KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHỨC NĂNG TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM Hibiscus sabdariffa L.

TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Kỹ thuật chiết xuất, xác định thành phần hóa học và hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang chức năng từ đài hoa bụp giấm Hibiscus sabdariffa L.” được tiến h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU

VANG CHỨC NĂNG TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM

Hibiscus sabdariffa L

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỤY THANH THẢO

TRẦN ĐÌNH THẢO Ngành : CÔNG NGHỆ HÓA HỌC Niên khóa : 2005 - 2009

Tháng 08/2009

KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHỨC NĂNG

TỪ ĐÀI HOA BỤP DẤM Hibiscus sabdariffa L

Giáo viên hướng dẫn:

Tiến sĩ PHAN PHƯỚC HIỀN

Kỹ sư TRỊNH THỊ PHI LY

Tháng 08 năm 2009

LỜI CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn TS Phan Phước Hiền, KS Trịnh Thị Phi Ly, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

để chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này

Xin gởi lời cảm ơn đến toàn thể Thầy Cô Bộ môn Công Nghệ Hóa Học và Thầy

Cô Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng tôi trong những năm học tại trường

Xin cảm ơn toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, chia sẽ những khó khăn với chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chúng con thành kính cảm ơn cha mẹ đã sinh ra và nuôi dưỡng chúng con nên người, cùng gia đình đã giúp đỡ, ủng hộ và động viên chúng con trong suốt quá trình học tập

Tp.HCM, tháng 08 năm 2009 Nguyễn Thụy Thanh Thảo Trần Đình Thảo

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Kỹ thuật chiết xuất, xác định thành phần hóa học và

hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang chức năng từ đài hoa bụp giấm Hibiscus

sabdariffa L.” được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi

trường và phòng thí nghiệm I4 trực thuộc bộ môn Công Nghệ Hóa Học, trường Đại

học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện: từ 01/03/2009 đến

10/08/2009 Phần nghiên cứu của đề tài gồm các thí nghiệm sau:

¾ Khảo sát tính chất hóa lý của nguyên liệu

¾ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (ethanol – nước – HCl) lên hiệu suất

quá trình chiết

¾ Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu (điều kiện thường và bảo

quản lạnh trong 48h) lên hiệu suất chiết

¾ Xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết bằng phương pháp pH vi sai

¾ Xác định thành phần hóa học của đài hoa bụp giấm trích từ cao n- hexane bằng

sắc ký khí ghép khối phổ GC – GC/MS

¾ Xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ đài hoa bụp giấm khô: Khảo sát ảnh

hưởng của tỷ lệ men, nồng độ đường đến sản phẩm rượu vang

¾ Đánh giá, kiểm tra sản phẩm rượu vang theo TVCN 3217 – 79; TCVN 7045 – 2002

Kết quả thu được như sau:

¾ Độ ẩm của đài hoa bụp giấm khô xác định theo phương pháp cân khối lượng là

11,6%, độ Brix trung bình của đài hoa bụp giấm là 1,17độ Brix

¾ Tỷ lệ dung môi cồn : nước : HCl=28 : 72 : 1 và điều kiện bảo quản lạnh (-20oC)

là thích hợp nhất để hàm lượng anthocyanin trích ly được là cao nhất

(13,314 mg/g)

¾ Phân tích được thành phần hóa học của dịch chiết đài hoa bụp giấm bằng

phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) Kết quả phân tích GC/MS cho

thấy, một số cấu tử có hàm lượng cao của dịch chiết đài hoa bụp giấm bằng

phương pháp soxhlet với dung môi n – hexane là: n-Hexadecanoic acid

(23,28%), 9,12-Octadecadiennoic acid (18,53%), Heneicosane (8,63%);

9,17-Octadecadienal (8,94%)

¾ Độ Brix và tỷ lệ men ban đầu thích hợp nhất cho sản phẩm rượu vang bụp giấm

là 29 độ Brix và 12%

¾ Sản phẩm rượu vang bụp giấm xếp loại khá theo TCVN 3217 – 79

¾ Phần trăm màu bị polymer hóa của sản phẩm rượu vang là 29,49%

¾ Hàm lượng vitamin C còn lại trong sản phẩm rượu vang bụp giấm là 17,23%

ABSTRACT

The theme of research on “Extraction technique, chemical component determination and improvement of process in producing functional wine from

Hibiscus sabdariffa L.’s calyx” was carried out in Research Institute For

Biotechnology and Environment and I4 lab belonging to Chemical Engineering Department, Agriculture and Forestry University, Ho Chi Minh city Time performing from 01/03/2009 to 10/08/2009

¾ Studying physicochemical property of material

¾ Studying influence of slovent ratio (ethanol – water – HCl) on efficiency of extract processing

¾ Studying influence of material treatment (normal condition and cold preservation for 48 hours) on efficiency of extract processing

¾ Determination of anthocyanin content in Hibiscus extraction by pH – differential spectrophotometry

¾ Determining chemical components of Hibiscus extraction by Gas Chromatography – Mass Spectrometry method (GC – MS)

¾ Production wine from dry Hibiscus sabdariffa L.’s calyx: Studying influence of ration yeast, sugar concentration on product wine

¾ Quality control of wine basing on vietnamese standard 3217 – 79; 7045 – 2002

Results:

¾ Moisture of Hibiscus sabdariffa’s dry calyx determined by weight mass

method were 11,6%, average Brix degree of extraction juice from Hibiscus sabdariffa’s calyx was 1,17

¾ Solvent ratio ethanol: water: HCl=28 : 72 : 1 and cold condition storage (-20oC) were suitable to attain highest content anthocyanin (13,314w/w)

¾ Analysing chemical components of Hibiscus extraction by GC/MS The result

of this analysis indicates that, some components having high extracted Hibiscus sabdariffa’s calyx content by method Soxhlet with n – hexane solvent were:

n-Hexadecanoic acid (23,28%), 9,12-Octadecadiennoic acid (18,53%), Heneicosane (8,63%), 9,17-Octadecadienal (8,94%)

¾ Most suitable Brix degree and ratio yeast for product wine were 29 Brix degree and 12%

¾ The wine product is approved to be good basing on Vietnamese standard

3217 – 79

¾ Vitamin C content in wine product is 17,23%

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT v

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH xii

DANH SÁCH CÁC BẢNG xiii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về cây bụp giấm 3

