THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT TRONG MÔ SẸO CỦA CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour) Spreng) IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN

HÓA THỰC VẬT TRONG MÔ SẸO CỦA CÂY GẤC

(Momordica cochinchinensis (Lour) Spreng)

IN VITRO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ THÙY LAM Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 7/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT TRONG MÔ SẸO CỦA CÂY GẤC

(Momordica cochinchinensis (Lour) Spreng)

IN VITRO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

KS TRỊNH THỊ PHI LY

Tháng 7/2010

LỜI CẢM ƠN

Con thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình đã nuôi dưỡng giáo dục và tạo điều kiện động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin gởi lời biết ơn đến:

- Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

- Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

- Ban chủ nhiệm, Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học

Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành

đề tài

Em xin chân thành biết ơn:

KS Tôn Trang Ánh và KS Trịnh Thị Phi Ly đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành khóa luận này

Các anh chị làm việc tại phòng Hóa – Lý, Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã động viên chia

sẻ những kinh nghiệm làm việc trong thời gian thực tập tại Viện

Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học DH06SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Tháng 07 năm 2010

Trương Thị Thùy Lam

TÓM TẮT

Cây gấc không những có giá trị cao trong y học mà còn được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm Trái gấc có chứa beta caroten và lycopen với hàm lượng cao gấp nhiều lần các loại thực phẩm đang được sử dụng phổ biến trên thế giới Các bộ phận của cây đều có thể sử dụng để chữa bệnh trong nhân gian cũng như trong y học hiện đại Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết lập quy trình chiết xuất carotenoid trong

trái gấc và xác định thành phần hóa thực vật trong mô sẹo của cây gấc in vitro” Mục

đích của đề tài này là đánh giá hàm lượng beta caroten và lycopen trong dịch chiết trái gấc đã thu thập từ các vùng khác nhau và phân tích sơ bộ các hợp chất có trong mô sẹo

cây gấc in vitro

Nội dung thực hiện: tiến hành chiết xuất carotenoid, xác định hàm lượng beta caroten

và lycopen trong trái gấc đã thu thập ở 3 vùng Hưng Yên, Đà Nẵng, Bình Thuận

Đồng thời phân tích thành phần hóa thực vật trong mô sẹo của cây gấc in vitro

• Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong mô sẹo của cây

gấc in vitro chứa chủ yếu các chất hữu cơ: acid béo, acid hữu cơ, đường khử,

polyuronic, saponin, tinh dầu, triterpenoid…

• Kết quả định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng cho thấy có sự hiện diện của

saponin trong mô sẹo của cây gấc in vitro

• Xác định được hàm lượng acid linoleic (1,9210 mg/g), acid oleic (1,4985

mg/g), và beta caroten (7,9596 µg/g) trong mô sẹo cây gấc in vitro

SUMMARY

“Establishing carotenoid extraction protocol in Gac fruit and the determine

compostition chemical plants in scar tissue of Gac fruit in vitro” (Momordica

cochinchinensis (Lour.) Spreng).

Content: extracting carotenoid and determine beta carotene and lycopen content in three kinds of Gac fruit that was collected in Da Nang, Binh Thuan, Hung Yen

province Determining the chemical compostition in callus of Gac fruit in vitro

Some results of this thesis:

The yiel of carotenoid extraction of the first protocol was higher than the

second protocol

The content of carotenoid 759.10 µg/g, beta carotene (1.6910 mg/g) and

lycopen (70.4566 mg/g) in Hung Yen is the highest

Callus of Gac in vitro contained mostly substances: fat, organic acids,

reducing sugar, polyuronic, saponins, essential oils, triterpenoid

Saponin was found in callus of Gac in vitro by thin layer chromatography

The results of the analysis indicated that callus of Gac in vitro contained

linoleic acid (1.9210 mg/g), acid oleic (1.4985 mg/g) and also beta caroten

(7.9596 µg/g)

MỤC LỤC

Lởi cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các từ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây gấc 3

2.1.1 Phân loại thực vật 3

2.1.2 Nguồn gốc phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và hình thái của cây gấc 3

2.1.3.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển 3

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.4 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của gấc 6

2.1.4.1 Màng hạt gấc 6

2.1.4.2 Hạt gấc 10

2.1.4.3 Rễ gấc 10

2.1.4.4 Thân và lá gấc 11

2.2 Tình hình nghiên cứu về gấc 11

2.3 Tình hình nghiên cứu về carotenoid trong và ngoài nước 12

2.3.1 Nguyên tắc của sự chiết xuất 14

2.3.2 Một số yêu cầu cơ bản khi tiến hành chiết xuất 14

2.3.3 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 15

2.3.3.1 Sự hòa tan 15

2.3.3.2 Sự khuếch tán 15

2.3.3.3 Quá trình thẩm tích 16

2.3.4 Những nhân tố ảnh hưởng trong quá trình chiết xuất 16

2.3.4.1 Nguyên liệu 16

2.3.4.2 Dung môi 17

2.3.4.3 Kĩ thuật chiết 17

2.4 Giới thiệu sắc kí 18

2.4.1 Sắc kí lớp mỏng 18

2.4.2 Sắc kí khí 18

2.4.2.1 Nguyên tắc của sắc kí khí 18

2.4.2.2 Thiết bị sắc kí khí 19

2.4.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 21

2.4.3.1 Nguyên tắc của sắc kí lỏng cao áp 21

2.4.3.2 Thiết bị sắc kí lỏng cao áp 21

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Nội dung nghiên cứu 24

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.3 Thiết lập quy trình định lượng carotenoid 24

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

3.3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 24

3.3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ 24

3.3.1.2.2 Hóa chất 24

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.2.1 Xử lý nguyên liệu 24

3.3.2.2 Xác định độ ẩm 25

3.3.2.3 Các phương pháp chiết xuất carotenoid 25

3.3.2.3.1 Phương pháp 1 25

3.3.2.3.2 Phương pháp 2 26

3.4 Xác định thành phần hóa thực vật trong mô sẹo cây gấc in vitro 27

3.4.1 Vật liệu nghiên cứu 27

3.4.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

3.4.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 27

3.4.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy 28

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.4.3.1 Nhân sinh khối mô sẹo 30

