KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TRÍCH LY VÀ ĐỘ BỀN MÀU ANTHOCYANIN TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM HIBISCUS SABDARIFFA L. Sinh viên thực hiện : LÝ HOÀNG VŨ Ngành : CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC Niên khoá : 20052009 THÁNG 8

trong dung môi nước, ứng dụng để sản xuất phẩm màu thực phẩm và hạn chế tác động đến môi trường, công trình nghiên cứu đã đạt được các kết quả sau: Các điều kiện thích hợp để trích ly

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TRÍCH LY VÀ ĐỘ BỀN MÀU

ANTHOCYANIN TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM

HIBISCUS SABDARIFFA L

Sinh viên thực hiện : LÝ HOÀNG VŨ Ngành : CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC Niên khoá : 2005-2009

THÁNG 8 - 2009

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TRÍCH LY VÀ ĐỘ BỀN MÀU

ANTHOCYANIN TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM

Giáo viên hướng dẫn

TS LÊ THỊ HỒNG NHAN

THÁNG 8 - 2009

LỜI CẢM ƠN

Không gì có thể diễn tả được lòng biết ơn của con đối với Ba Mẹ Con xin cảm

ơn Ba Mẹ và gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ con, động viên, khuyến khích, hỗ trợ con, cho con có được kết quả như ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Lê Thị Hồng Nhan cùng toàn thể quý thầy cô trong bộ môn Kĩ thuật Hữu cơ trường Đại Học Bách Khoa TP HCM đã tận tình, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Chị Vũ Thị Thanh Tâm đã nhiệt tình chỉ dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn cùng thực hiện luận văn tại Phòng thí nghiệm Kĩ thuật Hữu cơ trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM, cùng các sinh viên lớp DH05HH, trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt luận văn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Với mục đích xây dựng quy trình trích ly anthocyanin hoàn chỉnh từ đài hoa

bụp giấm Hibiscus Sabdariffa L trong dung môi nước, ứng dụng để sản xuất phẩm

màu thực phẩm và hạn chế tác động đến môi trường, công trình nghiên cứu đã đạt

được các kết quả sau:

Các điều kiện thích hợp để trích ly bột màu anthocyanin ở quy mô phòng thí nghiệm: trích với tỉ lệ dung môi / nguyên liệu là 8/1 (ml/g) tại 60oC trong thời gian 30 phút và hiệu suất thu cao khoảng 42%, hàm lượng anthocyanin trong cao khoảng 16mg/g hay 1.6%

Qua các khảo sát thực hiện trên thiết bị pilot Comlex – 01, kết quả thích hợp cho quá trình trích ly anthocynin từ đài hoa bụp giấm khô là:

• Nguyên liệu xay nhỏ

• Tỉ lệ scale-up từ 1:50 đến 1:200

• Tỉ lệ thể tích dung môi trên khối lượng nguyên liệu là 9/1 ở nhiệt độ

60oC trong thời gian 30 phút

Độ bền màu của sản phẩm được khảo sát ở dạng bột màu khô và trong dung dịch ở những điều kiện bảo quản khác nhau (pH, nhiệt độ, ánh sáng, thời gian) Trong

đề tài này, hoạt chất anthocyanin và màu sắc sản phẩm được nghiên cứu với ba thông

số đáp ứng là phương pháp pH vi sai, phương pháp xác định chỉ số polymer và nâu hoá

và phương pháp đo màu theo hệ CIE

Bột màu sản phẩm thể hiện khả năng kháng oxy hoá tốt với chỉ số IC50 trong phương pháp DPPH là 272.09µg/ml và 305.48µg/ml ở phương pháp MDA

Bột màu sản phẩm đạt tiêu chuẩn vi sinh và hoá lý theo quyết định số 46/2007/QĐ/BYT của Bộ y tế

ABSTRACT

In this project, investigations of extracting anthocyanin colorant from calyces of

roselle, Hibiscus Sabdariffa L using water as green solvent were carried out The

obtain results were:

1 For lab-scale process, blended calyces was extracted with water at60oC, the liquid/solid ratio of 8/1 (ml/g) for 30 mins and filtrate can be used as anthocyanin colorant powder, filtrate was condensed to dry powder by rotary evaporator in yield of 42.6%

2 For pilot-scale with Complex-01, the extract condition was similar to the lab-scale In the Complex-01 system, extracting color from blended calyces could be used in the scale-up ratio of 1:50 to 1:200 and was better than that from un-blended materials

3 Stability of the powder colorant was investigated in different storing conditions (radiation, time) and additional stabilizer or not Investigations were evaluated by three ways: total concentration of anthocyanin by pH differential method, indices for polymerized color and browning and appearance color by CIE system

4 The powder product satisfied all Vietnamese standards for food colorant with anthocyanin concentration of 2.6%

5 Antioxidant characteristics of the product is so hight when compared to Vitamin C and Trolox

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH PHỤ LỤC xii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Nội dung của đề tài 2

