giảm huyết tâm thu và tâm trương giảm trên 10% [19]

Dịch chiết đài hoa Bụp giấm gây tác dụng giảm huyết áp theo liều đối với huyết áp trung bình ở chuột cống [2] Dịch chiết còn có tác dụng làm giãn mạch trên vòng động mạch chuột cống bị tăng huyết áp Tác dụng này có thể do con đường chất giãn nitric oxide-cGMP từ nội mô và sự ức chế canxi di chuyển vào bên trong các tế bào cơ trơn mạch máu [3] Sử dụng hằng ngày trà Bụp giấm có thể giảm huyết áp ở người tiền tăng huyết áp và tăng huyết áp độ 1, đồng thời cải thiện hiệu quả chế độ

ăn của người có nguy cơ tim mạch

Tác dụng chống tăng lipid máu

Đài hoa Bụp giấm đã được chứng minh các tác dụng hạ lipid trên mô hình thực nghiệm Dịch chiết đài hoa Bụp giấm khô ở liều 500 và 1,000 mg/kg được cho cũng

với chế độ ăn cholesterol trên chuột cống tăng lipid máu trong 6 tuần cho kết quả giảm đáng kể mức cholesterol huyết thanh lần lượt 22% and 26% (p<0.001); triglycerid huyết thanh lần lượt là 33% và 28% (p<0.05); và LDL huyết thanh lần lượt là 22% và 32%, (p<0.05) HDL huyết thanh không bị thay đổi [56] Các nghiên cứu còn cho thấy dịch chiết nước từ đài hoa cho cả 2 tác dụng chống oxy hoá trong quá trình oxy hoá LDL và tác dụng giảm lipid [20]

Tác dụng bảo vệ gan

Tác dụng bảo vệ của dịch chiết nước và anthocyanin được tác giả Ali và cộng sự (2003) chứng minh trên mô hình chuột cống bị gây độc gan bằng paracetamol Khi cho chuột uống dịch chiết nước trong 4 tuần, các chỉ số sinh hoá chức năng gan được cải thiện, và trên thử nghiệm với anthocyanin liều 200 mg/kg trong 5 ngày mô học gan và các chỉ số sinh hoá giữ nguyên ở mức bình thường [4] Dịch chiết với ethanol (1:1) cho thấy sự giảm đáng kể mức peroxid lipid trên gan bị gây độc bằng carbon tetrachlorid [11]

Acid protocatechuic, một hợp chất phenol phân lập từ Bụp giấm cũng cho thấy tác dụng bảo vệ gan chống lại sự độc tế bào và các vật chất di chuyền của tế bào gan gây bởi t-BHP Một trong những cơ chế tác động của nó có thể liên quan đến khả năng dập tắt các gốc tự do [42]

1.4.4 Công dụng [48]

Lá có vị chua, dùng làm rau ăn Người ta thường dùng đài hoa có vị chua làm gia vị thay giấm, chế nước giải khát, làm mứt Có nơi dùng chế siro hoặc đem phơi khô và nấu lên lấy nước uống Lá dùng như chất thơm và cùng với đài hoa và quả trị bệnh scorbut Đài hoa mọng nước sắc lấy nước uống hay hãm giúp tiêu hóa và trị các bệnh về mật cũng dùng trị bệnh về tim và thần kinh, huyết áp cao và xơ vữa động mạch

Ở Vân Nam (Trung Quốc) đài hoa dùng làm thuốc lợi niệu, hạ huyết áp, trị bệnh về tim, các chứng bệnh về hệ thống thân kinh, khu trừ sán dây, chủ yếu người ta dùng tương quả, dịch quả, quả đông và các loại rượu

1.5 Mô hình tăng lipid máu

Thử nghiệm trên động vật có cholesterol máu bình thường trong sàng lọc ban đầu [46]

Các động vật bình thường nuôi với chế độ ăn thường quy được dùng để nghiên cứu sàng lọc ban đầu Cho uống thuốc qua ống thông hoặc trộn vào thức ăn Ở chuột cống trắng, cho uống thuốc trong 4 ngày và thực hiện phân tích huyết thanh vào ngày thứ 5 của thí nghiệm Các hợp chất làm giảm cholesterol huyết thanh với tỷ lệ

ít nhất 20% ở liều 400 mg/kg được coi là có hoạt tính, và tiếp đó, thử nghiệm các hoạt chất này ở liều thấp hơn Tuy nhiên, một kết quả âm tính không nhất thiết có nghĩa là thuốc sẽ không có tác dụng trên người (Steinberg, 1962) Thử nghiệm này

là một phương pháp đánh gía tác dụng tương đối nhanh và đơn giản, thường dùng để sàng lọc ban đầu

