THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT TRONG MÔ SẸO CỦA CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour) Spreng) IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA THỰC VẬT TRONG MƠ SẸO CỦA CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour) Spreng) IN VITRO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ THÙY LAM Niên khóa: 2006 - 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAROTENOID TRONG TRÁI GẤC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT TRONG MÔ SẸO CỦA CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour) Spreng) IN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực KS TÔN TRANG ÁNH TRƯƠNG THỊ THÙY LAM KS TRỊNH THỊ PHI LY Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn cha mẹ người thân gia đình ni dưỡng giáo dục tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Em xin gởi lời biết ơn đến: - Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh - Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh - Ban chủ nhiệm, Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh Học Đã hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình học tập hồn thành đề tài Em xin chân thành biết ơn: KS Tôn Trang Ánh KS Trịnh Thị Phi Ly tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian công sức để truyền đạt cho em kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo điều kiện tốt cho em hồn thành khóa luận Các anh chị làm việc phòng Hóa – Lý, Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh động viên chia sẻ kinh nghiệm làm việc thời gian thực tập Viện Chân thành cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học DH06SH động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Tháng 07 năm 2010 Trương Thị Thùy Lam i TÓM TẮT Cây gấc khơng có giá trị cao y học mà sử dụng rộng rãi thực phẩm Trái gấc có chứa beta caroten lycopen với hàm lượng cao gấp nhiều lần loại thực phẩm sử dụng phổ biến giới Các phận sử dụng để chữa bệnh nhân gian y học đại Vì chúng tơi thực đề tài “Thiết lập quy trình chiết xuất carotenoid trái gấc xác định thành phần hóa thực vật mơ sẹo gấc in vitro” Mục đích đề tài đánh giá hàm lượng beta caroten lycopen dịch chiết trái gấc thu thập từ vùng khác phân tích sơ hợp chất có mơ sẹo gấc in vitro Nội dung thực hiện: tiến hành chiết xuất carotenoid, xác định hàm lượng beta caroten lycopen trái gấc thu thập vùng Hưng Yên, Đà Nẵng, Bình Thuận Đồng thời phân tích thành phần hóa thực vật mô sẹo gấc in vitro Kết đạt được: • Phương pháp cho hiệu chiết xuất cao phương pháp 2, cao gấp 2,15 ln Hm lng carotenoid 759,10 àg/g, beta caroten (1,6910 mg/g), lycopen (70,4566 mg/g) trái gấc Hưng Yên cao • Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật cho thấy mơ sẹo gấc in vitro chứa chủ yếu chất hữu cơ: acid béo, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic, saponin, tinh dầu, triterpenoid… • Kết định tính saponin sắc kí lớp mỏng cho thấy có diện saponin mơ sẹo gấc in vitro • Xác định hàm lượng acid linoleic (1,9210 mg/g), acid oleic (1,4985 mg/g), beta caroten (7,9596 µg/g) mơ sẹo gấc in vitro ii SUMMARY “Establishing carotenoid extraction protocol in Gac fruit and the determine compostition chemical plants in scar tissue of Gac fruit in vitro” (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) Content: extracting carotenoid and determine beta carotene and lycopen content in three kinds of Gac fruit that was collected in Da Nang, Binh Thuan, Hung Yen province Determining the chemical compostition in callus of Gac fruit in vitro Some results of this thesis: The yiel of carotenoid extraction of the first protocol was higher than the second protocol The content of carotenoid 759.10 µg/g, beta carotene (1.6910 mg/g) and lycopen (70.4566 mg/g) in Hung Yen is the highest Callus of Gac in vitro contained mostly substances: fat, organic acids, reducing sugar, polyuronic, saponins, essential oils, triterpenoid Saponin was found in callus of Gac in vitro by thin layer chromatography The results of the analysis indicated that callus of Gac in vitro contained linoleic acid (1.9210 mg/g), acid oleic (1.4985 mg/g) and also beta caroten (7.9596 µg/g) iii MỤC LỤC Lởi cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách từ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Sơ lược gấc 2.1.1 Phân loại thực vật 2.1.2 Nguồn gốc phân bố .3 2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển hình thái gấc 2.1.3.