1.4 Yêu cầu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Nguyên liệu 3

2.1.1 Giới thiệu về hoa bụp giấm 3

2.1.1.1 Phân loại, mô tả 3

2.1.1.2 Phân bố 3

2.1.1.3 Thành phần hóa học 4

2.1.2 Hợp chất anthocyanin trong bụp giấm 5

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin 8

2.1.3.1 Cấu trúc phân tử 8

2.1.3.2 pH 9

2.1.3.3 Nhiệt độ 11

2.1.3.4 Ánh sáng 12

2.1.3.5 Oxy và hydroperoxide 12

2.1.3.6 Enzyme 13

2.1.3.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng 13

2.1.3.8 Các ion kim loại 14

2.1.3.9 Sulphur dioxide (SO 2 ) 15

2.1.3.10 Quá trình copigment hoá 16

2.2 Tác dụng sinh học của bụp giấm và hợp chất anthocyanin 16

2.2.1 Tác dụng dược lý của bụp giấm 16

2.2.2 Hoạt tính chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin 17

2.2.2.1 Quá trình oxy hoá và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hoá 17

2.2.2.2 Tính chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin 18

2.2.3 Ứng dụng của bụp giấm và hợp chất anthocyanin 18

2.2.4 Sử dụng chất màu anthocyanin trong các sản phẩm thực phẩm 20

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 22

3.1 Nội dung nghiên cứu 22

3.2 Phương pháp thực nghiệm 23

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 23

3.2.2 Xử lý nguyên liệu 23

3.2.3 Xác định hàm lượng anthocyanin theo phương pháp pH vi sai 24

3.2.3.1 Nguyên tắc 24

3.2.3.2 Hoá chất 24

3.2.3.3 Xác định hàm lượng anthocyanin 25

3.2.4 Theo dõi chất lượng màu theo phương pháp polyanthocyanin 26

3.2.4.1 Nguyên tắc 26

3.2.4.2 Hoá chất 26

3.2.4.3 Xác định sự biến đổi anthocyanin 26

3.2.5 Phương pháp đo màu theo hệ CIE 27

3.2.5.1 Nguyên tắc 27

3.2.5.2 Không gian màu 27

3.2.5.3 Xác định màu sắc của sản phẩm 30

3.2.6 Quy trình nghiên cứu 31

3.2.6.1 Hệ thống trích ly 31

3.2.6.2 Khảo sát điều kiện trích ly cao rắn anthocyanin 32

3.2.7 Khảo sát điều kiện trích ly anthocyanin ở quy mô pilot 34

3.2.8 Khảo sát độ bền màu của cao rắn anthocyanin 36

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN 38

4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 38

4.2 Xác định phổ hấp thu cực đại 38

4.3 Khảo sát điều kiện trích ly cao rắn anthocyanin 39

4.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ trích ly 39

4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 40

4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 41

4.3.4 Nhận xét 43

4.3.5 Kết luận 44

4.4 Khảo sát điều kiện trích ly trên quy mô pilot 45

4.4.1 Khảo sát tỉ lệ khai triển 45

4.4.2 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 49

4.4.3 Kết luận 52

4.5 Khảo sát độ bền của cao anthocyanin ở dạng rắn 53

4.5.1 Khảo sát độ bền của cao anthocyanin theo tổng hàm lượng anthocyanin 53

4.5.2 Khảo sát độ bền của cao anthocyanin theo chỉ số polymer và nâu hoá chất màu .56

4.5.3 Ảnh hưởng của chất ổn định lên sự thay đổi màu sắc của cao anthocyanin 59 4.5.4 Nhận xét 62

4.6 Kết luận 62

4.7 Kiểm tra chất lượng bột màu sản phẩm 64

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

5.1 Kết luận 67

5.2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 76

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Bụp giấm (Hibiscus Sabdariffa Linn.) 3

Hình 2.2: Đài bụp giấm phơi khô 4

Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của chất màu anthocyanin 7

Hình 2.4: Delphinidin và cyanidin 7

Hình 2.5: Cấu trúc của 6 anthocyanin phổ biến trong tự nhiên 8

Hình 2.6: Phổ UV-VIS của anthocyanin trong môi trường pH 1.0 và pH 4.5 10

Hình 2.7: Cấu trúc chuyển hóa của anthocynin (cyanindin-3-O-glucoside) ở môi trường pH khác nhau 11

Hình 2.8: Cơ chế oxy hoá gián tiếp anthocyanin 12

Hình 2.9: Sự chuyển hoá malvin thành malvone trong điều kiện có H2O2 13

Hình 2.10: Phản ứng ngưng tụ của cyanidin và furfural 14

Hình 2.11: Phản ứng của anthocyanin như là chất khử cực cathode trong đồ hộp thiếc .15

Hình 2.12: Ảnh hưởng của sự gia tăng nồng độ SO2 lên phổ hấp thu của malvidin -3-glucoside 15

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình nghiên cứu về anhthocyanin 22

Hình 3.2: Cấu trúc chuyển hóa giữa dạng flavylium cation (A) và hemiketal (B) R=H hay nhóm glycoside 24

Hình 3.3: Phản ứng giữa anthocyanin và bisulfite 26

Hình 3.4: Không gian màu CEI Lab và CEI LCh 28

Hình 3.5: Không gian màu CEILab 28

Hình 3.6: Không gian màu CEILCh 29

Hình 3.7: Giá để cuvet sử dụng khi đo màu trên máy so màu Minolta 30

Hình 3.8: Hệ thống trích ly anthocyanin 31

Hình 3.9: Quy trình khảo sát điều kiện trích ly cao anthocyanin 32

Hình 3.10: Sơ đồ nguyên lý hoạt động hệ thống pilot Complex-01 sử dụng cho quá trình trích ly .34

Hình 3.11: Sơ đồ nguyên lý hoạt động hệ thống pilot Complex-01 sử dụng cho quá trình cô đặc chân không 35

Hình 3.12: Hình ảnh hệ thống pilot Complex-01 tại phòng thí nghiệm Hữu cơ, khoa

KT Hóa học, ĐH Bách Khoa TPHCM 35

Hình 3.13: Hình ảnh lồng chứa nguyên liệu cho quá trình trích trong hệ thống pilot Complex-01 .36

Hình 3.14: Quy trình thí nghiệm khảo sát độ bền của anthocyanin ở dạng khô 37

Hình 4.1: Phổ hấp thu của anthocyanin từ đài hoa bụp giấm 38

Hình 4.2: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối theo tỉ lệ trích ly 39

Hình 4.3: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối theo nhiệt độ trích ly 40

Hình 4.4: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối theo thời gian trích ly 42

Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển trên pilot Complex-01 đối với hàm lượng anthocyanin trong cao rắn theo thời gian 46

Hình 4.6: Ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển trên pilot Complex-01 đối với hiệu suất thu cao rắn anthocyanin theo thời gian 46

Hình 4.7: Ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển trên pilot Complex-01 đối với hiệu suất thu cao rắn và hàm lượng anthocyanin với tỉ lệ trích 8/1 (ml/g), tại nhiệt độ 60 oC trong thời gian 30 phút 47

Hình 4.8: Hình ảnh mô tả hướng dòng chảy của dung dịch trích trong hệ thống pilot Complex-01 .48

Hình 4.9: Đài hoa bụp giấm khi được xay nhuyễn và để nguyên .50

Hình 4.10: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu trên pilot Complex-01 đối với hiệu suất thu cao rắn và hàm lượng anthocyanin với tỉ lệ khai triển 1:100, tại nhiệt độ 60 oC theo thời gian 50

Hình 4.11: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu trên pilot Complex-01 đối với hiệu suất thu cao rắn và hàm lượng anthocyanin với tỉ lệ khai triển 1:100, tại nhiệt độ 60 oC trong thời gian 30 phút .51

Hình 4.12: Độ bền của cao anthocyanin (có và không có chất ổn định), hàm lượng anthocyanin biến đổi theo thời gian .53

Hình 4.13: Độ bền của cao anthocyanin của mẫu trắng và D20 theo thời gian 54

Hình 4.14: Độ bền của cao anthocyanin sau 6, 10, 25 ngày tồn trữ không ánh sáng 55

Hình 4.15: Độ bền của cao anthocyanin (có và không có chất ổn định) theo thời gian với biến đổi chỉ số polymer và nâu hóa 56

Hình 4.16: Độ bền của cao anthocyanin của mẫu trắng và D30 theo thời gian với biến

đổi chỉ số polymer và nâu hóa 57

Hình 4.17: Độ bền của cao anthocyanin sau 6, 10, 25 ngày tồn trữ không ánh sáng với

biến đổi chỉ số polymer và nâu hóa 58

Hình 4.18: Độ bền của cao anthocyanin (có hay không có chất ổn định) theo thời gian

với biến đổi các thông số màu sắc 59

Hình 4.19: Độ bền của cao anthocyanin (có hay không có chất ổn định) theo thời gian

với biến đổi độ sai lệch màu sắc 60

Hình 4.20: Ảnh hưởng của chất ổn định lên màu sắc của cao anthocyanin tại thời điểm

ban đầu 61

Hình 4.21: Ảnh hưởng của chất ổn định lên màu sắc của cao anthocyanin sau 25 ngày

bảo quản 61

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Cấu trúc của 6 anthocyanidin phổ biến trong tự nhiên 7