3.4.3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong mô sẹo 30

3.4.3.2.1 Xử lý nguỵên liệu 30

3.4.3.2.2 Xác định độ ẩm 30

3.4.3.2.3 Nguyên tắc 30

3.4.3.2.4 Tiến hành 30

3.4.3.3 Tiến hành định tính saponin bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Độ ẩm của nguyên liệu 35

4.2 Chiết xuất carotenoid 35

4.2.1 Đánh giá hiệu quả chiết xuất của 2 phương pháp 35

4.2.2 Đánh giá hàm lượng carotenoid trong trái gấc đã thu thập 36

4.2.3 Đánh giá hàm lượng beta caroten và lycopen 38

4.3 Xác định thành phần hóa thực vật trong mô sẹo cây gấc in vitro 38

4.4 Độ ẩm mô sẹo 42

4.5 Định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng 42

4.6 Hàm lượng acid béo và beta caroten trong mô sẹo cây gấc in vitro 43

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.1.1 Quy trình chiết xuất carotenoid 44

5.1.2 Khảo sát thành phần hóa thực vật 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

MẪU 1 Hưng Yên

MẪU 2 Đà Nẵng

MẪU 3 Bình Thuận

MS Môi trường Murashige và Skoog (1962)

MS* Mass Spectrometry – Khối phổ

NT

PE

Nghiệm thức Petroleum ether

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần carotenoid có trong màng hạt gấc 6

Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng của khô bã gấc 9

Bảng 2.3 Thành phần acit béo của dầu màng gấc 9

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS 29

Bảng 4.1 Độ ẩm các mẫu bột gấc ở 3 vùng 35

Bảng 4.2 Hàm lượng carotenoid thu được từ 2 phương pháp 36

Bảng 4.3 Kết quả đo OD và hàm lượng carotenoid của trái gấc Hưng Yên 37

Bảng 4.4 Kết quả đo OD và hàm lượng carotenoid của trái gấc Bình Thuận 37

Bảng 4.5 Kết quả đo OD và hàm lượng carotenoid của trái gấc Đà Nẵng 37

Bảng 4.6 Kết quả hàm lượng carotenoid mẫu khô 100% của trái gấc ở 3 vùng 38

Bảng 4.7 Hàm lượng beta caroten và lycopen trong trái gấc 38

Bảng 4.8 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong mô sẹo cây gấc in vitro 39 Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng acid béo và beta caroten trong mô sẹo 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây Gấc Momordica cochinchinensis 5

Hình 2.2 So sánh hàm lượng beta caroten của gấc với các loại trái cây khác 13

Hình 2.3 So sánh hàm lượng lycopen của gấc với các loại trái cây khác 13

Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID 18

Hình 4.1 Dịch chiết carotenoid theo phương pháp 1 35

Hình 4.2 Dịch chiết carotenoid theo phương pháp 2 36

Hình 4.3 Mô sẹo sau thời gian 4 tháng 39

Hình 4.4 Phản ứng dương tính 41

Hình 4.5 Phản ứng âm tính 42

Hình 4.6 Hình qua màu sắc tự nhiên 43

Hình 4.7 Hình phát quan dưới tia UV 43

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Gấc là một loại quả nhiệt đới được tìm thấy ở Việt Nam và các nước Đông Nam

Á khác Ở nước ta, cây gấc có thể trồng ở mọi nơi, vùng đồi núi, đồng bằng, ven biển Cây gấc rất dễ trồng thường bằng dây hoặc bằng hạt Gấc có thể sống trên những vùng đất khô cằn, đất xấu nghèo dinh dưỡng

Quả gấc được đánh giá cao vì có giá trị cao trong y học giúp chống bệnh béo phì, hạ cholesterol trong máu, phòng chống thiếu vitamin A, phòng và điều trị suy dinh dưỡng, chữa khô mắt, mờ mắt, thiếu máu dinh dưỡng, phòng các bệnh tim mạch, phòng chữa viêm gan, xơ gan và những thương tổn tiền ung thư (Đỗ Tất Lợi, 1986) Quả gấc còn được dùng trong thực phẩm để nấu xôi, ăn có vị rất ngon và chứa nhiều chất bổ dưỡng Từ quả, hạt, rễ và tinh dầu chiết xuất từ gấc đều có thể chế nên những loại thuốc chữa bệnh vô cùng hiệu quả

Ngày nay quả gấc được con người quan tâm nghiên cứu chuyên sâu vì quả gấc không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn chứa lycopen, beta caroten là các chất carotenoid có tác dụng dọn sạch các gốc tự do và các sản phẩm oxy hóa độc hại do các gốc tự do sinh ra giúp cơ thể khỏe mạnh và làm chậm lại quá trình lão hóa để kéo dài tuổi thanh xuân (Lê Ngọc Tú, 2000)

Hàm lượng beta caroten, lycopen trong trái gấc cao gấp hàng chục lần cà chua

và cà rốt vì vậy quả gấc đã được tinh chế thành viên nang gấc với tên gọi Vinaga có tác dụng dưỡng da, chữa sạm da, trứng cá, bảo vệ da, giúp da luôn hồng hào, tươi trẻ

và mịn màng

Với nhiều công dụng như trên, việc nghiên cứu về cây gấc cần phát triển để có thể đưa các tác dụng tuyệt vời của chúng phục vụ cho lợi ích của con người Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết lập quy trình chiết xuất carotenoid trong trái gấc và

xác định thành phần hóa thực vật trong mô sẹo của cây gấc in vitro” nhằm đánh giá

hàm lượng beta caroten và lycopen có trong các mẫu gấc đã thu thập và xác định một

số hợp chất hữu cơ trong cây gấc in vitro để phục vụ rộng hơn cho các nghiên cứu sau

này

1.2 Yêu cầu của đề tài

- Thiết lập quy trình chiết xuất carotenoid trong trái gấc

- Phân tích thành phần hóa thực vật trong mô sẹo của cây gấc in vitro

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thiết lập quy trình chiết xuất carotenoid trong trái gấc

