Phân lập vi khuẩn vibrio spp trên tôm và khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ đài hoa bụp giấm hibiscus sabdariffa l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Vibrio spp TRÊN TÔM VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CAO CHIẾT ĐÀI HOA BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L.) NGUYỄN PHẠM NGỌC CẨM AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Vibrio spp TRÊN TÔM VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CAO CHIẾT ĐÀI HOA BỤP GIẤM (Hibiscus sabdariffa L.) NGUYỄN PHẠM NGỌC CẨM MÃ SỐ SV: DSH173224 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TS ĐOÀN THỊ MINH NGUYỆT AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2021 Chuyên đề “Phân lập vi khuẩn Vibrio spp tôm khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết từ đài hoa Bụp Giấm (Hibiscus sabdariffa L.)” sinh viên Nguyễn Phạm Ngọc Cẩm thực hướng dẫn TS Đoàn Thị Minh Nguyệt Phản biện Phản biện TS Hồ Thị Thu Ba Ths Lý Thị Thanh Thảo Giáo viên hướng dẫn TS Đoàn Thị Minh Nguyệt i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành tri ân: Cha mẹ ln chăm sóc, quan tâm, u thương suốt quãng đường học tập động viên con, có thêm nghị lực, tâm gặp khó khăn Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ Ban Giám hiệu Trường Đại học An Giang, Ban chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp - Tài Nguyên Thiên Nhiên, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, học hỏi nhiều kinh nghiệm Đặc biệt hơn, em xin bày tỏ lịng biết ơn đến TS Đồn Thị Minh Nguyệt ln quan tâm, ủng hộ, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức vô quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài Cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - chuyên ngành vi sinh tận tình giảng dạy, giúp đỡ em năm học vừa qua để em trang bị kiến thức kinh nghiệm bổ ích với cô, thầy cán phụ trách phịng thí nghiệm nhiệt tình dẫn, giúp đỡ em suốt trình em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị khóa 17 chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học Vi Sinh với bạn bè nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ em hoàn thành đề tài Cuối cùng, xin chúc tất quý thầy cô bạn bè em dồi sức khỏe thành công đường nghiệp! Xin chân thành cảm ơn! Long Xuyên, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Phạm Ngọc Cẩm ii LỜI CAM KẾT Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu công trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học khóa luận này, chưa cơng bố cơng trình khác Long xun, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Phạm Ngọc Cẩm iii MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Những nghiên cứu nước 2.1.2 Những nghiên cứu Thế Giới 2.2 LƯỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.2.1 Cao chiết 2.2.1.1 Định nghĩa 2.2.1.2 Phân loại 2.2.1.3 Lợi ích cao chiết 2.2.2 Bụp giấm 2.2.2.1 Phân loại 2.2.2.2 Đặc điểm thực vật 2.2.2.3 Tác dụng dược lý 2.2.2.4 Số lượng loài phân bố loài 10 2.2.2.5 Thành phần hóa học 10 2.2.2.6 Những yếu tố ảnh hưởng đến điều chế cao 11 2.2.3 Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus 14 2.2.3.1 Phân loại 14 2.2.3.2 Đặc diểm 14 iv 2.2.3.3 Tác hại 15 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU 16 3.2 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 16 3.2.1 Hóa chất, mơi trường nghiên cứu 16 3.2.2 Thiết bị nghiên cứu 