Bảng 2.2: Màu sắc của 6 anthocyanin phổ biến trong tự nhiên 8

Bảng 4.1: Độ ẩm của nguyên liệu 38

Bảng 4.2: Hàm lượng anthocyanin trong cao rắn theo tỉ lệ trích ly 39

Bảng 4.3: Hàm lượng anthocyanin trong cao rắn theo nhiệt độ trích ly 40

Bảng 4.4: Hàm lượng anthocyanin trong cao rắn theo thời gian trích ly 42

Bảng 4.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển trên pilot Complex-01 45

Bảng 4.6: Phân bố kích thước nguyên liệu đài hoa bụp giấm xay nhỏ 49

Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm bột màu bụp giấm 64

Bảng 4.8: So sánh cao anthocyanin từ bụp giấm và sản phẩm anthocyanin thương mại .65

DANH SÁCH PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối theo tỉ lệ trích ly

Phụ lục 2: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối theo nhiệt độ trích ly

Phụ lục 3: Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối theo thời gian trích ly Phụ lục 4: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển 1:25 trên pilot Complex-01 Phụ lục 5: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển 1:50 trên pilot Complex-01 Phụ lục 6: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển 1:100 trên pilot Complex-01 Phụ lục 7: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển 1:150 trên pilot Complex-01 Phụ lục 8: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khai triển 1:200 trên pilot Complex-01 Phụ lục 9: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ trích ly trên pilot Complex-01

Phụ lục 10: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (đài hoa để

nguyên) trên pilot Complex-01

Phụ lục 11: Số liệu khảo sát độ bền mẫu TRẮNG sáng theo thời gian với biến đổi

tổng hàm lượng anthocyanin

Phụ lục 12: Số liệu khảo sát độ bền mẫu TRẮNG sáng theo thời gian với biến đổi chỉ

số polymer và nâu hóa

Phụ lục 13: Số liệu khảo sát độ bền mẫu TRẮNG sáng theo thời gian với biến đổi biến

đổi độ sai lệch màu sắc

Phụ lục 14: Số liệu khảo sát độ bền mẫu TRẮNG tối theo thời gian với biến đổi tổng

hàm lượng anthocyanin

Phụ lục 15: Số liệu khảo sát độ bền mẫu TRẮNG tối theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 16: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu TRẮNG tối theo thời gian với biến đổi

độ sai lệch màu sắc

Phụ lục 17: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D10 sáng theo thời gian với biến đổi tổng

hàm lượng anthocyanin

Phụ lục 18: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D10 sáng theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 19: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu D10 sáng theo thời gian với biến đổi độ

sai lệch màu sắc

Phụ lục 20: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D10 tối theo thời gian với biến đổi tổng hàm

lượng anthocyanin

Phụ lục 21: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D10 tối theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 22: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu D10 tối theo thời gian với biến đổi độ sai

lệch màu sắc

Phụ lục 23: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D20 sáng theo thời gian với biến đổi tổng

hàm lượng anthocyanin

Phụ lục 24: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D20 sáng theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 25: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu D20 sáng theo thời gian với biến đổi độ

sai lệch màu sắc

Phụ lục 26: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D20 tối theo thời gian với biến đổi tổng hàm

lượng anthocyanin

Phụ lục 27: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D20 tối theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 28: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu D20 tối theo thời gian với biến đổi độ sai

lệch màu sắc

Phụ lục 29: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D30 sáng theo thời gian với biến đổi tổng

hàm lượng anthocyanin

Phụ lục 30: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D30 sáng theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 31: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu D30 sáng theo thời gian với biến đổi độ

sai lệch màu sắc

Phụ lục 32: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D30 tối theo thời gian với biến đổi tổng hàm

lượng anthocyanin

Phụ lục 33: Số liệu khảo sát độ bền mẫu D30 tối theo thời gian với biến đổi chỉ số

polymer và nâu hóa

Phụ lục 34: Số liệu khảo sát độ bền của mẫu D30 tối theo thời gian với biến đổi độ sai

lệch màu sắc

Phụ lục 35: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của bột màu sản phẩm tại Trung

tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh

Phụ lục 36: Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn Hoá lý của bột màu sản phẩm tại Viện Pasteur Phụ lục 37: Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn Vi sinh của bột màu sản phẩm tại Viện

Pasteur

Phụ lục 38: Kết quả kiểm tra hàm lượng kim loại nặng của bột màu sản phẩm tại Viện

Công nghệ hoá học

Phụ lục 39: Bài báo “Chất màu Anthocyanin từ đài hoa bụp giấm (Hibiscus Sabdariffa

L.) trích bằng dung môi nước”

Chất màu trong thực phẩm gồm hai loại: chất màu tổng hợp và chất màu có nguồn gốc từ tự nhiên Nhiều nghiên cứu cho thấy chất màu tổng hợp có nhiều tác dụng phụ có hại cho sức khoẻ như gây ngộ độc và các biến chứng gây ung thư Vì thế, việc sử dụng các chất màu tự nhiên ngày càng được ưa chuộng hơn và đang dần thay thế cho các sản phẩm màu tổng hợp Ngoài chức năng chính là tạo màu sắc, các chất màu tự nhiên không độc hại, thậm chí có một số phản ứng tích cực đối với cơ thể

vì có chứa các thành phần có hoạt tính sinh học như vitamin, acid hữu cơ, glucoside, các nguyên tố vi lượng…có giá trị dinh dưỡng cao

Trong số các chất màu tự nhiên đang được nghiên cứu để ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm thì anthocyanin là nhóm hợp chất tạo màu quan trọng vì khả năng tạo dãy màu rộng của chúng Nguồn cung cấp anthocyanin dồi dào và có mặt phổ biến tại Việt Nam là từ đài

hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) Tuy vậy, nguồn nguyên liệu này chưa được sử

dụng một cách hiệu quả

Đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu về đối tượng chất màu anthocyanin từ đài hoa bụp giấm Tuy nhiên, các nghiên cứu theo hướng áp dụng vào quy trình công nghệ sản xuất cụ thể thì chưa được quan tâm nhiều Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ Hoá học trường Đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của TS Lê Thị Hồng Nhan, giảng viên trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, tôi xin thực hiện đề tài

-2-“KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TRÍCH LY VÀ ĐỘ BỀN MÀU ANTHOCYANIN TỪ

ĐÀI HOA BỤP GIẤM HIBISCUS SABDARIFFA L.”