• So sánh hàm lượng carotenoid trong trái gấc đã thu thập ở 3 vùng Bình Thuận, Hưng Yên, Đà Nẵng

• So sánh hàm lượng beta caroten và lycopen trong trái gấc đã thu thập 3 vùng Bình Thuận, Hưng Yên, Đà Nẵng

- Xác định thành phần hóa thực vật trong mô sẹo của cây gấc in vitro

• Nhân sinh khối mô sẹo

• Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong mô sẹo cây gấc in vitro

bằng phản ứng sinh hóa

• Định tính saponin bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng

• Xác định hàm lượng acid béo và beta caroten trong mô sẹo cây gấc in vitro bằng sắc kí

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây gấc

Chi (genus): Momordica

Loài (Species): Momordica cochinchinensis

(Đỗ Tất Lợi, 1986)

2.1.2 Nguồn gốc phân bố

Năm 1790, linh mục Loureiro (Bồ Đào Nha) đặt tên cây gấc là Muricia cochinchinensis Sau đó Sprengel kết luận rằng cây gấc thuộc chi Momordica và đổi tên khoa học cây gấc là Momordica cochinchinensis (1826)

Cây gấc xuất xứ ở Việt Nam và cũng có nguồn gốc ở khắp Châu Á như Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Nhật Bản, Burma, Malaysia, Banglades, Australia, Myanmar và Châu Úc

2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và hình thái của cây gấc

2.1.3.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển

- Ánh sáng: cây gấc là cây ưa ánh sáng ngày ngắn, ưa khí hậu ấm áp và độ ẩm không khí cao, chịu hạn và chịu rét kém Cây sinh trưởng tốt trong điều kiện cường độ chiếu sáng mạnh nhưng quả phát triển tốt trong điều kiện chiếu sáng giảm Giai đoạn quả đang lớn nếu gặp ánh sáng chiếu trực tiếp quả rất dễ bị rám, thối hoặc sớm rụng Chính vì vậy, trồng gấc tốt nhất nên làm giàn để nâng cao chất lượng cũng như phẩm chất quả

- Nhiệt độ: nhiệt độ trung bình cho gấc phát triển là từ 25 – 27oC, hạt gấc có thể nảy mầm ở nhiệt độ 13 – 15oC, nhưng tốt nhất ở 25oC

- Đất đai: gấc không chịu được úng ngập, đọng nước, vì vậy khi trồng tốt nhất nên làm vồng, ụ hay trồng ở nơi có khả năng tiêu thoát nước tốt Cây gấc cần nước

nhiều nhất ở giai đoạn ra hoa và phát triển trái Thiếu nước trong giai đoạn này sẽ làm hoa rụng, trái phát triển kém, năng suất thấp Giai đoạn từ khi mới trồng đến trước khi

ra hoa yêu cầu độ ẩm đất đạt 65 – 70 % Giai đoạn ra hoa kết quả yêu cầu độ ẩm đạt 75

% Độ pH 6,0 – 7,0

- Cao độ: gấc có thể phân bố ở độ cao từ 0 đến 1500 m so với mặt nước biển

Để gấc cho nhiều quả nhất thiết phải làm giàn, càng có điều kiện vươn xa và ánh sáng mặt trời thì gấc càng cho nhiều quả

- Kỹ thuật trồng và thu hoạch: Gấc là loại cây dễ trồng, trồng bằng hạt hay giâm cành vào các tháng 2 – 3 Tuy nhiên trồng bằng hạt tỷ lệ cây đực cao hơn cây cái nhưng chỉ cây cái mới có quả, do đó nên trồng bằng dây Khi trồng thì nên kết hợp cả hai loại để có tỷ lệ hoa đực, hoa cái phù hợp, nâng cao tỷ lệ thụ phấn sẽ sai quả Trồng một năm thu hoạch nhiều năm, mùa thu hoạch quả từ tháng 8 – 9 đến tháng 1 – 3 năm sau Sau đó cây lụi đi, sang xuân lại nẩy chồi mọc cây mới (Huda and Sikdar, 2006)

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái

- Thân: gấc là cây thân thảo, dây leo, đa niên, đơn tính biệt chu, có tua cuốn ở nách lá, thân cây có tiết diện góc và chiều dài thân có thể lên đến 15 m Thân lá gấc có mùi hôi nên ít bị sinh vật khác phá hoại, có khả năng thích nghi với mọi địa hình và có thể trồng gấc trên nhiều loại đất khác nhau

- Lá: lá gấc mọc so le, nhẵn, có màu xanh biếc, to bằng bàn tay và xòe kiểu chân vịt Phiến lá xẻ 3 - 5 thùy, dài 8 - 18 cm, chia thùy khía sâu tới 1/3 hay 1/2 phiến

lá

- Hoa: mùa hoa tháng 4 - 5, cánh hoa màu vàng nhạt, sắc hoa tươi Hoa đực, hoa cái riêng biệt, mọc riêng rẽ ở nách lá, cánh hoa màu vàng nhạt, đài sắc xanh Hoa đực và hoa cái có thể mọc trên cùng một dây, cũng có khi cây chỉ có hoa đực hoặc chỉ

có hoa cái Hoa đực có lá bắc to, tràng hoa màu vàng còn hoa cái có lá bắc nhỏ Hoa gấc giống như hoa họ bầu bí, việc thụ phấn chủ yếu nhờ gió và côn trùng Vì vậy để tăng khả năng đậu quả thì cũng cần phải thụ phấn nhân tạo bằng cách dùng hoa đực úp lên đầu nhụy của hoa cái khi hoa nở