18 3.2.3 Dụng cụ nghiên cứu 18 3.3 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 19 3.3.1 Điều chế cao chiết 19 3.3.2 Nội dung nghiên cứu 20 3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Vibrio spp tơm thẻ chân trắng 20 3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường thạch 23 3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường lỏng 25 3.4 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Vibrio spp tôm thẻ chân trắng 29 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường thạch 31 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường lỏng 33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 KẾT LUẬN 36 5.2 KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 42 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Bảng phân loại khoa học bụp giấm Bảng 2: Thành phần môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) 16 Bảng 3: Thành phần môi trường Nutrient Agar (NA) 17 Bảng 4: Thành phần môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) 17 Bảng 5: Thành phần môi trường Kligler Iron Agar (KIA) 17 Bảng 6: Thành phần môi trường Nutrient Agar 1,5% (NA-1,5% NaCl) 18 Bảng 7: Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa vi khuẩn phân lập từ tôm 31 Bảng 8: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp 32 Bảng 9: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp sau 24 33 Bảng 10: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp sau 48 34 Bảng 11: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp sau 72 35 Bảng 12: Kết thống kê bảng ANOVA 42 Bảng 13: Kết thống kê bảng Duncan 43 Bảng 14: Kết thống kê bảng ANOVA 24 43 Bảng 15: Kết thống kê bảng Duncan 24 43 Bảng 16: Kết thống kê bảng ANOVA 48 43 Bảng 17: Kết thống kê bảng Duncan 48 44 Bảng 18: Kết thống kê bảng ANOVA 72 44 Bảng 19: Kết thống kê bảng Duncan 72 44 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cây Bụp giấm Hình 2: Đài hoa Bụp giấm Hình 3: Sơ đồ tổng quát quy trình điều chế cao chiết từ đài hoa Bụp giấm 19 Hình 4: Sơ đồ quy trình phân lập định danh sơ vi khuẩn Vibrio spp 20 Hình 5: Biểu tiêu sinh hóa 22 Hình 6: Sơ đồ quy trình khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường thạch 23 Hình 7: Sơ đồ quy trình khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường lỏng 25 Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26 Hình 9: Sơ đồ pha lỗng nồng độ 27 Hình 10: Vi khuẩn Vibrio spp mơi trường TCBS 29 Hình 11: Vi khuẩn Vibrio spp môi trường TSA-1% NaCl 29 Hình 12: Kết sinh hóa môi trường KIA 30 Hình 13: Kết thử Catalase 30 Hình 14: Kết nhuộm Gram 31 Hình 15: Kết kháng sinh đồ 33 Hình 16: Thu mẫu vi khuẩn 45 Hình 17: Kết trãi từ dịch tăng sinh (bên trái), Kết sau cấy truyền 24 (bên phải) 45 Hình 18: Máy quay chân (bên trái), Cao chiết Bụp giấm pha loãng nồng độ (bên phải) 45 Hình 19: Thử kháng sinh dịch cao chiết nồng độ trước ủ 46 Hình 20: Vi khuẩn tăng sinh sau 24 46 Hình 21: Bổ dung cao chiết nồng độ lắc máy lắc sau 24 46 Hình 22: Bổ dung cao chiết nồng độ lắc máy lắc sau 48 47 Hình 23: Đĩa trãi từ ống chứa cao chiết vi khuẩn sau 24 47 vii DANH MỤC VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide TCBS: Thiosunfate citrate bile salt sucrose NA: Nutrient agar NaCl: Natri clorua TSA: Tryptic Soy Agar KIA: Kligler Iron Agar ĐC: Đối chứng viii Hình 15: Kết kháng sinh đồ 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp mơi trường lỏng Để làm sở cho thí nghiệm, nghiên cứu tiến hành xác định đường cong tăng trưởng Vibrio spp môi trường lỏng Cũng giống đặc điểm tăng trưởng chung vi khuẩn Vibrio, tăng trưởng Vibrio spp trải qua giai đoạn pha log chuyển sang pha ổn định sau 24 nuôi cấy (Bảng 9), sau 48 nuôi cấy (Bảng 10), sau 72 nuôi cấy (Bảng 11) Mật số vi khuẩn tính theo cơng thức: N A (CFU/g hay CFU/mL) = n1Vf1 +……+ niVfi Bảng 9: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp sau 24 Nồng độ cao chiết (%) Mật số Log[CFU/mL] 8,60b 10 8,95bc 30 9,11bc 50 9,39c 80 8,96bc 100 7,77a Ghi chú: Các số liệu bảng giá trị trung bình lần lặp lại 24 giờ, cột giá trị trung bình theo mẫu tự có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95% Dựa vào kết thống kê bảng 9, rút nhận xét sau: Khả kháng khuẩn nồng độ cao chiết từ đài hoa Bụp giấm có khác biệt ý nghĩa thống kê 5% Nồng độ 100% khác biệt với nồng độ lại, mật độ thấp cho thấy cao chiết Bụp giấm có khả kháng Vibrio spp Nồng độ 33 100% có mật độ 7,77 thấp nồng độ 0% (khơng có Bụp giấm) có mật độ 8,60 từ cao chiết đài hoa Bụp giấm có khả kháng khuẩn Vibrio spp Về nồng độ 10, 30, 50, 80 sau 24 cao so với nồng độ 0% lúc cho dịch chứa vi khuẩn (đã tăng sinh) vào ống nghiệm không đồng Nồng độ 100% nguyên chất cao chiết nồng độ cịn lại pha lỗng nên thành phần dược liệu có cao chiết bị giảm Nên nồng độ cao chiết 100% có khả kháng khuẩn tốt Theo nghiên cứu Lê Hồng Thảo Nguyên (2019) cao chiết đài hoa Bụp giấm có khả kháng khuẩn tốt vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nồng độ cao nồng độ trung bình Bảng 10: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp sau 48 Nồng độ cao chiết (%) Mật số Log[CFU/mL] 9,07cd 10 8,52b 30 9,37d 50 9,46d 80 8,87bc 100 7,57a Ghi chú: Các số liệu bảng giá trị trung bình lần lặp lại 48 giờ, cột giá trị trung bình theo mẫu tự có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95% Dựa vào kết thống kê bảng 10, rút nhận xét sau: Khả kháng khuẩn nồng độ cao chiết từ đài hoa Bụp giấm có khác biệt ý nghĩa thống kê 5% Nồng độ 100% khác biệt với nồng độ lại, mật độ thấp cho thấy cao chiết Bụp giấm có khả kháng Vibrio spp Nồng độ 100% có mật độ 7,57 thấp nồng độ 0% (khơng có Bụp giấm) có mật độ 9,07 So với kết 24 thấy mật số nồng độ 100% tiếp tục giảm mật số nồng độ 0% tiếp tục tăng (do khơng có bổ sung cao chiết tiếp tục tăng sinh), nồng độ 80%, 50%, 30%, 10% giảm so với 24 mật độ cao (cao chiết nồng độ thấp có khả kháng khuẩn tốc độ không mạnh nồng độ cao) Cao chiết ở nồng độ thấp pha loãng với nước cất dược liệu có cao chiết phần nên khả kháng khuẩn không cao cao chiết có nồng độ cao (100%) Cao chiết đài hoa Bụp giấm có khả kháng khuẩn Vibrio spp 34 Bảng 11: Ảnh hưởng nồng độ cao chiết đài hoa Bụp giấm đến khả kháng vi khuẩn Vibrio spp sau 72 Nồng độ cao chiết (%) Mật số Log[CFU/mL] 9,97d 10 9,58cd 30 9,42bcd 50 9,14bc 80 8,71b 100 7,05a Ghi chú: Các số liệu bảng giá trị trung bình lần lặp lại 72 giờ, cột giá trị trung bình theo mẫu tự có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95% Dựa vào kết thống kê bảng 11, rút nhận xét sau: Khả kháng khuẩn nồng độ cao chiết từ đài hoa Bụp giấm có khác biệt ý nghĩa thống kê 5% Nồng độ 100% khác biệt với nồng độ lại, mật độ thấp cho thấy cao chiết Bụp giấm có khả kháng Vibrio spp Nồng độ 100% có mật độ 7,05 thấp nồng độ 0% (khơng có Bụp giấm) có mật độ 9,97 So với