Đề tài sẽ nghiên cứu và khảo sát quy trình trích ly chất màu anthocyanin từ đài hoa bụp giấm bằng dung môi xanh là nước Điều kiện trích ly thích hợp ở quy mô phòng thí nghiệm được khai triển trên thiết bị pilot cụ thể Sản phẩm chất màu sẽ được khảo sát độ bền mô phỏng theo những điều kiện tồn trữ và sử dụng sản phẩm khác nhau Những kết quả của đề tài hi vọng sẽ mang lại triển vọng trong việc ứng dụng các chất màu tự nhiên vào trong thực phẩm và nâng cao giá trị sử dụng của các nguồn nguyên liệu tại Việt Nam

1.2 Mục đích của đề tài

Xây dựng quy trình trích ly anthocyanin hoàn chỉnh từ đài hoa bụp giấm

Hibiscus Sabdariffa L với dung môi là nước, ứng dụng để sản xuất phẩm màu thực

phẩm và hạn chế tác động đến môi trường

1.3 Nội dung của đề tài

Tập trung nghiên cứu vào các nội dụng sau:

- Khảo sát quá trình trích ly cao rắn anthocyanin từ đài hoa bụp giấm bằng dung môi nước

- Khảo sát độ bền màu của cao rắn anthocyanin trong các điều kiện trong bảo quản khác nhau

Những kết quả thí nghiệm thu được sẽ được bổ sung vào các phần nghiên cứu còn lại để được một đề tài hoàn chỉnh về bột màu anthocyanin từ đài hoa bụp giấm

1.4 Yêu cầu

- Tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin

- Khảo sát và đánh giá các yếu tố làm tăng độ bền của cao rắn anthocyanin

-3-CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Giới thiệu về hoa bụp giấm

2.1.1.1 Phân loại, mô tả

Bụp giấm (tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L.) thuộc họ Bông (Malvaceae)

Tên gọi khác là cây giấm, bông bụt giấm, đay Nhật, Quế Mầu [1]

Bụp giấm là cây sống một năm, mọc thành từng bụi, cao 1-2m Thân màu lục hoặc đỏ tía, phân cành ở gốc Cành nhẵn hoặc hơi có lông Lá hình trứng, nguyên, mép

có răng, mọc so le Hoa to, mọc đơn độc ở kẽ lá, màu vàng, ở giữa màu đỏ tía sẫm và dường như không có cuống Tràng hoa màu vàng hồng hay tía, có khi trắng Quả nang, hình trứng, nhọn đầu, có lông mịn, mang đài tồn tại; hạt nhiều, màu đen Cây ra hoa từ tháng 7 đến tháng 10 Bộ phận dùng là lá, hạt, đài hoa [2, 3]

Hình 2.1: Bụp giấm (Hibiscus Sabdariffa Linn.)

2.1.1.2 Phân bố

Có thể tìm thấy trên toàn cầu có hơn 300 chủng loại bụp giấm, có cả ở hai vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới Bụp giấm có nguồn gốc ở Tây Phi Hiện được trồng tương đối phổ biến ở Ấn Độ, Malaysia, Philippin và Indonesia…Nhiều loài là cây trồng làm cảnh, làm thuốc hoặc được trồng để lấy đọt, và đài hoa dùng làm rau chua [4]

-4-Ở nước ta, từ lâu cây bụp giấm được trồng làm cảnh khá phổ biến ở nước ta Cây này trồng nhiều ở miền Trung, có đặc tính không kén đất, ưa đất đồi núi, khí hậu nóng

ẩm ở Đông Nam bộ Ở miền Bắc, cây được trồng thí điểm ở vùng Hà Tây và Bắc Thái

Từ đầu thập niên 90 đến nay, bụp giấm (giống lấy từ Đức) được Công ty Dược liệu

TW II trồng nhiều ở Bà Rịa, Đồng Nai, Sông Bé, Bình Thuận (với diện tích khoảng

400 ha) để xuất khẩu Năng xuất khoảng 400 -800kg đài khô/ha Do hoa bụp giấm mau héo nên xuất khẩu tươi không có lợi nên thị trường thế giới chỉ tập trung vào đài quả khô Đài hoa phơi khô bảo quản được lâu; sau khi ngâm nước, lại trở lại trạng thái tươi [2-4]

Hình 2.2: Đài bụp giấm phơi khô

2.1.1.3 Thành phần hóa học

• Polyphenol

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong bụp giấm Các hợp chất phenolic có trong bụp giấm chủ yếu là các anthocyanin như delphinidin-3-glucoside, delphinidin-3-sambubioside, cyanidin-3-sambubioside (một sắc tố màu đỏ dùng để nhuộm màu thức ăn và đồ uống, thay thế các loại hóa chất tổng hợp thường gây độc), cyanidin-3-glucoside Một nghiên cứu cho thấy, trong đài hoa bụp giấm khô, có khoảng 1.5g anthocyanin trên 100g khối lượng khô (quy về delphinidin-3-glucoside) Gần đây, các nhà nghiên cứu kết luận rằng delphinidin-3-sambubioside và cyanidin-3-sambubioside là hai chất màu chiếm tỉ lệ cao nhất tạo ra

-5-mà đỏ tươi cho đài hoa bụp giấm Ngoài ra, trong thành phần bụp giấm còn có các flavonoid khác như gossypetin, hibiscetin và các hợp chất glucoside của chúng; acid protocatechuic, eugenol và sterols (β-sitosterol và ergoesterol) [2, 5, 6]

• Acid hữu cơ

Các acid hữu cơ có mặt trong bụp giấm gồm acid citric, acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid hibiscic và một số acid khác

Acid hữu cơ chiếm khoảng 15-30% thành phần bụp giấm, trong đó acid citric và acid tartaric chiếm trên 75% tổng số các acid có trong bụp giấm [2, 7]

• Vitamin

Bụp giấm có chứa nhiều loại vitamin như vitamin A, vitamin B (B1 và B2), vitamin C, vitamin D,… trong đó, vitamin C chiếm hàm lượng cao nhất [8]

• Khoáng chất

Các khoáng chất vô cơ chiếm khoảng 9-10% khối lượng khô của bụp giấm, trong

đó chiếm tỉ lệ chủ yếu là kali, canxi, magie và kẽm Thành phần các khoáng chất vô cơ trong bụp giấm tuỳ thuộc vào loại đất trồng và môi trường phát triển của cây [2, 9]

2.1.2 Hợp chất anthocyanin trong bụp giấm

Trong các flavonoid, anthocyanin là nhóm đáng chú ý Anthocyanin là họ màu phổ biến nhất trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên Là nhóm sắc tố tan trong nước quan trọng nhất trong mô thực vật, anthocyanin đảm nhận những chức năng khác nhau trong cây như: tạo ra màu đỏ, xanh, tím, đen và những màu trung gian của rất nhiều rau trái và sản phẩm từ rau trái, anthocyanin trong cánh hoa có nhiệm vụ thu hút các tác nhân thụ phấn và giúp phân tán hạt giống Mặt khác, anthocyanin, như các flavonoid khác, cũng có vai trò chống oxy hóa, ngăn cản tác dụng của tia UV

màu xanh của cây Centaurea cyanus Từ anthocyanin do chữ anthos: hoa, kyanos:

xanh, về sau được dùng để chỉ các sắc tố thuộc nhóm flavanoid có màu xanh, đỏ hoặc tím Trong cây khoảng 97% các sắc tố này ở dạng glycosid (anthocyanin = anthocyanosid) có trong mô tế bào Khi đun nóng anthocyanin trong dung dịch HCl 20%, phần đường trong phân tử (thường nối vào OH ở C-3) bị cắt và cho phần aglycol được gọi là anthocyanidin Sự khác nhau giữa các anthocyanin là số và vị trí các nhóm hydroxyl, mức độ methyl hóa các nhóm này, bản chất và số nhóm đường gắn vào phân tử, vị trí gắn của chúng, bản chất và số nhóm acid mạch thẳng hay vòng gắn vào phân tử Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là: glucose, galactose, rhamnose, arabinose, di hay trisacharide tạo thành từ 4 loại đường đơn này Trong nhiều trường hợp các gốc đường bị acyl hóa bởi acid: p-coumaric, cafferic, ferulic, sinapic, p-hydroxybenzoic, oxalic, sucinic, acetic… [10, 11] Hiện nay trên thế giới đã phân lập được khỏang 540 anthocyanin, 90% trong số đó cấu tạo từ 6 anthocyanidin phổ biến sau: pelargonidin (Pg) (18%), cyanidin (Cy) (30%), delphinidin (Dp)(22%), 20% còn lại là petunidin (Pt), malvidin (Mv) và peonidin (Pn) Trong đó delphinidin và cyanidin là hai loại anthocyanidin có hàm lượng cao nhất trong hoa bụp giấm [12-14]