Thử nghiệm trên động vật có tăng cholesterol máu [46]

Gây tăng cholesterol máu ở nhiều loài động vật bằng cách cho mỡ và cholesterol vào thức ăn Chứng tăng cholesterol này có tính chất ngoại sinh Sự sinh tổng hợp cholesterol nội sinh thường diễn ra rất chậm để đền bù cho các nồng độ cao của cholesterol huyết thanh Như vậy, các thuốc có tác dụng chống tăng cholesterol máu bởi chế độ ăn tác động do một hoặc nhiều cơ chế có liên quan với sự ức chế hấp thu cholesterol ở ruột, tăng sự thoái biến cholesterol ảnh hưởng đến sự sản sinh lipoprotein hoặc tăng nhanh sự thải trừ lipoprotein

Chuột cống trắng mới thôi bú có nồng độ huyết thanh bình thường cao gấp 2-3 lần chuột cống trưởng thành có thể sử dụng trong thử nghiệm Chuột cống trắng trưởng thành được gây tăng cholesterol máu bằng cách bổ sung thức ăn với cholesterol 1%,

mỡ và các acid mật (như acid cholic) 1%, và chất đối kháng tuyến giáp propyl thiouracil 0,01% trong nước uống (Wissler và cộng sự, 1954; Anderson và Bowman, 1969; Fukushima và Nakatani, 1969; Nakamara và cộng sự, 1969)

Tăng cholesterol máu gây bởi Estrogen ở chim

Tăng cholesterol máu gây bởi tyloxapol (triton WR-1339)

Tăng cholesterol máu gây bởi Tween 80

Một số nghiên cứu khác: Chuột cống được cho ăn thức ăn chứa 0,2% cholesterol và 10% dầu dừa trong vòng 10 tuần để gây tăng cholesterol (Mon-Yuan Yang và cộng

sự, 2010) Chuột cống dòng Wistar 180-200 g, cho uống cholesterol trong dầu 25 mg/kg trong vòng 30 ngày để gây tăng cholesterol (Pooja C Ochani and Priscilla D’mello, 2009)

Mỗi phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol có một số hạn chế vốn có Như vậy, một thuốc thử nghiệm không thể được chấp nhận hay bị loại bỏ dựa trên một phương pháp duy nhất Sẽ dễ dàng hơn nếu nhà nghiên cứu xem xét cơ chế cơ bản chịu trách nhiệm về tình trạng tăng cholesterol máu của động vật thí nghiệm và

có thể, nếu được biết cơ chế hạ cholesterol máu của thuốc thử nghiệm Ví dụ, tăng cholesterol máu do chế độ ăn chỉ có ích trong việc phát hiện các thuốc có tác dụng trên hấp thu, thoái biến và bài tiết cholesterol Không phát hiện được các thuốc có tác dụng trên sự sinh tổng hợp cholesterol và tăng cholesterol máu được gây do ngoại sinh, và sự tổng hợp cholesterol nội sinh diễn ra với tỉ lệ thấp

Việc sử dụng các động vật có cholesterol máu bình thường để nghiên cứu sàng lọc

sơ bộ có lợi thế về tính chất nhanh và đơn giản, và thường có thể phát hiện các chất

ức chế sự hấp thu và sự tổng hợp cholesterol Phương pháp gây tăng cholesterol máu dùng Triton có lợi thế là nhanh và giúp phát hiện các thuốc có tác dụng trên sự sinh tổng hợp và thải trừ cholesterol Các thử nghiệm này khá đơn giản và nhanh, do đó, thích hợp cho việc nghiên cứu sàng lọc ban đầu

1.5.1 Mô hình tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339)

Tyloxapol (Triton WR-1339) là chất diện hoạt ức chế lipoprotein lipase Công thức phân tử: C44H66O3

Việc dùng toàn thân chất diện hoạt triton WR-1339 cho chuột nhắt và chuột cống trắng nhịn đói không nhịn đói dẫn đến sự tăng các nồng độ cholesterol và triglycerid huyết tương (Tamasa và cộng sự 1968, Fukushima và cộng sự 1969)

Cơ chế: Chứng tăng cholesterol này có 2 giai đoạn Đầu tiên có sự tăng đột ngột các

nồng độ cholesterol huyết thanh, đạt mức đỉnh gấp 2-3 lần số đối chứng vào lúc 24 giờ sau khi cho triton (giai đoạn 1) Tăng cholesterol máu giảm xuống gần với số đối chứng trong vòng 24 giờ tiếp theo (giai đoạn 2)