2.1.1 Phân loại thực vật và mô tả 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

2.1.3 Thành phần hoá học 4

2.1.3.1 Polyphenol 4

2.1.3.2 Carbohydrate 4

2.1.3.3 Acid hữu cơ 5

2.1.3.4 Vitamin 5

2.1.3.5 Khoáng chất 5

2.1.4 Thành phần các kích thích tố thực vật và các hoạt chất sinh học khác .6

2.2 Tác dụng dược liệu của cây bụp giấm 7

2.3 Hợp chất anthocyanin trong bụp giấm 9

2.3.1 Định nghĩa 9

2.3.2 Phân loại 10

2.3.3.Tính chất 10

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin 11

2.4.1 Ảnh hưởng của pH 11

2.4.2 Ảnh hưởng của cấu trúc hóa học 12

2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12

2.4.4 Ảnh hưởng của nước 13

2.4.5 Ảnh hưởng của oxi 13

2.4.6 Ảnh hưởng của SO2 13

2.5 Hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất anthocyanin 14

2.5.1 Quá trình oxy hoá và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hoá 14

2.5.2 Tính chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin 15

2.5.3 Ứng dụng khả năng chống oxy hoá của bụp giấm và hợp chất anthocyanin .15

2.6 Rượu vang 16

2.6.1 Giới thiệu về rượu vang 16

2.6.1.1 Định nghĩa 16

2.6.1.2 Thành phần hóa học của rượu vang 16

2.6.2 Nấm men trong sản xuất rượu vang 19

2.6.2.1 Hình dạng và kích thước 19

2.6.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men 19

2.6.2.3 Sự sinh sản của nấm men 20

2.6.2.4 Sự sinh trưởng của nấm men 20

2.6.2.5 Những yêu cầu đối với nấm men vang 20

2.6.3 Cơ chế quá trình lên men rượu 20

2.6.3.1 Cơ chế 20

2.6.3.2 Diễn biến của quá trình lên men rượu 21

2.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong lên men rượu vang 21

2.6.4.1 Oxy 21

2.6.4.2 Nhiệt độ 21

2.6.4.3 Hàm lượng đường 22

2.6.4.4 pH của môi trường 22

2.6.4.5 Nguồn Nitơ 22

2.7 Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC/MS -Gas Chromatography

Mass Spectometry) 23

2.7.1 Sắc ký khí (GC - Gas Chromatography) 23

2.7.2 Khối phổ 24

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 26

3.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 26

3.2.1 Vật liệu 26

3.2.1.1 Đài hoa bụp giấm 26

3.2.1.2 Chủng nấm men 26

3.2.1.3 Môi trường nhân giống nấm men 26

3.2.2 Hóa chất và thiết bị 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.3.1 Xác định chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu 28

3.3.1.1 Xử lý nguyên liệu 28

3.3.1.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 28

3.3.1.3 Xác định độ Brix của dịch chiết đài hoa bụp giấm 29

3.3.2 Khảo sát quá trình trích ly anthocyanin 29

3.3.2.1 Xác định hàm lượng anthocyanin có trong dung dịch trích ly 30

3.3.2.2 Quy trình trích ly 32

3.3.2.3 Cách pha dung dịch đệm 34

3.3.2.4 Xác định bước sóng hấp thu cực đại 34

3.3.2.5 Hiệu suất quá trình trích ly anthocyanin 34

3.3.3 Phân tích thành phần hóa học của dịch chiết đài hoa bụp giấm 34

3.3.3.1 Phương pháp Soxhlet 35

3.3.3.2 Phương pháp phân tích thành phần 36

3.3.4 Phương pháp chế biến rượu vang từ đài hoa bụp giấm 37

3.3.5 Phương pháp polyanthocyanin 38

3.3.6 Xác định hàm lượng Vitamin C (acid Ascorbic) 40

3.4 Phương pháp xử lý số liệu .41

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Tính chất lý hóa của nguyên liệu 42

4.1.1 Độ ẩm 42

4.1.2 pH và độ Brix của dịch chiết từ đài hoa bụp giấm 42

4.1.3 Hàm lượng vitamin C trong đài hoa bụp giấm 43

4.2 Khảo sát điều kiện trích ly anthocyanin 44

4.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trích ly 44

4.2.2 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản 45

4.2.3 Hiệu suất trích ly 46

4.3.Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của đài hoa bụp giấm 48

4.4 Kết quả nghiên cứu chế biến sản phẩm rượu vang từ đài hoa bụp giấm 49

4.4.1 Quy trình chế biến rượu vang bụp giấm 50

4.4.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự biến đổi của hàm lượng chất khô hòa tan trong dịch lên men ở các nghiệm thức nghiên cứu 51

4.4.3 Kết quả khảo sát độ cồn của rượu vang ở các nghiệm thức nghiên cứu 53

4.4.4 Kết quả phân tích độ acid của rượu vang ở các nghiệm thức nghiên cứu 55

4.4.5 Kết quả khảo sát hàm lượng đường tổng số của rượu vang ở các nghiệm thức nghiên cứu 56

4.4.6 Kết quả phân tích hàm lượng methanol trong sản phẩm rượu vang 56

4.5 Kết quả đánh giá cảm quan 56

4.5.1 Kết quả đánh giá cảm quan bằng phương pháp so hàng 56

4.5.2 Kết quả đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm 57

4.6 Kết quả một số chứng minh rượu vang là sản phẩm chức năng 58

4.6.1 Phần trăm màu bị polymer hóa 58

4.6.2 Hàm lượng vitamin C của sản phẩm rượu vang 59

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Đề nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

LD50: Median lethal dose

AND: Acid deoxyribonucleic

BHA: Butylated hydroxyanisole

V: thể tích

LC: Liquid Chromatography

TR: Retention time

NIST: National Institute of Standards and Technology

A420nm: Độ hấp thu đo ở bước sóng 420nm

λ

A vis-max: Độ hấp thu cực đại

NT: Nghiệm thức

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cây bụp giấm 3

Hình 2.2: Công thức phân tử tổng quát anthocyanin 10

Hình 2.3: Cấu trúc chuyển hoá anthocyanin trong nước 11

Hình 2.4: Sắc đồ của sắc ký khí 24

Hình 3.1: Đài hoa bụp giấm khô 26

Hình 3.2: Quy trình khảo sát điều kiện trích ly anthocyanin 33

Hình 3.3: Quy trình chiết xuất bằng Soxhlet 35

Hình 3.4: Chương trình nhiệt của máy sắc ký khối phổ GC/MS 36

Hình 3.5: Máy sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 37

Hình 3.6: Sự tạo thành anthocyanin - sulfonic acid không màu 38

Hình 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (cồn : nước : HCl) đến hàm lượng anthocyanin trích ly được 44

Hình 4.2: Hiệu suất trích ly anthocyanin trong 3 lần trích 47

Hình 4.3: Sắc ký đồ GC/MS kết quả phân tích thành phần hóa học của đài hoa bụp giấm trích ly theo phương pháp soxhlet trong dung môi n – hexane 48

Hình 4.4: Quy trình chế biến rượu vang bụp giấm 50

Hình 4.5: Sự biến đổi độ Brix của các nghiệm thức sau 10 ngày lên men chính 52

Hình 4.6: Độ cồn của các nghiệm thức sau 10 ngày lên men chính 54

Hình 4.7: Phần trăm màu bị polymer hoá của sản phẩm rượu vang ở các nghiệm thức .59

Hình 4.8: Sản phẩm rượu vang bụp giấm 60

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Thành phần hoá học của đài hoa bụp giấm 6

Bảng 2.2: Các flavonoid có trong tự nhiên 10

Bảng 3.1 Tỷ lệ dung môi trích ly 32

Bảng 3.2: Các nghiệm thức thí nghiệm trong phương pháp chế biến rượu vang từ đài hoa bụp giấm khô .37

Bảng 4.1: Độ ẩm của nguyên liệu 42

Bảng 4.2: Độ Brix của dịch chiết đài hoa 43

Bảng 4.3: Kết quả phân tích hàm lượng Vitamin C trong đài hoa bụp giấm 43

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hàm lượng anthocyanin trích ly được 44