-7-Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của chất màu anthocyanin

Bảng 2.1:Cấu trúc của 6 anthocyanidin phổ biến trong tự nhiên [14]

-8-2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin bao gồm: cấu trúc phân tử, pH, nhiệt độ, ánh sáng, oxy, enzyme cũng như sự có mặt của acid ascorbic, các gốc đường, sulphur dioxide hoặc các muối sulfite, ion kim loại và các tác nhân copigment [6]

- methanol là 520nm (cam) đối với pelargonidin, 535nm (đỏ cam) đối với cyanidin, 545nm (đỏ xanh) đối với delphinidin Khi nhóm metoxyl thế nhóm hydroxyl thì cho kết quả ngược lại [16, 17]

Hình 2.5: Cấu trúc của 6 anthocyanin phổ biến trong tự nhiên

Bảng 2.2: λvis-max và màu sắc của 6 anthocyanin phổ biến trong tự nhiên [18]

Alycon R 1 R 2 λvis-max(nm)/ màu

-9-Sự có mặt của nhóm hyrdoxyl ở vị trí C5 và C4 làm bền hoá anthocyanin do chúng ngăn cản các phản ứng hydrate hoá dẫn đến sự tạo thành dạng không màu [19] Quá trình glycoxyl hoá cũng ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin Cùng một anthocyanidin thì các diglucoside bền nhiệt và ánh sáng hơn các monoglucoside [16]

Anthocyanin không bị acyl hóa rất dễ mất màu trong môi trường trung tính hoặc acid yếu Sự mất màu này là do C2 bị hydrate hóa Anthocyanin chứa hai hoặc nhiều nhóm acyl (ternatin, platyconin, cinerarin, gentiodenphin và zebrinin) bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong anthocyanin và các acid vòng thơm Các anthocyanin diacylate hoá được bền hoá bởi sự liên kết chặt chẽ kiểu sandwich (sắp xếp nội phân tử) nhờ tương tác giữa vòng anthocyanin và hai nhóm acyl vòng thơm [20] Các chuỗi saccharide linh động đóng vai trò như cầu nối cho phép các nhóm acyl vòng thơm gấp qua mặt phẳng vòng pyrylium Các kiểu sắp xếp này góp phần bảo vệ và tăng độ bền màu của anthocyanin [18]

2.1.3.2 pH

pH không những ảnh hưởng đáng kể đến màu sắc của anthocyanin mà còn ảnh hưởng đến tính ổn định của chúng Tùy thuộc vào pH môi trường mà anthocyanin sẽ tồn tại ở 5 dạng khác nhau: cation flavylium, carbinol base (hemiketon), chalcone, quinonoidal base và anion quinonoidal base [12]

Năm 1988, từ những kết quả nghiên cứu trên những anthocyanin đơn giản, Brouillard đã đưa ra cơ chế chuyển hóa cấu trúc của anthocyanin ở môi trườpng pH khác nhau như sau: tại pH nhỏ hơn 3, anthocyanin tồn tại ở dạng cation flavylium màu

đỏ, khi pH tăng, xảy ra sự cạnh tranh giữa hai phản ứng hydrat hóa cation flavylium và phản ứng chuyển vị proton liên quan đến các nhóm hydroxyl của phần aglycon Khi cation flavilium bị hydrate hóa cho ra dạng carbinol không màu, dạng này cân bằng với dạng chalcon vòng mở màu vàng hoặc không màu Phản ứng chuyển vị proton tạo

ra dạng quinonoidal base Khi pH tăng trên 7, phản ứng khử proton xảy ra mạnh

-10-chuyển các quinonoidal base thành dạng anion quinonoidal có màu tím đến xanh 23]

[21-Hình 2.6: Phổ UV-VIS của anthocyanin trong môi trường pH 1.0 và pH 4.5 [24]

Theo Brouillard, trong môi trường acid, anthocyanin bền hơn so với trong môi trường kiềm hay trung tính Do đó, anthocyanin thường chỉ được ứng dụng trong các sản phẩm có pH thấp [11]

-11-Hình 2.7: Cấu trúc chuyển hóa của anthocynin (cyanindin-3-O-glucoside) ở môi

trường pH khác nhau [12]

2.1.3.3 Nhiệt độ

Độ bền của anthocyanin và tốc độ phân huỷ của chúng phụ thuộc nhiều vào nhiệt

độ Số lượng và cấu trúc của các glycosyl ảnh hưởng đến tốc độ và cơ chế của sự phân huỷ nhiệt của anthocyanin Khi bị phân huỷ, các anthocyanin đều chuyển về sản phẩm trung gian dạng chalcon, sau đó tiếp tục phân huỷ thành carboxylic acid tương ứng với

-12-vòng B và carboxy-aldehyde tương ứng với -12-vòng A trong cấu trúc của anthocyanin Thí dụ, khi phân huỷ, malvin 3,5-diglucoside tạo thành syringic acid, 2,4,6-trihydroxylbenzaldehyde và phloroglucinol [25] Trong một nghiên cứu khác, sau khi được gia nhiệt đến 90oC, màu của anthocyanin chuyển dần từ đỏ sang đỏ nhạt, không màu, vàng và cuối cùng là màu nâu Nguyên nhân là do anthocyanin bị phân huỷ nhiệt đồng thời có sự tạo thành các dạng polymer có màu nâu [26]

Anthocyanin dễ dàng bị phân huỷ bởi nhiệt trong suốt quá trình chế biến và tồn trữ thực phẩm Sự tăng theo hàm số logarith của sự phân huỷ anthocyanin ứng với sự tăng đại số của nhiệt độ Thí dụ, trong quá trình chế biến dâu tại 100oC trong 1h phá huỷ 50% anthocyanin (tại 100oC, t1/2 = 1h) Trong suốt quá trình tồn trữ ở 38oC, thời gian bán huỷ của anthocyanin là 10 ngày, ở 20oC là 54 ngày, và khi làm lạnh tốt thời gian bán huỷ của anthocyanin là 11 tháng [9, 27]

2.1.3.4 Ánh sáng

Anthocyanin không bền dưới tác dụng của tia UV cũng như các nguồn sáng có khả năng ion hoá Ánh sáng làm tăng tốc độ phân huỷ nhiệt của anthocyanin bằng cách tạo ra các cation flavylium ở trạng thái kích thích Do đó, cần bảo quản trong những chai sậm màu, đặt nơi thoáng mát và tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng [25]