Cơ chế của tăng cholesterol máu do triton trong giai đoạn 1 được coi là do tăng sinh tổng hợp cholesterol ở gan do khà năng của Triton tác động đến sự tiếp nhận lipid huyết tương bởi các mô (Garrattini và cộng sự, 1959) [46], [35]

Dựa trên các mô hình của những nghiên cứu trước và điều kiện thực tế, chúng tôi quyết định lựa chọn mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol như sau:

Thú vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng 5 – 6 tuần tuổi

Liều tyloxapol: 400 – 500 mg/kg

Đường dùng thuốc: Tiêm phúc mô (i.p.)

Thuốc đối chiếu: Fenofibrat 200 mg/kg

Thời điểm lấy máu: 6 giờ, 12 giờ hoặc 24 giờ sau khi tiêm tyloxapol Cần xác định thời điểm lấy máu tối ưu trước khi tiến hành (thời điểm nồng độ lipid máu tăng cao nhất)

Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid máu, HDL-C và LDL-C)

Bảng 1.1 Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339) Tác giả Năm Thú vật thử

nghiệm

Liều dùng và đường sử dụng

Thời điểm và các thông

số khảo sát Frantz và

Weidong Xie

và cộng sự [50]

2007 Chuột nhắt

trắng đực ICR

Spague-150 mg/kg, IV Định lượng lipid máu 3

giờ sau khi tiêm

1.5.2 Mô hình tăng lipid máu bằng cholesterol đường uống

Bảng 1.2 Một số mô hình gây tăng lipid máu bằng cholesterol đường uống

Tác giả Năm Thú vật thử

nghiệm Liều dùng

Thời điểm và các thông số khảo sát

Emmy Hainida

và cộng sự[46]

2008 Chuột cống

đực Dawley

Spague-Cholesterol 20 mg/kg + 2 g/kg acid cholic

Xét nghiệm lipid máu đầu, cuối thí nghiệm

Xét nghiệm lipid máu sau 30 ngày

2010 Chuột nhắt Thức ăn giàu chất

béo (chứa dầu cọ) với 0,2% (20 mg/10ml/kg) cholesterol trong 6 tuần hoặc 0,1% (10 mg/10ml/kg) cholesterol trong 8 tuần

Xét nghiệm lipid máu sau 6 hoặc 8 tuần

Xét nghiệm lipid máu sau 3 tuần

Dựa trên các mô hình của những nghiên cứu trước và điều kiện thực tế, chúng tôi quyết định lựa chọn mô hình gây tăng lipid máu bằng cholesterol như sau:

Thú vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng 5 – 6 tuần tuổi

Liều cholesterol: 25 mg/kg

Thuốc đối chiếu: Atorvastatin 10 mg/kg

Đường dùng thuốc: Uống (p.o.)

Thời điểm lấy máu: 6 tuần sau khi uống cholesterol liên tục

Chỉ tiêu đánh giá: Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid máu, HDL-C và LDL-C)

1.6 Mô hình gây tổn thương gan

1.6.1 Dùng carbon tetrachlorid (CCl 4 ) gây tổn thương gan

Carbon tetrachlorid được dùng chính yếu làm dung dịch tẩy rửa khô, dung dịch chữa cháy, thuốc phun lúa và dung môi phản ứng Trong nghiên cứu dược lý thực nghiệm tổn thương gan, CCl4 được sử dụng khá phổ biến nhằm mục đích gây suy gan cấp và mạn tính CCl4 được chuyển hoá bởi men CYP2E1, CYP2B và có thể CYP3A, và tạo gốc trichloromethyl, CCl3 Gốc CCl3 này có thể gắn với các phân tử bên trong tế bào gây huỷ hoại nghiêm trọng chức năng tế bào Ngoài tra, nó còn phản ứng với oxy để hình thành gốc tri-chlomethylperoxy CCl3OO, một gốc có hoạt tính cao Quá trình chuyển hoá CCl4 gây tổn thương gan đã được chứng minh gây tổn thương tế bào gan trên động vật thực nghiệm Nồng độ độc chất đạt đỉnh điểm trong gan sau 3 giờ [27]