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu 46

Bảng 4.6: Hiệu suất trích ly anthocyanin 47

Bảng 4.7: Một số hợp chất chính trong phần dịch chiết Soxhlet bằng n – hexane 49

Bảng 4.8: Sự thay đổi độ Brix ở các nghiệm thức sau 10 ngày lên men 52

Bảng 4.9: Độ cồn của các nghiệm thức sau 10 ngày lên men chính 54

Bảng 4.10: Acid tổng số của các nghiệm thức sau 10 ngày lên men 55

Bảng 4.11: Hàm lượng đường tổng của rượu vang ở các nghiệm thức sau 10 ngày lên men 56

Bảng 4.12: Hàm lượng methanol trong sản phẩm rượu vang 56

Bảng 4.13: Kết quả đánh giá cảm quan bằng phương pháp so hàng 57

Bảng 4.14: Kết quả đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm 58

Bảng 4.15: Chỉ số phai màu, màu bị polymer hoá và chỉ số hoá nâu của sản phẩm rượu vang 58

Bảng 4.16: Kết quả phân tích hàm lượng Vitamin C trong rượu vang 59

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây bụp giấm, Hibiscus sabdariffa L., thuộc họ Bông bụp (Malvaceae) Với vị

chua đặc trưng, hoa lá và đài quả bụp giấm có thể sử dụng để nấu canh chua hay ăn thay rau có tác dụng thanh nhiệt, thông tiểu, ngoài ra còn làm mát gan, tăng tiết mật Bụp giấm chứa rất nhiều polysaccharid trong chất nhầy (có ở tất cả các bộ phận của cây đặc biệt là trong đài quả), có tác dụng làm giảm cholesterol máu do đó ngăn ngừa

và hạn chế sự béo phì do tích mỡ Hai hợp chất flavonoid và cyanidin cũng có tỷ lệ cao trong thành phần của cây, có tính chống oxy hoá, bảo vệ thành mạch máu, giúp ngăn ngừa các bệnh tim mạch và ung thư Các Vitamin C, A, nhóm B, E…cùng nhiều loại axit hữu cơ khác cũng đã được tìm thấy trong cây bụp giấm Một số nhà nghiên cứu đã xác định tính chống co thắt, hạ huyết áp, kháng khuẩn, hạn chế sự tạo sỏi ở đường tiết niệu, chống lão hoá, chống mệt mỏi… của bụp giấm [32]

Ngoài ra lâu nay người ta đã biết đến bụp giấm là một loại cây rất giàu chất màu anthocyanin

Màu sắc được xem là một trong những chỉ tiêu quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm thực phẩm Nó làm tăng vẻ đẹp, tạo tính hấp dẫn không thể thiếu của sản phẩm thực phẩm đối với người tiêu dùng Chính điều này mà các nhà sản xuất đã cho ra hàng loạt các chất màu thiên nhiên và tổng hợp nhằm đáp ứng nhu cầu sản phẩm thực phẩm

Ngày nay, các chất màu tự nhiên đang được sử dụng rộng rãi trong quá trình chế biến thực phẩm và nước giải khát bên cạnh chất màu tổng hợp Năm chất màu tự nhiên: atnatto, anthocyanin, beetroo, turmeric, carmine được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm Trong đó chất màu anthocyanin được biết đến nhiều nhất

Anthocyanin có mặt trong hầu hết thực vật bậc cao, chúng hiện diện trong hoa quả và các bộ phận của cây trồng Sự quan tâm đến anthocyanin gần đây được chú trọng thay cho sự giảm liên tục các chất màu thực phẩm tổng hợp Anthocyanin được xem như chất màu thay thế cho các phẩm màu cấm sử dụng vì chúng có những ưu

điểm sau: không gây hại cho người và động vật, có màu tươi sáng đặc biệt là vùng đỏ, tan trong nước, điều này làm đơn giản việc phối hợp chúng trong sản phẩm thực phẩm

Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý báu như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng

để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa cho các sản phẩm thực phẩm Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng [22]

Do đó để góp phần vào việc nghiên cứu và hiểu rõ hơn về giá trị quý báu của cây bụp giấm đồng thời được sự đồng ý của nhà trường và Bộ môn Công Nghệ Hóa Học với sự hướng dẫn của TS Phan Phước Hiền, KS Trịnh Thị Phi Ly chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Kỹ thuật chiết xuất, xác định thành phần hóa học và hoàn thiện

quy trình sản xuất rượu vang chức năng từ đài hoa bụp giấm Hibiscus sabdariffa L.”

9 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu

9 Khảo sát quy trình chiết anthocyanin trong đài hoa bụp giấm từ hệ dung môi cồn – nước – HCl

9 Xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết bằng phương pháp pH vi sai

9 Xác định thành phần hóa học đài hoa bụp giấm

9 Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang từ đài hoa bụp giấm

9 Phân tích, kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu vang theo TCVN 3217 – 79; TCVN 7045 – 2002

9 Xác định hàm lượng vitamin C, phần trăm màu bị polymer hóa trong sản phẩm rượu vang

Chương 2

TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cây bụp giấm

2.1.1 Phân loại thực vật và mô tả

+ Tên khoa học: Hibiscus sabdariffa L

+ Tên Việt Nam: Bụp giấm, bụt giấm, đay Nhật

+ Tên nước ngoài: roselle, red sorrel, karkadè

Bụp giấm được xếp vào ngành hạt kín Angiospermae, lớp hai lá mầm, phân lớp

Rosids, bộ Bông Malvales, họ Bông Malvaceae, chi Bông Hibiscus

Hình 2.1: Cây bụp giấm

(Nguồn:http://toptropical.com/pics/garden/m1/Podarki3/Hibiscus_sabdariffa107031Ol

gaB.jpg) Bụp giấm là cây sống một năm, cao 1,5 - 2m, phân nhánh gần gốc, màu tím nhạt Lá hình trứng, nguyên, mép lá có răng Hoa to mọc riêng lẻ ở kẽ lá, màu vàng, ở giữa màu đỏ tím sẫm; đài phụ (tiểu đài) gồm 8 – 12 cánh hẹp, phần dưới dính liền, có lông nhỏ, nở xoè ra và gập xuống; đài chính to, các lá đài dày, nhọn đầu, mọng nước màu đỏ tía Tràng hoa màu vàng hồng hay tía, có khi trắng Quả nang hình trứng, có lông thô mang đài màu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả Cây ra hoa từ tháng 7 đến tháng

10

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Bụp giấm phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á và châu Phi Ở Ấn Độ có khoảng 40 loài, Việt Nam có khoảng 23 loài… Nhiều loài cây trồng làm cảnh, làm thuốc và làm rau ăn

Bụp dấm có nguồn gốc ở Tây Phi Hiện có hai loại được trồng tương đối phổ

biến ở Ấn Độ, Malaysia, Philippin và Indonesia… là Hibiscus sabdariffa L var sabdariffa (trồng để lấy đài ăn và làm thuốc) và Hibiscus sabdariffa var altissima (chủ

yếu để lấy sợi bện thừng) Bụp dấm được nhập vào Việt Nam cách đây khoảng 10 năm Cây ưa sáng, ưa ẩm và có thể chịu hạn Cây trồng ở Việt Nam tỏ ra có khả năng thích nghi với nhiều loại đất, kể cả đất đồi vùng trung du, hơi chua (Ba Vì – Hà Tây)

Là loại cây nhiệt đới, bụp giấm sinh trưởng phát triển tốt ở vùng có nhiệt độ trung bình khoảng 23 – 240C [21]