kết 24 giờ, 48 thấy mật số nồng độ 100% tiếp tục giảm mật số nồng độ 0% tiếp tục tăng Sau ngày khảo sát tất ống nghiệm có bổ sung cao chiết (100%, 80%, 50%, 30%, 10%) mật độ giảm dần theo thời gian; cao chiết 100% mật độ từ 7,77 7,05, cao chiết 80% mật độ từ 8,96 8,71, cao chiết 50% mật độ từ 9,39 9,14, riêng nồng độ 10% 30% giảm 48 72 lại tăng lại (do nồng độ thấp nên kháng thời gian ngắn không đủ mạnh để kháng khuẩn Ống không bổ sung cao chiết mật độ tăng rõ (từ 8,60 lên đến 9,97) Cao chiết từ đài hoa Bụp giấm có khả kháng khuẩn Vibrio spp Theo nghiên cứu Lê Hồng Thảo Nguyên (2019) cao chiết đài hoa Bụp giấm có khả kháng khuẩn tốt vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nồng độ cao nồng độ trung bình Từ mốc thời gian rút kết luận cao chiết đài hoa Bụp giấm có khả kháng khuẩn Vibrio spp tốt nồng độ cao (100%) trung bình (80%) 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu đề tài "Phân lập vi khuẩn Vibrio spp tôm khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.)" rút kết luận sau: - Phân lập vi khuẩn có đặc điểm hình thái (Gram âm, hình que ngắn, di động, khuẩn lạc màu xanh mơi trường TCBS), thử nghiệm sinh hóa (không sinh hơi, không sinh H2S, không lên men lactose, lên men glucose, sinh catalase) vi khuẩn Vibrio spp từ tôm thu chợ - Cao chiết từ đài hoa Bụp Giấm có khả kháng khuẩn vi khuẩn Vibrio spp đĩa thạch (vòng kháng khuẩn 2-3 mm) môi trường nuôi sinh khối lỏng (nồng độ cao chiết 100% mật độ từ 7,77 7,05, cao chiết 80% mật độ từ 8,96 8,71, cao chiết 50% mật độ từ 9,39 9,14) - So sánh với kháng sinh thị trường Streptomycin khả kháng cao chiết Bụp Giấm thấp lần Khả kháng khuẩn đạt nồng độ 80% 100%, nồng độ thấp khơng có khả kháng Vibrio spp - Nồng độ cao chiết 100% có khả kháng khuẩn cao 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu có hạn điều kiện thiết bị, hóa chất phịng thí nghiệm cịn hạn chế nên không khảo sát tất tiêu sinh hóa phần định danh sơ vi khuẩn Nhằm hồn thiện q trình nghiên cứu, có điều kiện kiến nghị cần nghiên cứu thêm số khảo sát ứng dụng: - Khảo sát khả sinh indole, sinh oxidase - Ứng dụng sản xuất thức ăn cho gia súc - Khảo sát kháng khuẩn số vi khuẩn khác: Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Clostridium botulinum, Campylobacter, Vibrio vulnificus… - Dịch vi khuẩn dùng thử kháng sinh đồ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cần sử dụng dịch tăng sinh tốt Và nên đo OD dịch vi khuẩn để mật số vi khuẩn trãi lên mơi trường mang tính đồng 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ademiluyui, J Med Food (2012) Aqueous Extracts of Roselle (Hibiscus sabdariffa Linn.) Varieties Inhibit α -Amylase and α -Glucosidase Activities In Vitro Alaa G A (2012) Antioxidant and antibacterial activities of Hibiscus sabdariffa L extracts African Journal of Food Science, (21), 506-511 Ali, B H., Al Wabel, N., & Blunden, G (2005) Phytochemical, pharmacological and toxicological aspects of Hibiscus sabdariffa L.: a review Phytotherapy Research, 19(5), 369–375 American Public Health Association (1917) Standard methods of water analysis, 3rd ed American Public Health Association, New York, N.Y American Public Health Association 1917 Standard methods of water analysis, 3rd ed American Public Health Association, Washington, D.C Azza A A., Ferial M A & Esmat A A (2011) Physico- chemical properties of natural pigments (anthocyanin) extracted from Roselle calyces (Hibiscus subdariffa) Journal of American Science, 7(7), 445- 456 Badreldin H Ali, Naser Al Wab and Gerald Blunden (2005) - Phytochemical, pharmacological and toxicological aspects of Hibiscus sabdariffa, Phytotherapy Research 19 369-375 Bauer A.W., W.M.M Kirby, J.C Sherris, M Turck, (1966) Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method, Am J Clin Pathol, 36, 493–496 Bộ y tế (2007), Dược liệu học, Tập 2, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr.163170.49 Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr.857862 Bộ y tế (2015) Hướng dẫn chuẩn đoán điều trị bệnh da liễu, Nhà xuất y học, Hà Nội Buller, B.N., 2004 Bacteria from fish and other aquatic animals, Senior Microbiologist Department of Agriculture South Perth Western Australia 394p Carl Linnaeus (1753) Hibiscus sabdariffa L., Species Plantarum: 695 (1753) Chewonarim T; Kinouchi, T; Kataoka K; ArimochiH; Kuwahara,T; vinitketkumuen, U and Ohnishi, Y (1999) Effect of roseele (Hibiscus 37 sabdariffa Linn) a Thai medicinal plant, on themutagenicity of various known mutagens inSalmonella typhimurium and formationof aberrant crypt foci induced by coloncarcinogens azoxymethane and 2-amino-1-me-Hyl 6phenylimidazo (4,5-b) pyridine in F344 rats Food Chem.Toxico l37: 591601 D Dahiru, O J Obi and H Umaru (2003) Effect of Hibiscus sabdariffa calyx extract on carbon tetrachloride induced liver damage Department of Biochemistry, School of Pure and Applied Sciences, Federal University of Technology, P.M.B 2076 Yola, Nigeria Biokemistri 15 (1): 27-33 (June 2003) Diane L McKay, Edward Saltzman, Chung-Yen Chen, and Jeffrey B Blumberg (2008) Hibiscus sabdariffa L Tea (Tisane) Lowers Blood Pressure in Prehypertensive and Mildly Hypertensive Adults Đỗ Thị Thu Thủy (2003) Nghiên cứu chất mầu đỏ Anthocyanin trích từ đài hoa Bụt giấm Tạp chí khoa học Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh Duke, J.A (1983) Roselle Handbook of Energy Crops, Purdue Universty, Unpublished Eslaminejad Parizi Touba, Maziah Zakaria (2011) Morphological characteristics and pathogenicity of fungi associated with Roselle (Hibiscus Sabdariffa) diseases in Penang, Malaysia Microbial Pathogenesis, Vol 51 No.5, November 2011, p: 325-337 Fujino, T., Okuno, Y., Nakada, D., Aoyama, A., Fukai, K., Mukai, T., Ueho, T., (1951).Report on the bacteriological examination of shirasu food poisoning Japanese Journal of Infectious Diseases 25, 11–12 Herrera-Arellano, A; Flores-Romero, S; Chávez-Soto, M A; Tortoriello, J (2004) Effectiveness and tolerability of a standardized extract from Hibiscus sabdariffa in patients with mild to moderate hypertension: a controlled and randomized clinical trial Phytomedicine; Stuttgart Vol 11, Iss 5, (Jul 2004): 375-82 Hudzicki, J Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol (2014) American Society for Microbiology MicrobeLibrary Ismail, A., Ikram, E H K., & Nazri, H S M (2008) Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) seeds-nutritional composition, protein quality and health benefits Food, 2(1), 1-16 38 Kligler, I.J., (1917) Am J Publ Health 7, 1042 Kobayashi, T., Enomoto, S., Sakazaki, R and Kuwahara, S (1963): A new selective isolation medium for pathogenic vibrios TCBS agar (Modified Nakanishi' s agar) Japan J Bacteriol., 18, 387-391 Kong, J.M.; Chia, L.S.; Goh, N.K.; Chia, T.F