Một vài cách gây tổn thương gan trên chuột nhắt trắng do CCl4: Theo phương pháp kinh điển tiêm phúc mạc CCl4 trong dầu thực vật (tỷ lệ 1:9) liều 0,7 mg/kg, cách ngày một lần dùng 6 lần Gây mê chuột vào ngày thứ 13 Có tác giả chỉ dùng CCl4một lần tiêm phúc mạc liều 4 ml/kg hoặc 5 ml/kg Favari và Alvares (1997) gây mô hình bằng cách cho chuột nhắt uống CCl4 trong 7 ngày Hai ngày đầu uống dung dịch CCl4 trong dầu thực vật tỷ lệ 1:7, liều 10 ml/kg; năm ngày sau uống với tỷ lệ 1:7, liều 10 ml/kg (như vậy tổng liều là 11,188 ml/kg) [46]

1.6.2 Dùng acetaminophen (Paracetamol) gây tổn thương gan

Paracetamol, một thuốc giảm đau và chống viêm được sử dụng khá phổ biến, có thể gây tổn thương gan nếu dùng ở liều cao Hầu hết Paracetamol chuyển hoá tại gan (90%), gắn kết với sulfat và glucuronid, rồi thải ra nước tiểu Phần còn lại: Một nửa (5%) thải ra nước tiểu dưới dạng nguyên vẹn, một nửa được oxy hoá thành N-acetyl-p-benzoquinon imin (NAPQI) qua cytochrom P450 ở gan (CYP2E1, CYP1A2, CYP3A4) Với liều Acetaminophen thích hợp, tạo ra lượng nhỏ NAPQI,

và nhanh chóng kết hợp với glutathione của gan để tạo thành cystein và mercapturic acid không độc thải ra nước tiểu Tuy nhiên với liều độc con đường gắn kết với sulfat và glucuronid bị bảo hòa, nhiều Acetaminophen được chuyển thành NAPQI qua men cytochrom P450 Khi dự trữ glutathione ở gan giảm gần 70%, NAPQI bắt đầu phản ứng với cấu trúc tế bào gan và tổn thương tế bào gan xảy ra

Gây mô hình tổn thương gan trên chuột nhắt trắng bằng cách cho uống paracetamol với liều 2 g/kg Ngày hôm sau, lại cho thêm một liều paracetamol 1 g/kg nữa Sau 2 ngày, lấy máu và lấy gan làm xét nghiệm. [46]

1.6.3 Dùng ethanol (EtOH) gây tổn thương gan

Mô hình gây độc gan cấp và mạn tính được thực hiện mô phỏng theo tình trạng lạm dụng rượu cấp và sử dụng rượu kéo dài “Lạm dụng rượu cấp” được định nghĩa là dùng quá mức rượu làm tăng nồng độ rượu trong máu tăng trên 0.08% trong vòng khoảng thời gian 2 tiếng, có thể kèm hoặc không kèm theo tình trạng lệ thuộc rượu

trước đó Tuy nhiên tiêu chuẩn xây dựng một mô hình lạm dụng rượu cấp in vivo

gồm: (1) Bất cứ mô hình nào được sử dụng gây được những biến đổi sinh học sau khi dùng một lượng rượu trong khoảng thời gian 2 tiếng trở lại đều có thể chấp nhận

là mô hình “Lạm dụng rượu cấp” (2) Nồng độ rượu trong máu phải ≥ 0.08% để gây các thay đổi sinh học có tính độc với cơ thể (3) Cá thể phải chưa hoặc không bao giờ thuộc tình trạng nghiện rượu [32]

Mô hình chuột lạm dụng rượu cấp được thiết kế đầu tiên bởi tác giả Carson và Pruett (1996), nhằm đạt được nồng độ rượu trong máu, hành vi bị ảnh hưởng và thay đổi sinh lý như trên người say rượu và được tác giả Zhou và cộng sự (2002) cải tiến

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu trên mô hình gây tổn thương gan cấp bằng ethanol

ein -KD, và

chuột chủng

tự nhiên 9 tuần tuổi

Ethanol 3 liều 5 g/kg ethanol (25% kl/tt), mỗi liều cách nhau 12 tiếng

Sau liều cuối cùng 4 tiếng, chuột được gây mê và lấy máu xét nghiệm

Đo nồng độ kẽm, MT thiobarbituric acid-reactive substance (TBARS), glutathione trong mô gan Giải phẫu bệnh

Yang, R và

cộng sự

(2003) [53]

Chuột nhắt đực dòng C57BL/6, cân nặng 20

- 25 g

Ethanol 25% (kl/tt) 3 liều 5 g/kg mỗi liều cách nhau 12 tiếng Sau liều cuối cùng 19 tiếng, chuột được gây mê

và lấy máu và gan xét nghiệm

Định lượng ALT Xác định hoạt tính NF-κB và

sự biểu hiện mRNA của TNF Giải phẫu bệnh

Song và cộng

sự (2006) [39]