2.1.3 Thành phần hoá học

Đài hoa bụp giấm chứa các vitamin, khoáng chất, carbohydrate, các hợp chất có hoạt tính sinh học như các acid hữu cơ, phytosterol và polyphenol, trong đó một số thành phần có khả năng chống oxi hoá

2.1.3.1 Polyphenol

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong bụp giấm Các hợp chất phenolic có trong bụp giấm chủ yếu là các anthocyanin như delphinidin-3-glucoside, delphinidin-3-sambubioside, cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3-glucoside Gần đây, các nhà nghiên cứu kết luận rằng delphinidin-3-sambubioside và cyanidin-3-sambubioside là hai chất màu chiếm tỉ lệ cao nhất tạo ra màu đỏ tươi cho đài hoa bụp giấm

Ngoài ra, trong thành phần bụp giấm còn có các flavonoid khác như gossypetin, hibiscetin và các hợp chất glucoside của chúng; acid protocatechuic, eugenol và sterols (β-sitosterol và ergoesterol)

2.1.3.2 Carbohydrate

Nhóm carbohydrate có mặt trong bụp giấm gồm các gốc đường đơn (glucose, fructose, sucrose…), oligosaccharide, polysaccharide, pectin, dịch nhầy

Tỉ lệ carbohydrate trong bụp giấm khá cao (9,2 – 76,5%) Tuy nhiên, riêng ở phần hoa, tỉ lệ carbohydrate chỉ có 3,3%, trong đó glucose chiếm tỉ lệ nhiều nhất, tiếp theo là fructose và sucrose [26]

2.1.3.3 Acid hữu cơ

Các acid hữu cơ có mặt trong bụp giấm gồm acid citric, acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid hibiscic và một số acid khác

Acid hữu cơ chiếm khoảng 15-30% thành phần bụp giấm, trong đó acid citric

và acid tartaric chiếm trên 75% tổng số các acid có trong bụp giấm [26]

Bảng 2.1: Thành phần hoá học của đài hoa bụp giấm

Các chỉ tiêu Đài hoa tươi (100g) Đài hoa khô (100g)

Cánh hoa của nó có chứa hợp chất thơm flaconal glucoside hibiscritin Đây

chính là crystalline aglycone – hibiscetin (C15H10O9) Hoa bụp giấm có chứa phytosterols Hoa sấy khô có chứa 15,3% acid hibiscic (C6H6O7) Rễ bụp giấm có chứa

saponin và acid tartaric Đài hoa có chứa 6,7% protein trên trọng lượng tươi và 7,9% trên trọng lượng khô Acid Aspartic là loại acid có chứa nhiều nhất Quả sấy khô cũng

có chứa vitamin C và Oxalatca Cánh hoa có chứa flavonol glucoside hibiscitrin

2.2 Tác dụng dược liệu của cây bụp giấm [20]

Cây bụp giấm (Hibiscus sabdafiffa L.) được biết như một loại cây thực phẩm

được dùng làm màu thực phẩm hay nước uống, nó được sử dụng trên nhiều quốc gia

để phòng chống những bệnh tật có liên quan đến cao huyết áp Lá bụp giấm có vị chua, có thể dùng làm rau ăn Đài hoa bụp giấm cũng được làm gia vị thế giấm, chế nước giải khát, mứt, kẹo, siro hoặc đem phơi khô lấy nước uống Sau đây là những tác dụng dược lý của cây bụp giấm:

Theo kinh nghiệm y học dân gian: theo tác giả James A Duke (1983) thì cây

bụp giấm Hibiscus sabdafiffa trong y học dân gian có tác dụng dược lý lên việc phòng

chống nhiều chứng bệnh như sau: khử trùng vết thương (antiseptic), kích thích tình dục (aphrodisiac), làm se niêm mạc (astringent), làm diệu chứng viêm (demulcent), có tác dụng nhuận trường, tẩy xổ (purgative), làm mát lạnh (refrigerant), tiêu độc (resolvent), làm giảm đau (sedative), làm dễ tiêu (stomachic), và cũng là thuốc bổ Bụp giấm còn dùng chữa các chỗ viêm abscesses, lợi mật, thậm chí nó còn phòng chống cả bệnh ung thư Ngoài ra nó còn chữa các chứng ho (cough), suy nhược cơ thể (debility), chứng khó tiêu, khó tiểu (dyspepsia, dysuria), sốt (fever), giải rượu (hangover), bệnh tim (heart ailments), cao huyết áp (hypertension), rối loạn thần kinh chức năng (neurosis), bệnh do thiếu vitamin C (scurvy), và chứng tiểu són (strangury) Uống thường xuyên nước đài hoa bụp giấm có tác dụng ngăn ngừa ung thư Về mặt y học thì

lá của nó là thuốc làm mềm vết thương, và còn nhiều công dụng khác

Ở Guinea, người ta dùng làm thuốc lợi tiểu, mát và làm giảm đau, trái của nó làm thuốc chống bệnh scobut (bệnh thiếu vitamin C), lá, hạt và đài hoa chín đều có tác dụng lợi tiểu và chống bệnh scobut, đun sôi đài hoa với nước uống có tác dụng lợi mật, hoa bụp giấm có chứa gossypetin, anthocyanin, và glucoside hibiscin, những chất này

có tác dụng làm lợi tiểu và làm giảm độ nhớt của máu, từ đó làm giảm huyết áp, kích thích nhu động ruột

Ở Burma, người ta dùng hạt của nó để trị suy nhược cơ thể, lá để làm mềm các vết thương

Người Đài Loan rất chú ý đến hạt bụp giấm để làm thuốc lợi tiểu, nhuận tràng

và bồi bổ cơ thể (Perry, 1980) Người Angola sử dụng chất nhầy trong lá bụp giấm để làm mềm, trơn cổ trị các chứng ho khan rát họng

Người Trung phi (Central Africans) đắp lá bụp giấm lên chổ viêm abscesses để trị viêm và giảm đau Những người nghiện rượu uống nước cây bụp giấm hạn chế được sự hấp thu rượu do đó mau giã rượu

Theo những thí nghiệm y học hiện đại: gần đây người ta điều tra, nghiên cứu cơ

chế của nước chiết cây bụp giấm (Hibiscus sabdariffa) có tác dụng làm giảm huyết áp,

cơ chế giảm huyết áp này chủ yếu là do nó làm chậm nhịp tim

+ Tác dụng chống lại sự cao huyết áp

Theo kết quả nghiên cứu của Onyenekwe PC, Ajani EO, Amed DA, Gamaniel KS.Trasgenica (2004) ở trường đại học Ahmadu Bello, Zaria, Nigeria Nghiên cứu trên chuột nhận thấy dịch chiết đài hoa bụp giấm làm hạ huyết áp trên chuột thí nghiệm Liều LD50 dịch chiết trên chuột bình thường là 5000 mg/kg thể trọng

+ Tác dụng làm giảm cholesterol máu:

