2.4.1. Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt đực trắng chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, khối lƣợng từ 18 - 22 g) đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur TP.Hồ Chí Minh.
2.4.2. Hóa chất
Silymarin 10g - Sigma, ethanol tuyệt đối, formol… loại PA, Trung Quốc. Thức ăn cho chuột mua ở Viện Pasteur TP.Hồ Chí Minh.
36
2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Chuột thử nghiệm nuôi ổn định trƣớc 1 tuần, chia chuột làm 5 nhóm (n = 7).
Lô chứng : Uống nƣớc cất.
Lô gây độc : Uống ethanol 40% liều 5 g/kg (0,15 ml ethanol 40%/10g chuột) x 3 lần mỗi 12h (7h sáng, 7h tối, 7h sáng) bằng đƣờng uống (p.o.).
Lô đối chiếu : Uống Silymarin 50 mg/kg. Sau đó gây độc bằng ethanol giống nhƣ lô gây độc.
Lô thử 1 : Uống BSP 2 tuần, mỗi ngày một lần vào 8 – 9h sáng, liều 1/20 LD50 hoặc Dmax. Sau đó gây độc bằng ethanol giống nhƣ lô gây độc.
Lô thử 2 : Uống BSP 2 tuần, mỗi ngày một lần vào 8 – 9h sáng, liều 1/10 LD50 hoặc Dmax. Sau đó gây độc bằng ethanol giống nhƣ lô gây độc.
4 giờ sau khi gây ngộ độc bằng ethanol hoặc uống liều cuối cùng, chuột đƣợc gây mê và tiến hành giải phẫu lấy máu tĩnh mạch và gan, thực hiện các xét nghiệm xác định GSH, AST, ALT. Tách lọc gan để khảo sát hình thái mô học.
Tiến hành cân, kiểm tra trọng lƣợng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trƣớc và trong thí nghiệm hằng tuần.
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các aminotransferase (AST và ALT)
Chuột sau khi bị gây mê sẽ đƣợc lấy máu toàn phần từ tim và đựng trong ống có chứa chất chống đông heparin, ly tâm lấy huyết thanh định lƣợng AST, ALT.
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng malondialdehyde (MDA) và glutathione (GSH)
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15% theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-5oC. Lấy 2 ml dịch đồng thể thêm vào 1 ml dung dịch đệm Tris 0 HCl, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricoacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, và lấy dịch trong. Tiến hành định lƣợng hàm lƣợng MDA và GSH trong gan chuột nhƣ sau:
37
Xác định hàm lƣợng MDA [6]: Lấy 2 ml dung dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 15 phút và đo quang ở λ = 532 nm. Hàm lƣợng MDA (nM/ml) đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy chất chuẩn MDA.
y = 0,0637x – 0,0029 (R2 = 0,9981) CnMMDA/ml dịch đt = (OD thử + 0,0029) / 0,0637 Sau khi tính đƣợc hàm lƣợng MDA (nM/ml) dịch đồng thể, suy ra hàm lƣợng MDA (nM/g protid) theo công thức.
C = CnMMDA/ml dịch đồng thể x 1000 / Cprotid Với Cprotid = 36,629 (mg protid / ml dịch đồng thể ) Tính toán kết quả:
- Hàm lƣợng MDA trong các mẫu thử (nM/ml) đƣợc tính theo công thức: C thử = (ODthử / ODchuẩn) x Cchuẩn
Trong đó: OD là mật độ đo quang C là Hàm lƣợng MDA (nM/ml)
-Hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) đƣợc tính theo công thức: HTCO (%) = ((CMDA chứng - CMDA thử) / CMDA chứng ) / 100
Xác định hàm lƣợngGSH [30]: Lấy 1ml dịch trong cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA phosphate vừa đủ 3 ml. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng sau đó tiến hành đo quang ở bƣớc song λ = 412 nm. Hàm lƣợng GSH (nM/g protid) đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH.
y = 0,0022x – 0,0334 (R2 = 0,998)
→ CnMMDA/ ml dịch đồng thể = (OD thử + 0,0334) / 0,0022
Sau khi tính đƣợc hàm lƣợng GSH (nM/ml) dịch đồng thể, suy ra hàm lƣợng GSH (nM/g protid) theo công thức.
C = CnMGDH/ml dịch đồng thể x 1000 / Cprotid Với Cprotid = 36,629 (mg protid / ml dịch đồng thể )
38
Giải phẫu bệnh
Sau khi lấy máu, chuột đƣợc mổ, tách gan và thận chuột, cố định trong dung dịch formol 10%. Sau đó mẫu mô sẽ đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp thƣờnng quy và đúc tiêu bản trong parafin và cắt thành lát dày 4 μm để nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) để quan sát trên kính hiển vi ở vật kính hiển vi. [46]