Chuột nhắt đực dòng C57BL, 9 tuần tuổi

Ethanol 3 liều 5 g/kg, mỗi liều cách nhau 12 tiếng

Sau liều cuối cùng 4 tiếng, gây mê chuột và lấy kết quả

Định lượng ALT và làm giải phẫu bệnh gan

Ethanol 6 g/kg Chuột được gây mê các thời điểm khác nhau để lấy kết quả

Định lượng ALT và lượng nội độc tố trong huyết tương Giải phẫu bệnh gan

Satoshi Wada

và cộng sự

(2008) [49]

Chuột nhắt đực 8 tuần tuổi, dòng C57BL/6

Liều thử nghiệm: 1, 3, và 5 g/kg Thời gian tác dụng:

ethanol 3 g/kg (40% tt/tt) đường uống Lấy máu xét nghiệm sau 0 giờ, 2 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ

Định lượng RT-PCR, phân tích lipid gan, giải phẫu bệnh

Kim, S J và

cộng sự

(2008) [24]

Chuột nhắt đực dòng C57BL, cân nặng 25 –

30 g

Ethanol 50% 3 lần, mỗi lần cách nhau 12 giờ Sau liều ethanol cuối cùng 4 giờ, chuột được gây mê, lấy máu và gan xét nghiệm

Định lượng ALT máu, GSH và sự peroxid mỡ trong gan; TNFα huyết thanh; Cystein, cystin; Xác định methionine, hypotaurine và taurin Giridhar

Kanuri và

cộng sự

(2009) [23]

Chuột 6 tuần tuổi, dòng C57BL/6J

Ethanol liều duy nhất 6 g/kg, đường uống Lấy máu sau 12 tiếng

Giải phẫu bệnh đánh giá

sự tích tụ mỡ trong gan Xác định lượng nitrit, triglyceride, nội độc tố trong gan

Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và các nghiên cứu trước, chúng tôi lựa chọn

mô hình để tiến hành nghiên cứu thực nghiệm dược lý trong đề tài này như sau: Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng

Liều sử dụng: 5 g/kg, tổng cộng 3 liều cách nhau 12 tiếng,

Đường dùng: Uống qua ống kim (p.o.)

Thời điểm đo kết quả: 4 tiếng sau liều ethanol cuối

Thuốc đối chiếu: Silymarin 50 mg/kg

Chỉ tiêu đánh giá: AST, ALT máu MDA, GSH gan Giải phẫu bệnh

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Tiêu chuẩn bột sấy phun đài hoa Bụp giấm

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae), do Trung

tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu Miền Trung cung cấp

Tất cả mẫu nghiên cứu được cung cấp vào tháng 02/2011, mẫu lưu tại Bộ môn Bào chế Đông dược - Khoa Y Học Cổ Truyền - ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh

Quy trình sản xuất bột sấy phun Bụp giấm:

Đài hoa Bụp giấm 50 kg ngâm trong 200 lít nước (đạt tiêu chuẩn nước uống) ở

80oC trong 60 phút Rút dịch chiết 1

Thêm 100 lít nước ở 80oC trong 60 phút Rút dịch chiết 2

Trộn đều dịch chiết 1 và 2, lọc qua vải thu được 215 lít dịch chiết 3

Trộn dịch chiết 3 với maltoz-dextrin từ 10-13%

Sấy phun, thu được bột sấy phun (BSP) với độ ẩm < 5%

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Kiểm tra độ màu bột sấy phun bằng phương pháp đo quang

Cân chính xác 50 g BSP với 450 g nước tinh khiết, đun đến khi sôi trong vòng 5 giây Để nguội 15 phút, lọc qua vải lấy dịch lọc 1 Cân chính xác 10 g dịch lọc 1 với

90 g nước tinh khiết, khuấy đều được dịch 2 Cân chính xác 5 g dịch 2 với 45 g dung dịch đệm pH = 3, khuấy đều và lọc qua giấy lọc, thu được dịch lọc 3

Mẫu trắng: nước tinh khiết Đo độ hấp thu của dịch lọc 3 ở các bước sóng: 523 nm,

412 nm và 605 nm

Yêu cầu:

Ở bước sóng 523 nm, trị số phải > 400 (đây là trị số chính để xác định độ màu của BSP), ở bước sóng 412 nm, trị số phải từ 100 – 200 và ở bước sóng 605 nm, trị số phải < 30