Theo thí nghiệm của Saadany SS, Sitohy MZ, Labib SM, el – Massry RA Khoa công nghệ sinh học, trường đại học Zagazig, Egypt, họ cho chuột đực ăn hỗn hợp cholesterol và acid cholic trong 12 tuần gây nhân tạo mức cholesterol cao trong máu (hypercholesterolemia), sau đó nhóm chuột thí nghiệm được cho ăn chế phẩm chứa nước chiết bụp giấm, kết quả nhóm chuột thí nghiệm có mức lipid tổng số, cholesterol, triglyceride và phospholipid bình thường Chức năng gan thận bình thường Từ thí nghiệm này cho chúng ta kết luận là dịch chiết cây bụp giấm có tác dụng làm giảm cholesterol máu, có lợi cho người bị cao huyết áp

+ Tác dụng làm thay đổi thành phần nước tiểu, góp phần phòng ngừa sỏi thận

Theo các nhà nghiên cứu Kirdpon S, Nakorn SN, Kirdpon W, khoa y trường đại học Khon kaen, Thái Lan Trên những người tình nguyện thí nghiệm, người ta phân tích thành phần nước tiểu sau một thời gian ăn nước ép bụp giấm nhận thấy giảm creatinine, acid uric, citrate, calcium, sodium, potassium và phosphat, nhưng không có oxalate trong nước tiểu

+ Tác dụng chống đột biến gen, ngăn ngừa ung thư đại tràng:

Theo các tác giả Chewonarin T, Kinouchi T, Kataoka K, Arimochi H, Kuwahara T, Vinitketkumnuen U, Ohnishi Y., Khoa Y, trường đại học Tokushima,

Nhật Bản Họ sử dụng chất chiết của cây bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.), một loại

thực vật dược thảo trồng ở Thái Lan Thí nghiệm cho thấy chất chiết cây bụp giấm đã làm giảm khoảng 60 – 90% trường hợp đột biến gen nhân tạo

+ Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào

Nhóm các tác giả Tseng TH, Wang CJ, Kao ES, Chu HY., trường Y & Nha khoa, Đài Loan, họ sử dụng acid protocatechuic (PCA), acid này giống với hợp chất

phenolic được chiết tách từ cây bụp giấm Hibiscus sabdariffa L., chất này bảo vệ tế

bào gan, chống lại sự oxyhóa gây nhân tạo bởi hợp chất tertbutylhydroperoxide (t - BHP) đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào gan

+ Chất chiết của cây keo Acacia nilotica và cây bụp giấm Hibiscus sabdariffa còn

có tác dụng chống viêm

Các nhà khoa học Dafallah AA, al – Mustafa Z., Bộ môn Hóa Sinh, Khoa Y, trường Đại học King Faisal, Dammam, Saudi Arabia Họ dùng nước chiết của hai cây này thử chống viêm Hoạt chất trong nước chiết có tác dụng làm giảm cảm giác đau và giải nhiệt trong thí nghiệm trên động vật Chất chiết của cây Acacia nilotica ức chế hình thành carrageenan trên chỗ viêm, còn chất chiết cây bụp giấm ức chế phản ứng sốt nơi viêm Người ta tìm thấy trong cả hai loài thực vật này đều có các hoạt chất như: flavanoids, polysaccharides và acid hữu cơ có thể có những đặc tính dược lý chủ yếu

+ Đài hoa bụp giấm có tác dụng trị chứng co thắt (antispasmodic)

Theo các tác giả Ali MB, Salih WM, Kohamed AH, Homeida AM., Viện nghiên cứu Y học và dược thảo hương liệu Quốc gia ở Khartoum, Sudan Họ làm thí nghiệm gây co thắt nhân tạo trên chuột và sử dụng chất chiết từ đài hoa bụp giấm để điều trị, kết quả cho thấy có hiệu ứng rõ rệt

2.3 Hợp chất anthocyanin trong bụp giấm

2.3.1 Định nghĩa

Anthocyanin là những glucoside có màu và có trong dịch ép tế bào của hoa quả

và một số cơ quan khác của cây Aglucon của chúng có tên gọi là anthocyanidin [2]

Cyanidin -OH -OH -H -OH -OH -H -OH Delphinidin -OH -OH -OH -OH -OH -H -OH

Luteolinidin -OH -OH -H -H -OH -H -OH

2.3.3.Tính chất [1]

Độ sáng của màu xanh hoặc màu đỏ của các anthocyain phụ thuộc vào sự phân

bố diện tích dương (+) trong hệ thống aryl hóa của croman và phụ thuộc vào sự hydrat hóa

Sự có mặt của các muối vô cơ và pH của môi trường cũng ảnh hưởng đến đặc tính của hệ thống cộng hưởng

Thông thường các anthocyanin bị phân giải thành saccharide và anthocynidin khi bị đun sôi với HCl 20% trong khoảng 3 phút Saccharide liên kết với aglucon ở vị trí 3, rất ít ở vị trí 5

Tất cả anthocyanin đều hòa tan trong nước, không tan trong ete, benzen, aceton

và cloroform Các chất anthocynin tạo thành kết tủa trong các dung dịch nước hoặc rượu ở các dạng muối chì màu xanh, muối này tan trong acid acetic băng và tạo thành

dung dịch màu đỏ tối

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin [1]

2.4.1 Ảnh hưởng củ a pH

Trong cây Tibouchina semidecandra L., anthocyanin ở trạng thái cân bằng tồn

tại 4 cấu trúc: base xanh quinoidal (anhydro) (A), cation flavylium đỏ (AH+), pseudobase carbinol không màu (B) và chalcone (C) Ở điều kiện trung tính hay hơi

acid, anthocyanin tồn tại chủ yếu ở dạng không màu do anhydrobase không bền

O+

R1 OH R2 O O

O H

Gl R

-H+/H 2 O cham

R1 OH R2 O O

O

Gl R

AH+: flavilium cation(1) B: hemicacetal (2)

R1 OH R2 O O

O

Gl R CE: E- chalcon (3) rat cham

O-Gl O

O

R2 R

R1

O O

O H

O R2 O

Gl R nhanh

R1 OH R2 O O

Gl R

nhanh -H+

-H+

nhanh

CZ: Z- chalcon(4) A: quinon base (5) voi R la H, CH3, glycosyl Hình 2.3: Cấu trúc chuyển hoá anthocyanin trong nước

Anthocyanin bền ở pH thấp do nồng độ cation flavylium cao Các chất màu ổn định đặc biệt là quinoidal base (A) do tương tác giữa các phân tử (flavonoid, polyphenol) và copigment nội phân tử (tác dụng của nhóm acyl lên các nhóm đường

trong phân tử anthocyanin)

Hiện tượng copigment là liên kết kị nước của nhóm màu anthocyanin với mặt phẳng bão hòa điện tích của copigment Ví dụ: tương tác vander waals và tính kị nước

trong môi trường nước làm mất đi liên kết π-π giữa các phân tử anthocyanin và copigment Sự liên kết này là độ hấp thu tăng lên và bước sóng λmax dài hơn

Trong bắp cải tím khi pH tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, anthocyanin chuyển dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu Đây là quá trình hydrat hóa, yếu tố chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nuớc Trong dung dịch base, có sự dịch chuyển của H+ từ OH- trên vòng B, anthocyanin chuyển sang dạng anion có màu xanh Khi pH môi trường càng cao, ion H+trong nhóm OH-còn lại bị phân hủy và khi ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp thụ trở thành đỏ hơn Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại

nên dung dịch có màu tím [7]

Theo tác giả Lê Ngọc Tú, khi pH < 7, anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh Ở pH1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở

pH 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base carbinol hay base chalcone không màu, pH