-13-Anthocyanin còn bị oxy hoá gián tiếp khi có mặt của acid ascorbic Trong điều kiện hiếu khí, acid ascorbic bị oxy hoá thành hydroperoxide (H2O2) là tác nhân oxy hoá anthocyanin Lượng anthocyanin bị mất lớn nhất khi có mặt đồng thời oxy và acid ascorbic (vitamin C) [25]

Hình 2.9: Sự chuyển hoá malvin thành malvone trong điều kiện có H2O2 [9, 27]

2.1.3.6 Enzyme

Các enzyme làm phân huỷ anthocyanin được gọi chung là anthocyanase Dựa trên hoạt động của enzyme, các nhà nghiên cứu nhận thấy có hai loại enzyme trong tế bào thực vật làm phân huỷ anthocyanin là glucosidase và polyphenoloxidase (PPO) Glucosidase thuỷ phân liên glucoside tạo thành các aglycone PPO tác động trên anthocyanin khi có mặt của các o-diphenol theo cơ chế oxy hoá gián tiếp theo

Anthocyanase được sử dụng để loại bớt lượng anthocyanin thừa trong các sản phẩm như mứt và thạch khi chúng tạo màu sắc không hấp dẫn Trong trường hợp cần duy trì lượng chất màu tối đa trong sản phẩm, sử dụng quá trình tẩy bằng hơi nước (steam blanching) trước khi sản xuất hoặc tăng nồng độ đường trong sản phẩm sẽ ngăn cản hoạt động của các enzyme này [25]

2.1.3.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng

Ở nồng độ trên 100ppm, đường và các sản phẩm biến tính của chúng làm tăng sự phân huỷ của anthocyanin Fructose, arabinose, galactose và sorbose có ảnh hưởng đến

sự phân huỷ của anthocyanin hơn là sucrose, glucose và maltose Sự có mặt của oxy làm tăng ảnh hưởng của các loại đường và sản phẩm biến tính của chúng trên anthocyanin [9, 25, 27]

-14-Trong quá trình chế biến và tồn trữ thực phẩm cùng với sự biến tính của các anthocyanin, các sản phẩm biến tính như furfural, 5-hydroxymethylfurfural được tạo thành từ các phân tử đường và acid trong quá trình gia nhiệt Chúng phản ứng với anthocyanin tạo thành sản phẩm có màu nâu sẫm [25]

Hình 2.10: Phản ứng ngưng tụ của cyanidin và furfural [9, 27]

2.1.3.8 Các ion kim loại

Một số ion đa hoá trị có thể tương tác với anthocyanin có nhóm hydroxyl ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu Sự mất màu của những trái cây có chứa anthocyanin bởi phản ứng với thiếc của đồ hộp được biết từ lâu trong công nghệ đồ hộp Trong phản ứng giữa thiếc với anthocyanin, anthocyanin đóng vai trò là chất khử cực cathode hoặc anode Là chất khử cực cathode chúng có thể bị khử bởi hydro mới sinh ra từ phản ứng giữa kim loại và acid Còn chất khử cực anode thường là các anthocyanin có

ít nhất hai nhóm hydroxyl ở vị trí ortho

-15-Hình 2.11: Phản ứng của anthocyanin như là chất khử cực cathode trong đồ hộp thiếc

2.1.3.9 Sulphur dioxide (SO 2 )

Ở nồng độ cho phép, SO2 được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm như một chất khử trùng và bảo quản SO2 có thể phản ứng với Anthocyanin tạo thành sản phẩm không màu Quá trình này là thuận nghịch, khi gia nhiệt hoặc thêm vào acid mạnh, SO2 được giải phóng trả lại anthocyanin và màu của sản phẩm được phục hồi Không nên sử dụng SO2 làm chất bảo quản cho các sản phẩm chứa anthocyanin dạng monomer mà nên sử dụng hỗn hợp benzoate và sorbate [28]

Hình 2.12:Ảnh hưởng của sự gia tăng nồng độ SO2 lên phổ hấp thu của

malvidin-3-glucoside

Các nhà nghiên cứu cho rằng, khả năng chống oxy hoá cao trong các sản phẩm rượu thương mại và nước ép trái cây có lên quan đến sự có mặt của các hợp chất metabisulfite, vốn thường được sử dụng trong các sản phẩm này [29]

-16-2.1.3.10 Quá trình copigment hoá

Trong dung dịch nước, anthocyanin có thể tạo phức yếu với nhiều loại hợp chất như proteins, tannins, các flavonoid khác, acid hữu cơ, acid nucleic, alkaloid, polysaccaride và các ion kim loại theo cơ chế tạo phức liên phân tử (intermolecular copigmentation) Đây là cơ chế chính tạo sự bền màu cho anthocyanin trong thực vật [25, 30]

Các tác nhân copigment giàu điện tử sẽ kết hợp với ion flavylium nghèo điện tử, ngăn cản sự kết hợp giữ nước và ion flavylium giúp ion flavylium không bị chuyển về dạng pseudobase không màu Bản thân các tác nhân thường không màu nhưng khi được thêm vào dung dịch chứa anthocyanin, chúng sẽ tạo ra hiện tượng sâu màu, làm tăng độ hấp thu và độ bền của các anthocyanin [6, 27, 30]

Một số nghiên cứu cho thấy bản chất của tác nhân copigment hoá cùng với nhiệt

độ có ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin Thí dụ, acid gallic làm bền màu của anthocyanin ở hai nhiệt độ khảo sát là 5oC và 20oC; quercetin chỉ làm tăng khả năng bền màu ở 5oC còn ở 20oC nó làm giảm khả năng bền màu; catechin làm giảm độ bền màu ở cả hai nhiệt độ trên Một nghiên cứu mới đây kết luận rằng, quá trình copigment hoá không có ảnh hưởng đến độ bền của anthocyanin ở nhiệt độ cao [6]

2.2 Tác dụng sinh học của bụp giấm và hợp chất anthocyanin

2.2.1 Tác dụng dược lý của bụp giấm

Bộ phận dùng làm thuốc của bụp giấm là hoa, thu hái vào mùa thu, lúc các lá đài còn mềm, không nhăn héo và có màu đỏ sẫm Và cũng chỉ thu hái trong vòng 15-20 ngày sau khi hoa nở vì để lâu, dược liệu sẽ kém phẩm chất

Các nghiên cứu dược học trên đài hoa, cánh hoa và hạt bụp giấm đã được tiến hành Kết quả cho thấy nhiều tác dụng tốt trên sức khoẻ như bảo vệ tim mạch; giảm nồng độ creatinine, acid uric, citrate, tartrate, canxi, natri, kali, phosphate trong nước tiểu, ngăn ngừa và làm tan sỏi thận, có tác dụng lợi tiểu, chống tăng huyết áp, ngăn cản

sự oxy hoá các lipoproteins phân tử thấp và tăng lượng mỡ trong máu [2, 4]

Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu thấy một số hợp chất trong hoa bụp giấm khi tác dụng lên gan mật giúp điều hòa được hàm lượng

-17-cholesterol trong máu, chuyển hóa chất béo giúp hạn chế nguy cơ xơ vữa động mạch gây tai biến mạch máu não, tăng huyết áp, hạn chế hiện tượng béo phì và chống lão hóa Chất hibiscin trong hoa cũng được xác định có tính kháng khuẩn