- Quả: mùa quả tháng 6 đến tháng 2 năm sau, quả to hình bầu dục dài độ 15 –

20 cm, đáy nhọn, ngoài có nhiều gai, sắc xanh, khi chín màu vàng đỏ đẹp tươi, thịt gấc màu đỏ cam Vỏ trái gấc chiếm khoảng 63 %, tùy theo trái mà vỏ có độ dày từ 1 - 3

cm Vỏ gấc có nhiều gai nhọn, màu trắng ngà, mềm, xốp Mỗi quả thường có 6 múi và

hạt xếp thành hàng dọc Khi quả to đường kính đạt 30 - 40 cm tiến hành chọn quả, nên chọn những quả tròn cân đối, các gai phân bố đều, tươi, loại bỏ những quả xấu và sâu bệnh để cây tập trung dinh dưỡng nuôi các quả tốt

- Hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹp, cứng, mép có răng cưa Bên ngoài, hạt gấc được bao bọc bởi màng màu đỏ máu, tươi, trong hạt có nhân trắng có chứa nhiều dầu Mỗi quả gấc có khoảng 3 – 4 hạt đực, hạt đực nhỏ và mỏng hơn hạt cái Mùa thu hoạch là từ tháng 9 năm trước đến tháng 3 năm sau Ở miền Nam do thời tiết ấm nên gấc có trái quanh năm (Huda and Sikdar, 2006)

- Tuổi thọ của cây gấc có thể kéo dài từ 15 – 20 năm Vì là cây biệt chu thụ phấn tự do nên trồng theo kiểu giâm cành sẽ có được những cây mang đặc tính tốt từ cây mẹ, nhanh cho quả và nhiều quả hơn so với trồng bằng hạt.

1 2

3 4

Hình 2.1 Cây Gấc Momordica cochinchinensis 1 và 4: trái gấc; 2: hoa gấc; 3: hạt gấc

(http://www.icar.org.in/dipa/events /ICAR-NEWS/octdec06.pdf)

2.1.4 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của gấc

có mặt trong gấc liên kết với các acit béo mạch dài làm cho nó có tính hoạt hóa sinh học cao hơn

• Carotenoid

Là những hợp chất tetratecpen, có màu từ vàng đến đỏ, phổ biến trong các loại rau quả, cây xanh với hơn 600 các thành phần polyisoprenoid khác nhau ở các dạng đồng phân cis hoặc trans Các hợp chất của carotenoid như: caroten, lycopen, xantophyl trong đó caroten chiếm một vị trí quan trọng

Carotenoid có nhiều trong các loại rau và các loại quả, là hợp chất có khả năng chống oxi hóa rất mạnh Carotenoid là nhóm tiền sinh tố A đối với động vật có vú, giữ chức năng sinh học rất quan trọng trong quá trình phát triển cơ thể Tác động chủ yếu của carotenoid không phải là tham gia quá trình oxi hóa, oxi hóa khử, mà là trao đổi thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức phận của màng tế bào và tăng sự đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể Chính vì vậy mà carotenoid được xác định

là những chất điều hòa dinh dưỡng

Bảng 2.1 Thành phần carotenoid có trong màng hạt gấc

Thành phần carotenoid Hàm lượng (µg/g màng hạt gấc tươi) Tổng lượng lycopen 1546,5 – 3053,6 Trans – lycopen 1342,1 – 2971,5

Cis – lycopen 82,1 – 204,4

Tổng lượng beta caroten 636,2 – 836,3

Trans – beta caroten 509,7 – 701,2

Cis – beta caroten 39,1 – 172,6

Tổng lượng beta caroten 67,0 – 106,8

(Ishida và ctv, 2004)

- Tác dụng: dầu gấc có chứa nhiều lycopen đến mức có thể tự kết tinh thành những tinh thể, đây là chất carotenoid có khả năng chống lão hóa rất mạnh và vô hiệu hóa 75% các chất gây ung thư Lycopen thuộc nhóm tiền vitamin A giống như beta caroten, tuy nhiên trong cơ thể lycopen không chuyển thành vitamin A Lycopen có năng lực chống oxy hóa mạnh hơn 2 lần so với beta caroten và 10 lần so với α – tocopherol (vitamin E) Đây cũng là carotenoid duy nhất có khả năng ngăn ngừa được chứng nhồi máu cơ tim, hạn chế được những biến chứng của bệnh tiểu đường và bảo

vệ cấu trúc DNA khỏi bị tổn thương trong những trường hợp bị nhiễm tia xạ, nhiễm chất độc dioxin, các hóa chất sử dụng trong bảo quản nông sản, thực phẩm… Cơ thể chúng ta không có khả năng tự tổng hợp chất lycopen, bởi thế mà phải “thu nhận” nó

từ bên ngoài qua chế độ ăn uống Hơn nữa, trong trái gấc đã chứa sẵn các acit béo không no, vì thế lycopen được hòa tan một cách tự nhiên giúp cơ thể dễ hấp thu

• Tocopherol

Có trong dầu gấc ở dạng α – tocopherol, đây chính là vitamin E thiên nhiên nên

có tác dụng mạnh nhất Vitamin E giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo tính toàn vẹn và sự bền chắc của màng tế bào (Lê Ngọc Tú, 2000) Chính vì thế, vitamin E không chỉ là tác nhân bảo vệ tim mạch mà còn chống xơ cứng thành mạch ở người già, tác nhân ngăn chặn ung thư, nâng đỡ hệ miễn dịch mà còn là tác nhân bảo vệ não, hỗ trợ sự phát triển của cơ quan sinh sản và làm đẹp da

- Acid linoleic (omega 6) 14,7 %: còn gọi là vitamin F, chất này giúp bền vững thành mạch máu, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, giúp hạ cholesterol máu

- Acid oleic (omega 9) 44,4 %: giúp phát triển hệ thống thần kinh nhất là các loại sợi có myelin Chất này đặc biệt tốt cho bà mẹ mang thai và cho con bú, trẻ sơ sinh

và trẻ nhỏ

- Ngoài ra, trong dầu gấc còn chứa các nguyên tố vi lượng như: cobon, sắt, kẽm, selen…, acid stearic 7,89 %, acid palmatic 33,8 % Màng hạt gấc sau khi được chiết rút dầu thì phần còn lại là khô bã gấc

Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng của khô bã gấc

Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng

(Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP - Viện Dinh dưỡng, 2008)

Khô bã gấc có thành phần dinh dưỡng tương đương với ngô vàng loại tốt, đặc biệt các chất chống oxy hóa như beta caroten, tocopherol và lycopen tuy đã được chiết rút vào tinh dầu, nhưng trong khô bã gấc vẫn còn lại khá nhiều Beta caroten cao hơn của ngô hạt 90 lần, lycopen cao hơn của cà chua tươi 180 lần Khô bã gấc được sử dụng là nguồn thức ăn rất tốt cho gia súc, gia cầm Nhờ vậy, con vật khỏe mạnh, sinh trưởng và sinh sản tốt, ngăn ngừa được các bệnh do vi khuẩn, virus và độc tố nấm mốc Không những vậy, lycopen và beta caroten trong khô bã gấc còn là những chất nhuộm màu tự nhiên, giúp tăng đậm độ màu của da và lòng đỏ trứng (Freiburg và ctv, 2004)

Bảng 2.3 Thành phần acid béo của dầu màng gấc

Thành phần acit béo dầu màng gấc

Tên acit béo Tài liệu trong nước Tài liệu Nhật Bản

da thần kinh, trĩ, mụn nhọt độc, làm tan các vết bầm do chấn thương, cầm máu, làm vết thương mau lành, eczema, lở loét, tắc tia sữa, chấn thương ứ huyết Nhân hạt gấc chủ yếu chỉ được dùng làm thuốc bôi ngoài da để chữa mụn nhọt ít dùng đường uống

vì có độc tính Dân gian, người ta còn dùng hạt gấc tán nhuyễn để đắp chữa chai bàn chân

2.1.4.3 Rễ gấc

Có vị hơi đắng, mùi thơm, tính mát, được sao vàng, tán nhỏ, dùng uống chữa tê thấp, sưng chân, chữa mụn nhọt, trĩ, đau nhức, trừ thấp nhiệt, hoạt huyết, lợi tiểu Trong rễ chứa momordine (một saponin triterpenoid), các chiết xuất cồn có sterol, bessisterol tương đương với spinasterol Thân củ chứa chondrillasterol, cucurbitadienol, một glycoprotein và hai glycosid có tác dụng hạ huyết áp

2.1.4.4 Thân và lá gấc

Trong thân, lá gấc có chứa một số hợp chất thứ cấp như momordine, aspinaterol, sesquibenihol, chondrillasterol, cucurbitadienol, 1 glycoprotein và 2 glycosid có tác dụng hạ huyết áp Các chất này có tác dụng phòng chống ung thư, u, bướu ở da và làm giảm hàm lượng đường trong máu Trong dân gian, lá gấc với tầm gửi đắp ngoài da làm thuốc chữa sưng tấy

2.2 Tình hình nghiên cứu về cây gấc

Những năm qua, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã có nhiều công trình

khoa học báo cáo về dinh dưỡng của cây gấc và cách tách chiết một vài hợp chất, chủ yếu dùng trong y học

Đào Như An, Nguyễn Ngọc Khôi và Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2002), đã tách chiết và phân lập cao chiết toàn phần từ hạt gấc (cao MeOH, n-Butanol và cao nước),

các loại cao này thử nghiệm với ấu trùng Artemia salina và kết quả cao MeOH có tác

dụng sinh học tốt nhất và có những phản ứng đặc trưng của saponin Trong một nghiên cứu khác, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ và cộng sự đã thực hiện đề tài nghiên cứu chứng minh về tác dụng kháng viêm giảm đau của hạt gấc trên thực nghiệm với phương châm kết hợp y học hiện đại với y học cổ truyền để xác minh tác dụng trị liệu của hạt gấc Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết toàn phần từ hạt gấc nướng thể hiện cường

độ tác động kháng viêm mạnh hơn từ hạt gấc không nướng (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 2001)

Năm 2003 Viện dinh dưỡng đã hợp tác với Trung tâm CEDERO Bùi Đình Sang

và Bùi Đình Oánh, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Nông nghiệp 1, Công ty Đồng Nam Dược Hà Nội, xây dựng dự án phát triển trồng gấc quy mô gia đình và công nghiệp, triển khai sản xuất màng đỏ hạt gấc sấy khô, ép dầu gấc xuất khẩu và tiêu dùng nội địa, sản xuất mứt kẹo, bánh kem xốp gấc, sản xuất trứng gà có lượng vitamin A, E cao, cholesterol thấp, góp phần phòng và điều trị một số bệnh mạn tính thiếu vitamin

A và tăng cường sức khỏe bền vững cho cộng đồng

Hoàng Thị Yến (2004), khi tiến hành tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một chất ở màng nhân và hạt gấc Kết quả cho thấy, dầu màng gấc có khả

năng kháng vi khuẩn Gram âm (E coli, P aeruginosa), Gram dương (B.subtillis), với nấm mốc (Asp niger và F oxyoporum) và không kháng được nấm men (C.albicans, S cerevisiae) (Hoàng Thị Yến, 2004)

2.3 Tình hình nghiên cứu về carotenoid trong và ngoài nước

Ngày nay, theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy màu đỏ của lycopen và màu vàng của beta caroten với hàm lượng cao gấp 15,1 lần so với cà rốt và 68 lần so với cà chua

Năm 1941 Bùi Đình Sang và F.Guichard, trường Đại Học Dược Hà Nội, đã chiết từ màng đỏ quả gấc và nhận thấy lượng carotenoid (tiền vitamin A) rất cao, gấp hàng chục lần trong củ cà rốt, cà chua và dầu cọ đỏ (Bùi Minh Đức và Hà Thị Anh Đào, 2004) Sau đó Bùi Đình Oánh (1942) đã sử dụng kỹ thuật công nghiệp để ép dầu gấc xuất sang Pháp và tiếp theo các GS Nguyễn Văn Đàn, Đinh Ngọc Lâm, Hà Văn Mạo… đã nghiên cứu phân tích bổ sung thành phần carotenoid trong quả gấc và sử dụng trong lâm sàng để phục vụ nhu cầu phòng bệnh và điều trị vết thương, đề phòng ung thư gan nguyên phát v.v…