7 - 8 chúng lại về dạng base quinoidal anhydro màu xanh [9]

2.4.2 Ảnh hưởng của cấu trúc hóa học

Chất màu từ khoai tây đỏ bền hơn từ bắp cải tím và nho ở môi trường pH 0,9 -

4 sau 138 ngày dự trữ ở 200C do trong khoai tây đỏ có nhiều anthocyanin được acyl

hóa hơn trong bắp cải tím và nho

2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo Brouillard và Dangles (1994), khi nhiệt độ tăng thì phức copigment ít bền hơn Việc này có thể do ion flavylium bị solvat hóa Ban đầu, ion flavylium dễ dàng bị hydrat hóa không có cặp điện tử (non-covalent hydration) sau đó

pigment-bị hydrat hóa có cặp điện tử tạo nên pseudobase carbinol và chalcone không màu Khi

nhiệt độ tăng, có sự cạnh tranh giữa hydrat hóa và copigment làm copigment kém bền

Khi nhiệt độ tăng, dịch chiết nước anthocyanin bị phân hủy ban đầu tạo thành chalcone (Markakis, Livingston, và Fellers, 1957), mất các phân tử glycosyl và α-diketone (Adams, 1973) Thêm vào đó, các sản phẩm cuối cùng của quá trình phân hủy gồm các dẫn xuất coumarin (Hrazdina, 1971; Jackman và Smith, 1992), dẫn xuất acid benzoic (Seeram, Bourquin, và Nair, 2001) và trihydrobenzaldehyde Dịch chiết

nước anthocyanin bị phân hủy cũng liên quan đến polymer hóa và tạo ra các pigment

nâu [26]

Khi tăng nhiệt độ sẽ làm giảm độ nhớt đồng thời tăng vận tốc khuếch tán do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển động của chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi vì vậy mà hàm lượng anthocyanin tăng dần Trong công nghệ thực phẩm nhiệt độ

là yếu tố giới hạn bởi vì khi nhiệt độ tăng, các thành phần có trong thực phẩm rất dễ bị

biến đổi [6]

2.4.4 Ảnh hưởng của nước

Markakis và cộng sự (1957) đã đưa ra hai cơ chế thủy phân anthocyanin tại các nồng độ nước khác nhau Một cơ chế thủy phân liên kết glycoside thành aglycone không bền và cơ chế kia là mở vòng pyrilium tạo nên chalcone Đồng thời anthocyanin phân hủy tăng dẫn đến sự hình thành các hợp chất polymer màu nâu

2.4.5 Ảnh hưởng của oxi

Oxi có thể oxy hóa phân hủy anthocyanin trực tiếp hay gián tiếp thông qua những phân tử đã bị oxy hóa tạo thành những sắc tố không màu hay màu nâu Ví dụ: oxy hóa o-dihydroxyphynols thành quinone, sau đó quinone tương tác với anthocyanin

2.4.6 Ảnh hưởng của SO 2

Nguyên tắc: anthocyanin sẽ kết hợp với bisulfite (Na2S4O8) tạo ra sản phẩm cộng không có màu Anthocyanin-tanin là dạng polymer hoá (có màu) chống lại sự tẩy màu của bisulfite Còn dạng monomer thì cho phản ứng tẩy màu xảy ra nhanh chóng

Qua kết quả trên cho thấy hàm lượng anthocyanin trong quả dâu tăng lên khi tăng nồng độ SO2 và đạt giá trị cao ở nồng độ SO2 1100 ppm, sau đó giảm dần Điều này được giải thích dựa vào lý thuyết ưu trương và nhược trương (tức áp suất thẩm thấu liên quan đến sự chuyển khối của chất màu vào trong dung môi) Ở nước có nồng

độ SO2 thấp, tế bào của nguyên liệu ở dạng ưu trương, thậm chí có thể gây ra sự hấp thụ nước, khi tiếp tục tăng nồng độ đến một giá trị nhất định tùy thuộc vào đặc điểm của nguyên liệu thì lúc đó tế bào sẽ trương nở cực đại và vỡ ra đồng thời giải phóng các chất màu nằm trong phần không bào Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ SO2 thì

trạng thái nhược trương lại hình thành làm cho tế bào bị mất nước đồng thời cứng lại, làm giảm khả năng thấm của màng tế bào dẫn đến anthocyanin vẫn bị giữ nguyên trong phần không bào và quá trình chuyển khối xảy ra khó khăn hơn [6]

2.5 Hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất anthocyanin

2.5.1 Quá trình oxy hoá và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hoá [2]

Theo các nghiên cứu đã được công bố, các bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa…có liên hệ rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong tế bào sống Các quá trình oxy hóa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình tổng hợp nucleic acid, protein, hormon

Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do vi sinh vật hay virus Các gốc

tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như hydroxyl OH-, ion sắt (Fe2+O), Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt tính trung bình và yếu như superoxide anion O22-, peroxyl (ROO-), hydrogen peroxide H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NO-), peroxynitrite (ONOO-), alkoxyl (RO-)… Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzyme superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophil, monocyte, B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập

Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá Các gốc tự do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hoà của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài; oxi hóa các nucleic base làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư; làm hỏng cấu trúc các protein mang nhóm SH (các protein này đóng vai trò rất quan trọng như là chất mang hoặc chất hoạt hóa enzyme trong quá trình hô hấp), gây

ra các bệnh nghiêm trọng về đường hô hấp…

Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng kháng oxy hóa, quét gốc tự do trong

quá trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng ngăn chặn hoặc chữa bệnh

2.5.2 Tính chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin [2]

Các đặc tính dược lý quan trọng của anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của chúng, như mức độ glycosyl hoá và số nhóm hydroxy trong phân tử Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng khả năng chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin cao hơn nhiều lần khả năng của vitamin C và vitamin E [22] Hơn nữa, anthocyanin còn có khả năng tăng cường hoạt tính của vitamin C và một số loại flavonoid khác Khả năng chống oxy hoá của các hợp chất anthocyanin được giải thích bằng nhiều cơ chế như loại bỏ các gốc tự do, ngăn cản hoạt động của các enzyme sinh ra gốc tự do hoặc tạo phức với các ion kim loại là xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá

Một số nghiên khác cũng chỉ ra rằng, so với BHA và β-carotene, khả năng chống oxy hoá của anthocyanin cao hơn [26] Anthocyanin và một số hợp chất flavonoid khác còn có khả năng chống oxy hoá cho nhiều loại hợp chất dễ bị oxy hoá khác như linoleic và β-carotene

2.5.3 Ứng dụng khả năng chống oxy hoá của bụp giấm và hợp chất anthocyanin

Ứng dụng được quan tâm nhiều là khả năng dược lý của bụp giấm và hợp chất anthocyanin như giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, ung thư, đột quỵ nhờ khả năng chống oxy hoá Nhưng ngoài các tác dụng dược lý, chúng còn được quan tâm sử dụng trong các lĩnh vực khác như mỹ phẩm và thực phẩm Trong các lĩnh vực này, anthocyanin được sử dụng như là chất màu tự nhiên thay thế cho các chất màu tổng hợp Trong mỹ phẩm, anthocyanin từ bụp giấm được bổ sung vào các sản phẩm chăm sóc da (như kem dưỡng da, các sản phẩm trị mụn, các sản phẩm sử dụng sau khi cạo râu…), các sản phẩm chăm sóc tóc (như thuốc nhuộm tóc, dầu xả, dầu hấp tóc…) [26] Trong thực phẩm, anthocyanin được sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm thức uống có

pH thấp (như sirô, đồ uống có cồn và không cồn…), các sản phẩm thức ăn (như mứt, thạch trái cây, bánh kẹo, các sản phẩm từ sữa, các sản phẩm hoà tan,…)