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển 2.1.3.2 Đặc điểm hình thái .4 2.1.4 Thành phần hóa học tác dụng sinh học gấc 2.1.4.1 Màng hạt gấc 2.1.4.2 Hạt gấc 10 2.1.4.3 Rễ gấc .10 2.1.4.4 Thân gấc 11 2.2 Tình hình nghiên cứu gấc 11 2.3 Tình hình nghiên cứu carotenoid nước 12 2.3.1 Nguyên tắc chiết xuất .14 2.3.2 Một số yêu cầu tiến hành chiết xuất 14 2.3.3 Các trình xảy chiết xuất 15 2.3.3.1 Sự hòa tan 15 iv 2.3.3.2 Sự khuếch tán 15 2.3.3.3 Quá trình thẩm tích 16 2.3.4 Những nhân tố ảnh hưởng trình chiết xuất 16 2.3.4.1 Nguyên liệu .16 2.3.4.2 Dung môi 17 2.3.4.3 Kĩ thuật chiết 17 2.4 Giới thiệu sắc kí 18 2.4.1 Sắc kí lớp mỏng 18 2.4.2 Sắc kí khí 18 2.4.2.1 Nguyên tắc sắc kí khí .18 2.4.2.2 Thiết bị sắc kí khí 19 2.4.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 21 2.4.3.1 Nguyên tắc sắc kí lỏng cao áp 21 2.4.3.2 Thiết bị sắc kí lỏng cao áp 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Nội dung nghiên cứu 24 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.3 Thiết lập quy trình định lượng carotenoid 24 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .24 3.3.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm .24 3.3.1.2.1 Thiết bị dụng cụ 24 3.3.1.2.2 Hóa chất .24 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 24 3.3.2.1 Xử lý nguyên liệu 24 3.3.2.2 Xác định độ ẩm .25 3.3.2.3 Các phương pháp chiết xuất carotenoid 25 3.3.2.3.1 Phương pháp .25 3.3.2.3.2 Phương pháp .26 3.4 Xác định thành phần hóa thực vật mơ sẹo gấc in vitro 27 3.4.1 Vật liệu nghiên cứu 27 v 3.4.1.1 Đối tượng nghiên cứu .27 3.4.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm .27 3.4.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy .28 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.4.3.1 Nhân sinh khối mô sẹo 30 3.4.3.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật mơ sẹo 30 3.4.3.2.1 Xử lý nguỵên liệu 30 3.4.3.2.2 Xác định độ ẩm 30 3.4.3.2.3 Nguyên tắc 30 3.4.3.2.4 Tiến hành 30 3.4.3.3 Tiến hành định tính saponin kĩ thuật sắc kí lớp mỏng 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Độ ẩm nguyên liệu 35 4.2 Chiết xuất carotenoid 35 4.2.1 Đánh giá hiệu chiết xuất phương pháp 35 4.2.2 Đánh giá hàm lượng carotenoid trái gấc thu thập .36 4.2.3 Đánh giá hàm lượng beta caroten lycopen 38 4.3 Xác định thành phần hóa thực vật mơ sẹo gấc in vitro 38 4.4 Độ ẩm mô sẹo .42 4.5 Định tính saponin sắc kí lớp mỏng 42 4.6 Hàm lượng acid béo beta caroten mô sẹo gấc in vitro 43 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.1.1 Quy trình chiết xuất carotenoid 44 5.1.2 Khảo sát thành phần hóa thực vật 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Analysis Of Variance Table – Bảng phân tích biến lượng DE Diethyl ether GC Gas Chromatography – Sắc ký khí HPLC High – performance liquid chromatography MẪU Hưng Yên MẪU Đà Nẵng MẪU Bình Thuận MS Môi trường Murashige Skoog (1962) MS* Mass Spectrometry – Khối phổ NT Nghiệm thức PE Petroleum ether vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần carotenoid có màng hạt gấc Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng khô bã gấc Bảng 2.3 Thành phần acit béo dầu màng gấc Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS 29 Bảng 4.1 Độ ẩm mẫu bột gấc vùng 35 Bảng 4.2 Hàm lượng carotenoid thu từ phương pháp 36 Bảng 4.3 Kết đo OD hàm lượng carotenoid trái gấc Hưng Yên 37 Bảng 4.4 Kết đo OD hàm lượng