Trường Đại Học Dược Hà Nội, đã chiết từ màng đỏ quả gấc và nhận thấy lượng carotenoid (tiền vitamin A) rất cao, gấp hàng chục lần trong củ cà rốt, cà chua và dầu

cọ đỏ Sau đó Bùi Đình Oánh (1942) đã sử dụng kỹ thuật công nghiệp để ép dầu gấc xuất sang Pháp và tiếp theo các GS Nguyễn Văn Đàn, Đinh Ngọc Lâm, Hà Văn Mạo… đã nghiên cứu phân tích bổ sung thành phần carotenoid trong quả gấc và sử dụng trong lâm sàng để phục vụ nhu cầu phòng bệnh và điều trị vết thương, đề phòng ung thư gan nguyên phát v.v…

Tại Hoa Kỳ theo dõi sử dụng liều cao beta caroten trong điều trị bệnh nhân HIV pha II 120mg/ngày và tăng nhiệt độ cơ thể 42oC trong 1 giờ, tắm hơi đã tăng khả năng phục hồi T-helper CD4/CD8 đáp ứng tốt miễn dịch, giảm quá trình tiến triển HIV-AIDS, đồng thời tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine

Năm 2002, Vương Lệ Thúy và cộng tác viên Viện Dinh dưỡng, Bộ Y tế đã tiến hành nghiên cứu khảo sát trên 3 nhóm 193 trẻ em từ 3 - 5 tuổi tại một xã thuộc huyện Thanh Miện tỉnh Hải Dương gồm:

Nhóm 1: ăn xôi gấc trộn 20 g màng đỏ hạt gấc/ngày, có lượng beta caroten 3,5 mg Nhóm 2: ăn xôi trộn 5 mg beta caroten tổng hợp

Nhóm 3: ăn xôi có nhuộm phẩm màu giống màu của xôi gấc

Sau một tháng thử nghiệm, kiểm tra một số chỉ tiêu máu thấy trẻ ăn xôi gấc ngoài lượng hồng cầu tăng lên rõ rệt còn tăng lượng beta caroten, vitamin A và lycopen trong máu, cao hơn hẳn so với trước khi ăn và hơn cả hai nhóm đối chứng (Vuong Le Thuy và ctv, 2002)

Khi phân tích giá trị dinh dưỡng của màng hạt gấc, nhóm nghiên cứu Vương Lệ Thúy và cộng sự của trường Đại học Hawaii (2005) báo cáo rằng hàm lượng carotenoid tổng số trung bình là 497,4 μg/g chất tươi và α -tocopherol là 76,3 μg/g chất tươi Đây là một thông số dinh dưỡng đáng chú ý do hàm lượng của các chất trên cao rất nhiều so với những loại cây khác như cà rốt, cà chua

Hình 2.2 Đồ thị so sánh hàm lượng beta caroten của gấc với các loại trái cây khác

(http: //www.gac-seeds.com/)

Hình 2.3 Biểu đồ so sánh hàm lượng lycopen của gấc với các loại trái cây khác

(http: //www.gac-seeds.com/)

2.3.1 Nguyên tắc của sự chiết xuất

Dược liệu được cấu tạo bởi các tế bào thực vật Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ đi qua các thành tế bào của dược liệu, các hoạt chất bên trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện một quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng

về nồng độ hoạt chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào (Trần Hùng, 2004)

2.3.2 Một số yêu cầu cơ bản khi tiến hành chiết xuất

Một số yếu tố cần quan tâm:

• Hóa chất không độc hại

• Giá thành hóa chất rẻ

• Thời gian thực hiện ngắn

• Dung môi dùng trong chiết xuất phải hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần trong nhiên liệu

• Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần

• Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không ăn mòn thiết bị, không tạo hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém

Thông thường không có loại dung môi nào phù hợp với tất cả các yêu cầu trên, người

ta sử dụng dung môi không tan trong nước như petroleum ether, diethyl ether,… hay dung môi tan trong nước như ethanol, aceton,…

2.3.3 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất

Có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất (Nguyễn Khắc Quỳnh

Sự hòa tan chất tan từ các tế bào vỡ sẽ đưa chất tan vào thẳng dịch chiết Quá trình tạo thành dịch chiết xảy ra nhanh vì dung môi không mất thời gian đi tới chỗ chất tan và dung dịch ngay khi được tạo thành đã là một bộ phận của dịch chiết Tuy nhiên, sự hòa tan này không có tính chọn lọc, tất cả những chất tan được trong dung môi đều có mặt trong dịch chiết Sự hòa tan xảy ra trong các tế bào nguyên vẹn chỉ tạo nên dung dịch chất tan bên trong tế bào Sự hòa tan đơn thuần không đưa chất tan trong tế bào vào dịch chiết

2.3.3.2 Sự khuếch tán

Khi cho dung môi tiếp xúc với các tiểu phân dược liệu, ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan (các tế bào, còn nguyên hay bị vỡ) dung dịch có nồng độ cao hơn với

những nơi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan tạo nên sự chênh lệch nồng độ này Các phân tử chất tan sẽ di chuyển từ nơi có nồng độ cao tới nơi có nồng độ thấp hơn làm cho chất tan có mặt đồng đều trong dung dịch

Sự khuếch tán trong dung dịch xảy ra được là do chuyển động nhiệt của phân tử (chuyển động Brown) của chất tan cũng như của dung môi

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán gồm:

• Sự chênh lệch nồng độ

• Nhiệt độ

• Độ nhớt của dung môi,

Sự khuếch tán giúp thúc đẩy quá trình hòa tan và kéo chất tan từ các tế bào vỡ ra khỏi

tế bào đi vào dịch chiết

Trong khuếch tán qua các kênh bào tương, đường kính của các kênh bào tương sẽ quyết định kích thước và vận tốc của của những chất có thể qua màng Các chất có kích thước nhỏ hơn các kênh bào tương sẽ đi qua dễ dàng trong khi các phân tử lượng lớn (protein, polysaccharide v.v…) sẽ khó qua hơn và sẽ nằm lại trong tế bào Như thế sự thẩm tích làm cho quá trình hòa tan chiết xuất có tính chọn lọc hơn

Quá trình hòa tan chiết xuất giúp kéo các chất tan ra khỏi các tế bào còn nguyên vẹn

đi vào dịch chiết

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích gồm:

• Sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào

• Cấu trúc của vách tế bào và kích thước tiểu phân dược liệu

• Kích thước chất tan

• Nhiệt độ

• Độ nhớt của dung môi

2.3.4 Những nhân tố ảnh hưởng trong quá trình chiết xuất

Đường kính của các kênh bào tương càng lớn, các chất qua lại vách tế bào càng

dễ dàng Quá trình chiết xuất càng xảy ra nhanh hơn

Nguyên liệu càng được chia nhỏ, tỉ lệ của số tế bào nguyên vẹn so với số tế bào

bị vỡ giảm, quá trình hòa tan đơn giản tăng và thời gian khuếch tán chất tan vào dịch chiết giảm, thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn

Tuy nhiên càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết càng có nhiều tạp chất làm cho lượng cao chiết nhiều lên, thành phần phức tạp và khó tách các chất hơn

Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh, Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc đô khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng giảm

Dạng thù hình của chất tan có ảnh hưởng nhiều đến tốc độ hòa tan Đa số các chất tan trong tế bào dược liệu đã phơi khô tồn tại dưới dạng vô định hình trong một hỗn hợp gồm nhiều chất nên sự hòa tan xảy ra nhanh hơn so với dạng tinh thể hay đơn chất

2.3.4.2 Dung môi

Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng dung môi và việc chọn dung môi thích hợp cho một phương pháp chiết là điều cần thiết Dung môi sử dụng cần phải đáp ứng các yêu cầu sau:

- Phải có tính hòa tan chọn lọc, tức là hòa tan tốt các chất cần tách mà không được hòa tan hoặc hòa tan ít các chất khác

- Không có tác dụng hóa học với các cấu tử của dung dịch

- Không phá hủy thiết bị

- Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản

9 Áp suất

Tăng áp suất làm tăng tốc độ thấm dung môi vào nguyên liệu Thông thường việc tăng

áp suất này thường đi kèm với việc tăng nồng độ dung dịch

9 Các yếu tố khác

Chất trợ tan: các chất diện hoạt, một khi được sử dụng trong chiết xuất có tác dụng làm tăng tính thấm của chất tan, làm quá trình phân tán chất tan vào dung môi dễ dàng hơn do đó làm đẩy nhanh quá trình chiết xuất

Siêu âm và vi sóng: Siêu âm và vi sóng có tác dụng làm tăng chuyển động nhiệt của các phân tử chất tan và dung môi, làm tăng nhiệt độ, tăng sự hòa tan và đẩy nhanh quá trình khuếch tán

2.4 Giới thiệu sắc kí

2.4.1 Sắc kí lớp mỏng

Nguyên tắc

Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp thụ (thường là silica gel, nhôm oxyt) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tỉnh

Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau

2.4.2 Sắc kí khí

2.4.2.1 Nguyên tắc sắc kí khí

Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong mẫu sẽ bị hấp phụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lưu khác nhau Trên cơ sở khác nhau về thời gian lưu này mà người ta có thể định tính và định lượng cấu tử cần nghiên cứu Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký xảy ra ở đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện, tín hiệu này được khuếch đại và xử lý trên hệ thống máy tính thành các peak khác nhau về cả chiều cao và diện tích

Trên sắc ký đồ thu được ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng cho chất cần tách (định tính) còn diện tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu

Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID (Phạm Hùng Việt,

2005)

2.4.2.2 Thiết bị sắc ký khí

Bộ phận bơm mẫu (injector)

Mẫu có thể được đưa vào cột theo các hình thức:

Gián tiếp và chia dòng

Gián tiếp và không chia dòng

Trực tiếp

Bơm mẫu có chia dòng (split):

Phương pháp bơm mẫu theo cách chia dòng cho đến nay vẫn được sử dụng nhiều nhất Mẫu được bơm vào máy theo thể thức thông thường như đối với sắc ký khí cột nhồi, nhưng sau đó bị chia nhánh sao cho chỉ có một phần nhỏ của lượng mẫu ban đầu đi vào cột mao quản Tỷ lệ chia dòng thông dụng nhất nằm trong khoảng từ 1:50 cho tới 1:500

Nhược điểm duy nhất của bộ phận bơm mẫu kiểu này là sự “phân biệt đối xử” đối với các cấu tử có độ bay hơi khác nhau của mẫu rất khác nhau Nó làm cho thành phần của phần mẫu đi vào cột tách khác so với thành phần của mẫu ban đầu

Bơm mẫu không chia dòng (splitless):

Trong kỹ thuật này, khoảng 2 μl dung dịch mẫu pha loãng được bơm vào buồng bay hơi mẫu Nhiệt độ của buồng bay hơi mẫu được đặt rất thấp (tương đương nhiệt độ phòng) Sau một thời gian nhất định thì mở bộ chia dòng (splitter) Và sau khi peak dung môi xuất hiện, mới bắt đầu mở chương trình nhiệt độ Kỹ thuật bơm mẫu này làm cho peak dung môi nhỏ đi rất nhiều so với bình thường và do vậy các peak ra ngay sau peak dung môi sẽ không bị xen phủ mất

Điều cần lưu tâm duy nhất trong kỹ thuật này là thời gian lưu lại của mẫu trong buồng bay hơi mẫu khá lớn, có thể dẫn đến khả năng hấp phụ

Cột tách (column)