Rượu vang có nhiều loại, có thể chia thành hai nhóm cơ bản là:

+ Vang trắng: Lên men không có xác quả Đặc tính chung của nhóm rượu này là những giá trị cảm quan như hương vị, màu sắc… thường hài hòa, êm dịu và nhẹ nhàng

so với các loại rượu vang khác

+ Vang đỏ: lên men có xác quả Đặc tính chung của nhóm rượu này là hàm lượng các sắc tố và chất chát cao hơn vang trắng

2.6.1.2 Thành phần hóa học của rượu vang

Tùy thuộc vào thành phần của nguyên liệu sử dụng, những biến đổi trong quá trình lên men, quá trình làm chín rượu và sự kết hợp của các phương pháp sản xuất mà mỗi loại rượu vang khác nhau sẽ khác nhau về thành phần và hàm lượng các chất Thành phần của rượu vang rất phức tạp, có những chất chỉ có mặt với một tỷ lệ rất thấp nhưng có thể làm cho rượu vang tốt lên hay xấu đi rất nhiều lần Thành phần của rượu vang thường bao gồm các chất sau:

Tùy theo lượng đường khử còn lại trong rượu vang, sau khi đã lên men xong, người ta phân biệt rượu vang khô (dưới 10 g/l đường), nửa khô (20-30 g/l đường), nửa ngọt ( 45-65 g/l đường) và ngọt (80-110 g/l đường) Lượng đường khử càng coo, độ cồn càng phải coo để cho cân đối Độ cồn của rượu khô 9-11 độ, rượu ngọt thì độ cồn đạt 12-13 độ và hơn nữa

Rượu vang còn nhiều đường khử, đặc biệt khi độ cồn thấp rất dễ bị nhiều loại khuẩn yếm khí cũng như háo khí phá hủy đường, chuyển thành axit lactic, giấm, rượu mất mùi

Acid

Axit là một thành phần quan trọng của rượu vang Rượu vang là đồ uống có độ chua coo, axit tổng số tới 5,5 – 8,5 gam/lít (tính theo acid tactric), pH từ 2,8 đến 3,8 nhưng dễ uống vì vị chua của axit được cân đối với vị ngọt của đường, cồn, của glyxerin, vị chát của polyphenol, vị mặn của các chất muối Axit hữu cơ trong rượu vang còn có một tác dụng nữa: ngăn cản hoạt động của các khuẩn làm hư hỏng rượu

Đó là những axit có tác dụng "tích cực" - ngoài ra còn những axit có tác dụng " tiêu cực" : axit bay hơi chủ yếu là axit acetic và các axit béo đồng đẳng: fomic, propionic, butiric Những axit này nếu có nhiều, sẽ gây ra các bệnh rượu: mùi vị thay đổi đến mức rượu không uống được nữa

Tro và các chất muối

Có nhiều muối khoáng trong rượu vang quả, phổ biến nhất là P, S, K, Na, Ca,

Mg, Si, Fe, Mn, Fl, Cl, Br, I, Al mặc dù lượng tuyệt đối thấp Trong một lít rượu nho chỉ có 1,5 đến 3 gam tro nhưng chất muối trong tro giữ một vai trò quan trọng như làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh dưỡng Có nhiều chất muối hết sức cần thiết cho cơ thể sống với một lượng rất nhỏ Những chất vi lượng như Fe hàm lượng bình thường chỉ vài mg/l và Cu: 0,2 - 0,3 mg/l, nếu chỉ tăng một vài mg trong một lít cũng gây kết tủa, làm cho rượu đục, mất hương vị

Chất gây mùi thơm

Đó là mùi thơm do các chất nguồn gốc tecpen gây ra, nhưng đại bộ phận các chất này bị phân hủy và bị khí cacbonic kéo theo trong quá trình lên men.Về phần

mình, con men cũng sản sinh ra những chất có mùi thơm trong đó có cồn cao phân tử

và este của chúng Trong quá trình rượu chín, phát sinh một mùi thơm đặc biệt gọi là bukê (bouquet) do các chất oxy hóa khử sinh ra, nhưng chỉ ở dạng khử oxy mới thơm -

vì vậy giữ rượu vang quả trong bình nút kín hoàn toàn không có oxy một thời gian dài thì có mùi thơm Nếu trong bình có chổ trống và nút không kín, oxy lọt vào thì mùi thơm bị phá hủy rất nhanh

Vitamin

Rượu vang cũng chứa một lượng vitamin đáng kể Một số vitamin trong rượu vang được tổng hợp từ nấm men, một số có sẵn trong dịch quả Vitamin là một trong những thành phần tạo nên giá trị dinh dưỡng cho rượu vang

Polyphenol

Là hợp chất phức tạp chỉ có trong vỏ quả Do đó khi chế bằng nước quả, không

có xác, rất ít polyphenol (vang trắng), ngược lại khi cho lên men cả nước và xác quả thì trong rượu nhiều polyphenol bao gồm nhiều hóa chất khác nhau :

+ Axit fenol như axit benzoic, axit xinamic

+ Flavon làm cho rượu có màu vàng

+ Antoxian làm cho rượu đỏ

+ Tanin dễ kết bông với protein trong nước quả, cũng dễ oxi hóa làm cho màu rượu tối lại

Polyphenol chỉ có nhiều trong rượu vang đỏ, làm cho rượu có màu, có vị chát, cũng tạo những điều kiện không thuận lợi cho khuẩn hại

* Các chỉ tiêu hóa học của rượu vang theo TCVN 7045 : 2002:

Đây cũng là những chỉ tiêu hướng đến của sản phẩm rượu vang bụp giấm nghiên cứu trong đề tài này

2.6.2 Nấm men trong sản xuất rượu vang [3], [12]

Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm men có cấu tạo và sinh sản bằng cách nảy chồi và phân cắt Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi Đặc biệt chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Ngoài ra thấy chúng có mặt trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang

nấm men và điều kiện nuôi cấy

- Kích thước tế bào nấm men:

Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình:

+ Chiều dài: 9 – 10μ m

+ Chiều rộng: 2 – 7μm

Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau

2.6.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men

Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau:

- Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin,…

- Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit enzyme permeaza…

- Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó

- Nhân tế bào

- Những thành phần – cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,…

2.6.2.3 Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản sau:

- Sinh sản bằng cách nảy chồi

- Sinh sản bằng cách phân đôi

- Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử

2.6.2.4 Sự sinh trưởng của nấm men

Nấm men hấp thu chất đường và các hợp chất khác của môi trường dinh dưỡng

để tiến hành quá trình tăng sinh và trao đổi năng lượng, từ đó sinh khối và sản phẩm trao đổi chất tăng lên Dưới tác dụng của hệ enzyme zymase của nấm men, đường biến thành các sản phẩm lên men: rượu và CO2 đây là hai trong số những sản phẩm cơ bản của quá trình trao đổi chất giữa nấm men và môi trường dinh dưỡng