Dầu ép từ hạt bụp giấm và chất không xà phòng hoá có tác dụng kháng sinh trên

một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Coryne bacterium pyogenes, Staphylococcus aureus và có tác dụng kháng nấm trên một vài loài nấm: aspergillus, trychophyton, cryptococcus [1]

2.2.2 Hoạt tính chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin

2.2.2.1 Quá trình oxy hoá và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hoá

Theo các nghiên cứu đã được công bố, các bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa…có liên hệ rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong tế bào sống Các quá trình oxy hóa, diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do, trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình tổng hợp nucleic acid, protein, hormon Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do vi sinh vật hay virus Các gốc tự

do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như hydroxyl HO•, ion sắt (Fe2+O), Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt tính trung bình và yếu như superoxide anion O2•, peroxyl (ROO•), hydrogen peroxide H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NO•), peroxynitrite (ONOO-), alkoxyl (RO•)… Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzyme superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophil, monocyte, B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập

Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc,

do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá Các gốc tự

do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hoà của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài; oxi hóa các nucleic base làm

-18-thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư; làm hỏng cấu trúc các protein mang nhóm SH (các protein này đóng vai trò rất quan trọng như là chất mang hoặc chất hoạt hóa enzyme trong quá trình hô hấp), gây ra các bệnh nghiêm trọng về đường hô hấp…

Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng kháng oxy hóa, quét gốc tự do trong quá trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng ngăn chặn hoặc chữa bệnh [31]

2.2.2.2 Tính chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin

Các đặc tính dược lý quan trọng của anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của chúng, như mức độ glycosyl hoá và số nhóm hydroxy trong phân tử [32] Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng khả năng chống oxy hoá của hợp chất anthocyanin cao hơn nhiều lần khả năng của vitamin C và vitamin E [29, 33] Hơn nữa, anthocyanin còn có khả năng tăng cường hoạt tính của vitamin C và một số loại flavonoid khác [34] Khả năng chống oxy hoá của các hợp chất anthocyanin được giải thích bằng nhiều cơ chế như loại bỏ các gốc tự do, ngăn cản hoạt động của các enzyme sinh ra gốc tự do hoặc tạo phức với các ion kim loại là xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá [35, 36]

Một số nghiên khác cũng chỉ ra rằng, so với BHA và β-carotene, khả năng chống oxy hoá của anthocyanin cao hơn [7] Anthocyanin và một số hợp chất flavonoid khác còn có khả năng chống oxy hoá cho nhiều loại hợp chất dễ bị oxy hoá khác như linoleic và β-carotene [36]

2.2.3 Ứng dụng của bụp giấm và hợp chất anthocyanin

Ứng dụng được quan tâm nhiều là khả năng dược lý của bụp giấm và hợp chất anthocyanin như giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, ung thư, đột quỵ nhờ khả năng chống oxy hoá [37] Nhưng ngoài các tác dụng dược lý, chúng còn được quan tâm sử dụng trong các lĩnh vực khác như mỹ phẩm và thực phẩm Trong các lĩnh vực này, anthocyanin được sử dụng như là chất màu tự nhiên thay thế cho các chất màu tổng hợp khác

-19-Trong mỹ phẩm, anthocyanin từ bụp giấm được bổ sung vào các sản phẩm chăm sóc da (như kem dưỡng da, các sản phẩm trị mụn, các sản phẩm sử dụng sau khi cạo râu…), các sản phẩm chăm sóc tóc (như thuốc nhuộm tóc, dầu xả, dầu hấp tóc…) [7]

Về mặt thực phẩm, bụp giấm còn được chế biến thành nhiều loại sản phẩm rất đa dạng Ở một số quốc gia, đài hoa bụp giấm được dùng làm mứt, nước quả, nước sốt, đài hoa bụp giấm tươi được dùng làm rượu bụp giấm, nước giải khát, siro, lá và thân được sử dụng như các loại rau sống, bánh pudding nhân bụp giấm, bánh ngọt…Với đài hoa phơi khô được dùng làm trà, mứt… [23, 38]

Bụp giấm còn được trồng chủ yếu để lấy sợi Những chất sợi trong bụp giấm có thể dài đến 1.5 m, dùng để thay thế sợi đay trong sản xuất vải bao bì

Một số ứng dụng về hợp chất anthocyanin được quan tâm nhiều như giảm nguy

cơ mắc bệnh tim mạch, ung thư, chống tăng huyết áp, giúp điều hòa được hàm lượng cholesterol trong máu, chuyển hóa chất béo giúp hạn chế nguy cơ xơ vữa động mạch gây tai biến mạch máu não, đột quỵ

Saadany SS Và các cộng sựthuộc khoa Công nghệ sinh học trường ĐH Zagazig,

Ai Cập đã tiến hành thí nghiệm trên chuột, gây nhân tạo mức cholesterol cao trong máu, sau đó cho nhóm chuột sử dụng nước chiết bụp giấm Kết quả cho thấy nhóm chuột được thí nghiệm có mức cholesterol bình thường, chức năng gan thận bình thường, trong khi đó nhóm đối chứng có kết quả ngược lại Kết luận rằng anthocyanin

từ dịch chiết bụp giấm có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu, có lợi cho người

cao huyết áp [39, 40]

Ngoài ra, anthocyanin còn được quan tâm sử dụng trong các lĩnh vực khác như

mỹ phẩm và thực phẩm Điển hình như được sử dụng như là chất tạo màu tự nhiên đang dần thay thế cho các chất màu hóa học tổng hợp khác trong các sản phẩm thực phẩm Màu anthocyanin từ bụp giấm đang được ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích thực phẩm và hóa học Sản phẩm thu được có màu tím (môi trường trung tính) Khi nhúng giấy chỉ thị anthocyanin vào các môi trường acid, base, màu tím của giấy sẽ nhanh chóng chuyển sang màu đỏ hoặc màu xanh Nhờ sự đổi màu nhanh trong các môi trường trung tính, acid, base, giấy chỉ thị anthocyanin sẽ sử dụng để phát hiện nhanh pH môi trường đặc biệt là môi trường của các sản phẩm thực phẩm

-20-Mặt khác, anthocyanin từ bụp giấm còn được nghiên cứu bổ sung vào các loại

mỹ phẩm chăm sóc da, các sản phẩm chăm sóc tóc

2.2.4 Sử dụng chất màu anthocyanin trong các sản phẩm thực phẩm

Anthocyanin đã được chấp nhận làm chất màu sử dụng trong thực phẩm ở Hoa

Kỳ trong danh mục chất màu nước ép trái cây (21 CFR 73.250) hoặc chất màu nước ép rau quả (21 CFR 73.260) Tại Châu Âu, anthocyanin được xếp vào các chất màu có nguồn gốc tự nhiên [5]

Việc sử dụng chất màu tự nhiên trong thực phẩm đem lại nhiều ưu điểm hơn việc

sử dụng các chất màu tổng hợp Ngoài việc tạo màu sắc, các chất màu tự nhiên còn an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao vì có chứa các thành phần có hoạt tính sinh học như vitamin, acid hữu cơ, glucoside, các nguyên tố vi lượng… Tuy nhiên, khả năng ứng dụng của anthocyanin cũng như các chất màu tự nhiên khác vào thực phẩm bị hạn chế rất nhiều do chúng không bền trong quá trình sản xuất cũng như bảo quản dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng và oxy [41]

Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhằm sản xuất ra chất màu anthocyanin có chất lượng tốt cũng như tìm ra các phương pháp nhằm làm tăng độ bền của chúng Trong số các phương pháp sản xuất bột màu từ dịch trích ly anthocyanin, hai phương pháp sấy phun và sấy đông khô tạo ra được bột màu có độ bền cao hơn các phương pháp khác nhờ vào môi trường có độ ẩm thấp trong quá trình [42]

Phương pháp sấy đông khô là phương pháp phù hợp nhất đối với các chất màu không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, trong đó có chất màu anthocyanin Tuy nhiên, với chi phí cao hơn nhiều lần so với phương pháp sấy phun nên trong thực tế, phương pháp sấy phun thường được chọn để thực hiện quy trình sản xuất chất màu tự nhiên [43]

Sấy phun là phương pháp phun dịch trích thành các giọt nhỏ dưới tác dụng của tác nhân sấy là dòng không khí nóng [44, 45] Sản phẩm sau quá trình sấy phun có thể ở các dạng như bột, hạt vô định hình, khối kết tụ tuỳ theo điều kiện vật lý và hoá học của quá trình Các nhà nghiên cứu đã đưa ra các thông số tối ưu cho quá trình sấy phun dịch trích ly từ đài hoa bụp giấm Để đạt được sản phẩm có chất lượng tốt nhất, các

-22-CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

3.1 Nội dung nghiên cứu

Với mục đích nghiên cứu để sản xuất chất màu tự nhiên có thể ứng dụng trong thực phẩm, nội dung luận văn nằm trong nhóm đề tài nghiên cứu ứng dụng sản phẩm

bột màu từ đài hoa bụp giấm Nội dung cơ bản của đề tài được trình bày trong hình 3.1

Cao rắn

Khảo sát độ bền

Đài hoa bụp giấm

-23-Nguyên liệu đài hoa bụp giấm khô được tiến hành trích ly với dung môi là nước với mục đích là có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và hạn chế tác động đến môi trường

Giai đoạn trích ly anthocyanin là khâu quan trọng và cần được khảo sát cẩn thận

để thu được sản phẩm cao rắn với hai thông số đáp ứng là hiệu suất thu hồi cao và hàm lượng chất màu anthocyanin trong cao Sau đó sản phẩm cao rắn được khảo sát độ bền

ở các điều kiện mô phỏng quá trình tồn trữ và sử dụng khác nhau Sự biến đổi tính chất của hợp chất anthocyanin sẽ được đánh giá thông qua phương pháp pH vi sai, polyanthocyanin chỉ số polymer và nâu hoá chất màu và đo màu CIE

3.2 Phương pháp thực nghiệm

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng trong thí nghiệm là đài hoa bụp giấm khô, được trồng và thu hoạch tại Phú Yên - Việt Nam Đài hoa được xay nhỏ, bảo quản kín tránh ẩm và ánh sáng để sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu

-24-3.2.3 Xác định hàm lượng anthocyanin theo phương pháp pH vi sai

Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối được xác định theo phương pháp

pH vi sai và được tính quy theo cyanidin-3-glucoside Cyanidin-3-glucoside được chọn vì đây là dạng phổ biến của anthocyanin trong tự nhiên

3.2.3.1 Nguyên tắc

Phương pháp pH vi sai dựa vào sự chuyển đổi thành các cấu trúc khác nhau theo

pH của các sắc tố anthocyanin, và thể hiện rõ qua phổ hấp thu khác nhau tương ứng Dạng oxonium có màu tồn tại ở pH 1.0 và dạng hemiketal không màu ở pH 4.5 Phương pháp này vừa nhanh và dễ dàng định lượng được các monomer anthocyanin

Hình 3.2:Cấu trúc chuyển hóa giữa dạng flavylium cation (A) và hemiketal (B) R=H

hay nhóm glycoside [47]

3.2.3.2 Hoá chất

Dung dịch đệm pH 1.0: Hòa tan hoàn toàn 1.86g KCl vào 980ml nước cất trong

becher Đo pH bằng máy đo pH hiệu và chỉnh về pH 1.0 bằng dung dịch HCl 20% Bảo quản trong chai kín để sử dụng sau Trước khi sử dụng nên kiểm tra và chỉnh về

pH 1.0

Dung dịch đệm pH 4.5: Hòa tan hoàn toàn 54.43g CH3CO2Na.3H2O vào 960ml nước cất trong becher Đo pH bằng máy đo pH hiệu và chỉnh về pH 4.5 bằng dung dịch HCl 20% Bảo quản trong chai kín để sử dụng sau Trước khi sử dụng nên kiểm

tra và chỉnh về pH 4.5

-25-3.2.3.3 Xác định hàm lượng anthocyanin

*Xác định quang phổ hấp thu cực đại (λ vis max)

Chỉnh đường nền bằng nước cất từ bước sóng 400 đến 700 nm

Hoà tan 0.5g cao bụp giấm trong 100ml nước cất Cho dịch vừa pha vào cuvet và quét qua máy quang phổ với bước sóng từ 400 đến 700 nm (phổ hấp thu cực đại của anthocyanin nằm trong khoảng từ 500 đến 550 nm.) Bước sóng hấp thu cực đại (khoảng 520 nm) được ghi nhận là bước sóng tại đó độ hấp thu A đo được cao nhất

*Xác định độ pha loãng mẫu (DF)

Xác định độ pha loãng mẫu thích hợp bằng dung dịch đệm pH 1.0 để độ hấp thu tại bước sóng cực đại (520 nm) nằm trong khoảng tuyến tính trên đồ thị quan hệ giữa

độ hấp thu và hàm lượng anthocyanin (độ hấp thu thường có giá trị từ 0.2 đến 1.2) Pha loãng mẫu theo độ pha loãng vừa xác định được bằng dung dịch đệm pH 1.0

và dung dịch đệm pH 4.5 [24, 48]

*Xác định hàm lượng anthocyanin

Cân m g sản phẩm cao, hoà tan và định mức thành 100ml (M c)

Pha loãng dịch M c theo độ pha loãng DF xác định ở phần trên bằng dung dịch đệm pH 1.0 (M1) và dung dịch đệm pH 4.5 (M2) Ổn định mẫu trong thời gian 15

phút, rồi đo độ hấp thu của dung dịch vừa pha tại các bước sóng (λvis max) và 700nm Hàm lượng anthocyanin trong cao khô tuyệt đối được xác định theo công thức [11,39]:

10)100(

1.010

l

DF MW A

với: A: mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanin)

A = (A λvis max – A 700nm ) pH 1.0 – (A λvis max – A 700nm ) pH 4.5 (3.3)

MW = 449.2 g/mol : khối lượng phân tử của cyanidin-3-glucosdie

DF: độ pha loãng

l: bề dày cuvet (cm)

ε = 26900: Hệ số hấp thu phân tử của cyanidin-3-glucosdie (l.mol-1.cm-1)

m: khối lượng cao (g)

w: độ ẩm cao (%)