Hiện nay ở Việt Nam, cột nhồi thông thường vẫn là loại cột sắc ký phổ biến nhất Trong khi đó, đa số các phòng thí nghiệm, kể cả trong kỹ nghệ, ở nhiều nước khoa học tiên tiến, hầu như đã bỏ hẳn cột nhồi mà chỉ còn sử dụng cột mao quản

Cột nhồi thông thường: loại cột này thường có đường kính trong từ 3 – 6 mm Đối với mục đích điều chế thì sử dụng các cột tách có đường kính trong lớn hơn, thường tới 12 mm, được nhồi đầy bằng một loại chất mang có phủ trên bề mặt một lớp mỏng pha lỏng tương ứng có khối lượng từ 0,1 % – 25 % khối lượng so với chất mang

Cột mao quản: là loại cột tách với đường kính nhỏ hơn 1 mm và thành trong của cột được tẩm pha tĩnh Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đưa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất tách rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tương tác với pha tĩnh bám trên thành cột

và được pha tĩnh “lưu giữ” lại với mức độ khác nhau

Detector

Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lượng không điện thành các đại lượng

có tín hiệu điện Ngày nay, đã có gần 30 loại detector khác nhau Trong đó, 3 loại detector phổ biến nhất là: detect dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD)

2.4.3 Sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

2.4.3.1 Nguyên tắc của sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

Nguyên lí hoạt động: phương pháp này dựa theo tính chất hấp thụ, sự phân bố hay

trao đổi ion của chất tan (chất phân tích) với pha tĩnh ở trong cột để tách các chất Vì dùng hạt pha tĩnh kích thước rất nhỏ (3 - 10 µm) để tăng số đĩa lí thuyết cho cột và để cân bằng giữa pha tĩnh và pha động được thiết lập nhanh, nên phải dùng bơm hoặc khí

ép có áp suất cao để đẩy pha động đi được nhanh Cột tách phải bằng thép không gỉ để chịu được áp suất cao (400 - 600 atm) và có đường kính 1 - 4 mm Thể tích dung dịch mẫu khoảng vài đến vài chục µl (được tiêm vào phía trên cột) Nếu dùng máy tự ghi sẽ thu được sắc kí đồ với một dãy các pic mỗi pic ứng với một chất (Alexander Efimov, 2005)

ƒ Máy bơm cao áp

ƒ Bộ phận bơm mẫu (bằng tay hay tự động)

ƒ Cột sắc ký (pha tĩnh)

ƒ Đầu dò (nhận tín hiệu)

ƒ Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận, tín hiệu và xử lý dữ liệu và điều khiển

hệ thống HPLC

Bình chứa dung môi pha động

Bình đựng dung môi làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh Bình luôn có nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào bình Các ống dẫn dung môi thông từ bình đến đầu bơm cao áp, đầu ống dẫn dung môi trong bình gắn một nút lọc để lọc dung môi và cũng để giữ ống dẫn luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình của dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chỉ sử dụng tối đa là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất Máy HPLC thường sử dụng hỗn hợp nhiều loại dung môi, tỉ lệ của mỗi loại dung môi trong hỗn hợp được điều khiển tự động, máy bơm hút các loại dung môi trong bình đưa vào chỗ phối trộn

Trong sắc ký lỏng, tính phân cực của pha động giữ vai trò trong việc tách chất Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, methanol, acetonitril hoặc hỗn hợp của các loại kể trên Tất cả các dung môi phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn HPLC

Bộ khử khí (Degasse)

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi Khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

Máy bơm cao áp

Loại bơm của máy HPLC là loại bơm đặc biệt với áp suất cao để bơm pha động qua cột sắc ký Bơm được cấu tạo để chịu được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt

Bộ phận tiêm mẫu

Máy HPLC có hệ thống bơm mẫu đặc biệt: ống chứa mẫu (sample loop) là van

có hai cổng, giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác nhau

Mẫu khảo sát được bơm vào máy nhờ một kim tiêm Gạt van theo chiều qui định, ống chứa mẫu được nối thông với ống dẫn vào cột, pha động chảy ngay qua đoạn ống chứa mẫu, cuốn mẫu đi vào cột sắc ký Trong khi đó, ống còn lại thông ra ngoài không khí và đưa lượng mẫu thừa ra ngoài

Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: tiêm mẫu bằng tay và tiêm mẫu tự động (autosampler)

Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1 - 10 mm, hạt chất nhồi cỡ φ = 5-10 µm (ngoài ra còn một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt)

Trong HPLC, tùy bản chất của quá trình sắc ký trên pha tĩnh mà người ta chia thành nhiều loại cột khác nhau:

Đầu dò quang phổ tử ngoại khả biến (UV-Vis detector)

Hệ thống đầu dò gồm một nguồn sáng, thiết bị lựa chọn bước sóng, một ống quang điện, một ống chứa dung dịch mẫu phân tích

Việc lựa chọn để đầu dò hoạt động ở bước sóng nào tùy vào sự phân tích hợp chất hữu

cơ có mức hấp thu mạnh, vượt trội so với những hợp chất khác có bước sóng đó Loại đầu dò này sử dụng nhiều nhất trong HPLC, vì nó không nhạy với nhiệt độ, có sự đáp ứng tuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu chất

Đầu dò huỳnh quang (fluorescence detector)

Dùng tia UV để kích thích hóa chất, hóa chất với cấu trúc thích hợp sẽ phát huỳnh quang ở bước sóng dài hơn so với bước sóng kích thích, người ta đo cường độ phát huỳnh quang để từ đó tính ra được nồng đô chất phân tích ban đầu

Đầu dò huỳnh quang thuộc loại có đặc tính chọn lọc cao, chỉ có chất có tính huỳnh quang mới được phát hiện Như vậy, hoặc chất có tính huỳnh quang tự nhiên, hoặc thực hiện phản ứng trước hay sau cột sắc ký lỏng để tạo dẫn xuất có tính huỳnh quang rồi mới đo Đầu dò huỳnh quang rất nhạy, có thể đo được lượng hóa chất rất nhỏ