2.6.2.5 Những yêu cầu đối với nấm men vang

Men phải có hoạt lưc lên men cao, sử dụng đường cho lên men gần như hoàn toàn Men có khả năng kết lắng tốt, làm trong dịch rượu mạnh Chịu được độ rượu cao

và độ acid của môi trường cũng như các chất sát trùng, tạo cho rượu hương vị thơm ngon thanh khiết

2.6.3 Cơ chế quá trình lên men rượu

2.6.3.1 Cơ chế

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng

sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2

Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:

+ Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

+ Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

2.6.3.2 Diễn biến của quá trình lên men rượu

Trong quá trình lên men, đường trong dịch quả được nấm men sử dụng để tăng sinh khối và tổng hợp một số sản phẩm (rượu, khí CO2 và glycerin, acid acetic, acid lactic, este ethyl acetate) Các alcol bậc cao, aldehyde acetic được tạo thành từ các acid amin Các chất pectin bị thủy phân kéo theo sự tạo thành một lượng nhỏ methanol

Lên men rượu vang thường chia thành các giai đoạn: lên men chính ở nhiệt độ

từ 20 – 300C khoảng 10 ngày hoặc dài hơn Ở cuối giai đoạn lên men chính dịch lên men trong dần vì protein và pectin lắng xuống Lên men phụ ở nhiệt độ từ 15 – 180C Khi lắng cặn hoàn toàn, dịch trong thì gạn, lọc xong sẽ được rượu vang có thể uống được, nhưng chưa ngon, cần phải tàng trữ ở nhiệt độ 4 – 100C để rượu vang hoàn thiện hương vị đặc trưng Thời gian tàng trữ có thể là vài tháng, vài năm, thậm chí hàng chục hoặc hàng trăm năm

2.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong lên men rượu vang

2.6.4.1 Oxy

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống

Saccharomyces Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện Khi trong môi trường đủ

lượng oxy, nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối Trường hợp thiếu oxy (kỵ khí) nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và chủ yếu là lên men Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy cao nhất để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí

độ cao hơn, thường là 250C Nhiệt độ lên men cao, thời gian của quá trình lên men ngắn, độ cồn có thể thấp, đường sót còn nhiều và hương vị của sản phẩm có khi không tốt

2.6.4.3 Hàm lượng đường

Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người ta thường bổ sung thêm đường saccharose Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường dưới 20% Có một số chủng hoạt động ở môi trường

có đường cao hơn Khi nhân giống thường dùng môi trường có đường thấp dưới 10%

2.6.4.4 pH của môi trường

Trong thực tế lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2,8 – 3,8 Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được Vùng pH tối thích của nấm men là 4,0 – 6,0 Trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả có độ pH bằng 3,0 – 3,5

2.6.4.5 Nguồn Nitơ

Đa số trong nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men Tuy nhiên cũng có trường hợp không đủ nguồn nitơ do đó cần bổ sung thêm nguồn nitơ Trong trường hợp này người ta thường dùng amon sulphat (NH4)2SO4 Cũng có thể dùng men tự phân cho thêm vào môi trường Nếu dịch quả quá chua dùng tartrat amon-kali hay amon hydroxy trung hòa bớt acid

Đối với dịch nhân giống hoặc hoạt hóa giống thì hỗn hợp các nguồn nitơ và các chất sinh trưởng rất có ý nghĩa

Trong nước quả thường có đủ các chất khoáng đối với nhu cầu của nấm men

Vì vậy, không cần phải bổ sung thêm chất khoáng Tuy nhiên trong nghiên cứu cũng như trong nhân giống có thể thêm nguồn phospho, kali ở dạng muối phosphate và magiê ở dạng muối sulfate

Ngoài ra để chống oxy hóa nước quả, người ta có thể thêm hóa chất vào nước quả sau khi ép và trước khi lên men Chất dùng rộng rãi là SO2 (anhydrit sunphurơ)

SO2 là hóa chất được cho phép dùng trong sản xuất rượu vang ở hầu hết trên thế giới và có tác dụng nhiều mặt: chống oxy hóa, làm giảm hoặc tiêu diệt vi khuẩn có hại Nguồn SO2 phổ biến trong rượu vang là natri sunfit Na2SO3 Không nên dùng quá liều lượng cho phép sẽ làm cho rượu vang có mùi khó chịu và diệt một số vi khuẩn có ích

2.7 Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC/MS -Gas Chromatography Mass Spectometry) [33]

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS - Gas Chromatography Mass Spectometry)

là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất

và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật GC/MS, các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…

2.7.1 Sắc ký khí (GC - Gas Chromatography)

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng

lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động Trong sắc ký lỏng (LC) pha động là một dung môi hữu cơ, còn trong GC pha động là một khí trơ giống như helium Pha động mang hỗn hợp mẫu

đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt

độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động

Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng Cột của GC dài có thể là 25m, 30m, 50m, 100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng một lớp polimer đặc biệt như phenyl 5% (dimetylsiloxane polymer 95%), đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn

Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò Đầu dò có khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất cần phân tích Tín

hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải gọi là thời gian lưu (TR)

Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ từ các tín hiệu như hình 2.4 Đây gọi là sắc đồ, mỗi một peak trong sắc đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu

và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu, trong hình 2.4 mỗi đỉnh (peak) biểu diễn một chất riêng lẻ, chất này được tách từ hỗn hợp mẫu phân tích Nếu trong cùng điều kiện sắc ký như nhiệt độ, loại cột… giống nhau thì cùng chất luôn có thời gian lưu giống nhau, khi biết thời gian lưu của hợp chất thì chúng ta có thể chấp nhận được độ nhạy của nó Tuy nhiên, chất có tính chất giống nhau thì thường có thời gian lưu giống nhau

Hình 2.4: Sắc đồ của sắc ký khí [33]

2.7.2 Khối phổ

Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do chúng bị vỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ

Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện hay còn gọi là ion, điều này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái tích điện thì mới đi qua được bộ lọc Các khối nhỏ chắc chắn, khối của mảnh vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỉ lệ vật mang khối (m/z)

Hầu hết các mảnh vụn có điện tích là +1, m/z thường miêu tả các phân tử nặng của mảnh vụn Nhóm gồm có 4 nam châm điện gọi là tứ cực (quadrapole), tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, tứ cực được thành lập bởi phần mềm chương trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ

Phân tích kết quả

Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét Trục hoành biểu diễn tỉ lệ m/z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò (detector)

Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này có thể giúp

họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ

sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng)

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ 01/03/2009 – 10/08/2009

- Địa điểm: thí nghiệm được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường và phòng thí nghiệm I4, thuộc bộ môn Công Nghệ Hóa Học, trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

3.2.1 Vật liệu

3.2.1.1 Đài hoa bụp giấm

Đài hoa bụp giấm Hibiscus sabdariffa L được lấy từ công ty trà Hoàng Nhung,

quận Tân Bình, thành phố Hồ Chí Minh

Hình 3.1: Đài hoa bụp giấm khô 3.2.1.2 Chủng nấm men

- Chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae EC do Viện Công nghệ Thực phẩm Hà

Nội cấp

- Yêu cầu: chủng nấm men thuần chủng, có sức sống tốt

3.2.1.3 Môi trường nhân giống nấm men

Môi trường Hansen trong đó nước được thay thế bằng dịch đài hoa bụp giấm khô (phụ lục 2)