carotenoid trái gấc Bình Thuận 37 Bảng 4.5 Kết đo OD hàm lượng carotenoid trái gấc Đà Nẵng 37 Bảng 4.6 Kết hàm lượng carotenoid mẫu khô 100% trái gấc vùng 38 Bảng 4.7 Hàm lượng beta caroten lycopen trái gấc 38 Bảng 4.8 Kết phân tích sơ thành phần hóa học mơ sẹo gấc in vitro 39 Bảng 4.9 Kết phân tích hàm lượng acid béo beta caroten mô sẹo 44 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây Gấc Momordica cochinchinensis Hình 2.2 So sánh hàm lượng beta caroten gấc với loại trái khác 13 Hình 2.3 So sánh hàm lượng lycopen gấc với loại trái khác 13 Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa lửa FID 18 Hình 4.1 Dịch chiết carotenoid theo phương pháp 35 Hình 4.2 Dịch chiết carotenoid theo phương pháp 36 Hình 4.3 Mơ sẹo sau thời gian tháng 39 Hình 4.4 Phản ứng dương tính 41 Hình 4.5 Phản ứng âm tính 42 Hình 4.6 Hình qua màu sắc tự nhiên 43 Hình 4.7 Hình phát quan tia UV 43 viii 4.4 Độ ẩm mơ sẹo Cân xác 15 g mẫu chén sứ sấy 105oC đến khối lượng khơng đổi Sau lấy để nguội bình hút ẩm cân khối lượng mẫu thu 9,8 g Như độ ẩm mẫu 34,67% 4.5 Định tính saponin sắc kí lớp mỏng Vết màu tím Hình 4.6 Hình qua màu sắc tự nhiên Hình 4.7 Hình phát quan tia UV Kết hình 4.6 4.7 cho thấy bảng mỏng xuất vết tròn màu nâu tím nhạt vị trí có Rf = 0,63, vết phát quang đèn UV Như mô sẹo gấc in vitro có diện saponin với hàm lượng tương đối nhỏ 43 4.6 Hàm lượng acid béo beta caroten mô sẹo gấc in vitro Bảng 4.9 Kết phân tích mơ sẹo Chỉ tiêu Hàm lượng khối lượng mẫu khô 100% Acid linoleic (mg/g) 1,9210 Acid oleic (mg/g) 1,4985 Beta caroten (µg/g) 7,9596 Kết phân tích cho thấy có diện acid linoleic acid oleic mô sẹo gấc in vitro Cũng dễ dàng nhận thấy có tích lũy beta caroten mơ sẹo gấc in vitro với hàm lượng nhỏ nhiều so với trái gấc Như nuôi cấy thời gian ngắn (2 tháng) mô sẹo gấc in vitro tích lũy số chất có giá trị acid linoleic, acid oleic beta caroten 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận • Phương pháp cho hiệu chiết xuất cao phương pháp 2, cao gp 2,15 ln Hm lng carotenoid 759,10 àg/g, beta caroten (1,6910 mg/g), lycopen (70,4566 mg/g) trái gấc Hưng Yên cao Điều cho thấy gấc Hưng n có giá trị cao mặt dinh dưỡng • Xác định diện cấu tử hữu có mơ sẹo gấc in vitro như: acid hữu cơ, acid béo, carotenoid, polyuronic, saponin, triterpenoid…Trong acid linoleic (1,9210 mg/g), acid oleic (1,4985 mg/g), beta caroten (7,9596 àg/g) Kt qu nh tớnh saponin bng sắc kí lớp mỏng cho thấy có diện saponin mô sẹo gấc in vitro • Xác định hàm lượng acid linoleic (1,9210 mg/g), acid oleic (1,4985 mg/g), beta caroten (7,9596 µg/g) mô sẹo gấc in vitro 5.2 Đề nghị Trong khoảng thời gian ngắn làm khóa luận tốt nghiệp kết thu kết bước đầu Đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu để tìm hiểu thêm tác dụng sinh học thành phần hóa học mơ sẹo gấc in vitro Nếu có kinh phí xin đề nghị phân tích thêm hàm lượng acid béo khác acid myristic, acid palmitic, acid stearic…có mơ sẹo gấc in vitro 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bùi Minh Đức, Hà Thị Anh Đào 2004 Tài liệu tham khảo Vitamin A, retinol, carotenoid gấc, dầu gấc giàu tiền sinh tố A khoa Hóa-VSTP-Viện Dinh Dưỡng Hồng Minh Châu 2002 Cơ sở hóa học phân tích Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Hoàng Thị Yến 2004 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học màng đỏ hạt gấc Kỷ yếu hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học năm 2004 Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội, trang 107 Lê Ngọc Tú 2000 Hóa sinh cơng nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Kim Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất đại học quốc gia Tp HCM Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ 2001 Bài giảng chiết xuất dược liệu Trường Đại Học Y Dược Tp.HCM, trang 109 – 113 Nguyễn Thị Thoan 2009 Khảo sát ảnh hưởng 2,4 – D, BA, NAA nuôi cấy in vitro gấc (Momordica cochinchinensis) Khố luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Tường Vy 2008 Nghiên cứu thành phần hóa học góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng dầu gấc Việt Nam dùng làm thuốc Luận án tiến sỹ dược học Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội GS.TS Đỗ Tất Lợi 1986 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 10 PGS.TS Trần Hùng 2004 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược Tp.HCM 11 Phạm Hùng Việt 2005 Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết khả ứng dụng Nhà xuất Đại Học Quốc Gia, Hà Nội Tài liệu Tiếng nước 12 Delia B Rodriguez-Amayer, Ph D.,2001 Aguide carotenoid analysis in food Printed in the USA, pp 45 13 Huda A K M N and B Sikdar 2006 In vitro plant production through apical meristem culture of Bitter Gourd (Momordica charantia L.) Plant Tissue Cult & Biotech, pp 31-36 14 Alexander Efimov, 2005 HPLC introduction, pp 45-42 15 John R Dean 1998 Extraction methods for enviromental analysis University of Northumbria at Newcastle, UK, pp 25-27 16 Ishida, B.K., Turner C., Chpman M.H., Mc Keon T., (2004), Fatty acid and carotenoid composition of Gac (momordica cochichinensis Spreng) fruit Journal of Agricuture Food Chemistry 52, pp 274 – 279 17 Vuong, L.T., Dueker, S.R & Murphy, S.P (2002), Plasma of carotene and retinon concentrations of children increase after a 30-d supplementation with the fruit Momordica cochinchinensis (gac) American Journal of Clinical Nutrition, Vol 75, pp 872 - 879 46 Tài liệu từ internet 18 http: //www.gac-seeds.com/ 19 http://www.icar.org.in/dipa/events /ICAR-NEWS/octdec06.pdf 47 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm hàm lượng carotenoid trái gấc vùng Lần lặp lại Trung bình Hưng Yên 889,82 713,08 665,39 759,10 Bình Thuận 505,78 630,74 565,29 567,27 Đà Nẵng 520,78 534,74 626,17 560,56 Nghiệm thức Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm hàm lượng carotenoid trái gấc vùng số liệu bảng ANOVA Table for Ham luong by Vung Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 76257,9 38129,0 Within groups 44788,3 7464,71 5,11 0,0507 Total (Corr.) 121046,0 48 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm hàm lượng carotenoid trái gấc vùng số liệu bảng Multiple Range Tests for Ham luong by Vung Method: 95,0 percent LSD Vung Count Mean Homogeneous Groups DN 560,563 X BT 567,27 X HY 759,097 X Contrast Difference +/- Limits BT - DN 6,70667 172,616 BT - HY *-191,827 172,616 DN - HY *-198,533 172,616 * denotes a statistically significant difference Phụ lục A – KẾT QUẢ SẮC KÍ ĐỒ HPLC CỦA BETA CAROTEN Hình Sắc kí đồ chuẩn HPLC phân tích hàm lượng beta caroten 49 Hình Sắc kí đồ HPLC phân tích hàm lượng beta caroten mẫu dịch chiết Hưng n Hình Sắc kí đồ HPLC phân tích hàm lượng beta caroten dịch chiết mẫu Đà Nẵng 50 Hình Sắc kí đồ HPLC phân tích hàm lượng beta caroten dịch chiết mẫu Bình 51 Thuận Hình sắc kí đồ HPLC phân tích hàm lượng beta caroten mẫu mô sẹo 52 B - KẾT QUẢ SẮC KÍ ĐỒ GC ACID LINOLEIC VÀ ACID OLEIC Hình sắc kí đồ GC phân tích hàm lượng acid linoleic acid oleic mẫu mô sẹo 53 C - KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG BETA CAROTEN, LYCOPEN, ACID LINOLEIC VÀ ACID OLEIC Bảng Hàm lượng beta caroten lycopen Đà Nẵng 54 Bảng Hàm lượng beta caroten lycopen Hưng Yên 55 Bảng Hàm lượng beta caroten lycopen Bình Thuận 56 Bảng Hàm lượng acid linoleic, acid oleic beta caroten mô sẹo 57 ... 17 2.4 Giới thi u sắc kí 18 2.4.1 Sắc kí lớp mỏng 18 2.4.2 Sắc kí khí 18 2.4.2.1 Nguyên tắc sắc kí khí .18 2.4.2.2 Thi t bị sắc kí khí ... 2.4.3.2 Thi t bị sắc kí lỏng cao áp 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Nội dung nghiên cứu 24 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.3 Thi t... cứu 24 3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .24 3.3.1.2 Thi t bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm .24 3.3.1.2.1 Thi t bị dụng cụ 24 3.3.1.2.2 Hóa chất .24 3.3.2