and Brouillard, R (2003) Analysis and biological activities of anthocyanins Phytochemistry 64: 923933 Lê Hồng Phước, Nguyễn Diễm Thư, Nguyễn Văn Sáng, Phạm Võ Ngọc Ánh, Cao Thành Trung, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Hồng Lộc, Nguyễn Thành Nhân, Phạm Thị Yến, Hứa Ngọc Phúc (2017) Nghiên cứu quy trình sử dụng kháng sinh hợp lý phịng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm ni nước lợ Việt Nam Tạp chí khoa học - Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn- V2.3 Lê Hồng Thảo Nguyên (2019) Khảo sát khả kháng vi khuẩn Escherichia coli Vibrio sp cao chiết từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) Leavitt, J M., I J Naidorf and P Shugaevsky (1955) The undetected anaerobe in endodontics: a sensitive medium for detection of both aerobes and anaerobes The NY J Dentist 25:377-382 Lương Thị Mỹ Ngân, Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Ngọc Quý, Phạm Thị Ngọc Huyền, Trương Thị Huỳnh Hoa, Trần Trung Hiếu, Phạm Thành Hổ (2016) Nghiên cứu hoạt tính kháng Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae cao chiết dâm bụt (Hibiscus róa-sinensis L.), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Mahadevan N, Shivali & Pradeep K (2009) Hibiscus sabdariffa Linn.-An overview Natural Product Radiance, 8(1), 77-83 Morton, J (1987) Roselle Fruits of Warm Climates 281-286 Morton, J (1987) Roselle P.281-286 In: Fruit of warm climate Julia F Morton, Miami, FL Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Văn Thuận, Ngô Quốc Luật (2013) Kỹ thuật trồng thuốc, nhà xuất nông nghiệp: 113-118 Nguyễn Thị Hiển, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Loan (2012) Nghiên cứu chiết tách anthocyanin từ đài hoa hibiscus sabdariffa ứng dụng để phẩm sản xuất giấy thị phát nhanh hàn the thực phẩm Tạp chí Khoa học Phát triển tập 10, số 5: 738-746 39 Nguyễn Trọng Nghĩa, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quốc Phú Phạm Anh Tuấn (2015) Phân lập xác định khả gây hoại tử gan tụy vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus phân lập từ tôm nuôi Bạc Liêu Tạp chı́ Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 39 (2015): 99-107 Oonmetta-Aree, J., Suzuki, T., Gasaluck, P and Eumkeb, G., (2006) Antimicrobial properties and action of galangal (Alpinia galanga Linn.) on Staphylococcus aureus LWT-Food Science and Technology, 39 (10): 1214-1220 Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình (2013) Kháng sinh - Đề kháng kháng sinh Kỹ thuật kháng sinh đồ Các vấn đề thường gặp Nhà xuất Y học pp 61 - 63) Prenesti, E.; Berto, S.; Daniele, P G and Toso, S (2007) Antioxidant power quantification of decoction and cold infusions of Hibiscus sabdarif a flowers Food Chemistry 100: 433-438 Rao, P U (1996) Nutrient composition and biological evaluation of mesta (Hibiscus sabdariffa) seeds Plant food for human nutrition, 49: 27-34 Salleh MN, Runnie I, Roach PD, Mohamed S, Abeywardena MY (2002) Inhibition of low-density lipoprotein oxidation and up-regulation of lowdensity lipoprotein receptor in HepG2 cells by tropical plant extracts J Agric Food Chem 50: 3693–3697 Sharaf, A (1962) The pharmacological characteristics of Hibiscus sabduriffa L Planta Medica 10, 48-62 Trần Ái Lan, TS Phan Ngọc Hòa, Phạm Lê Diệu Hiền (2015) Nghiên cứu thu nhận dịch chiết giàu anthocyanin từ đài hoa Bụp giấm ứng dụng để tạo màu cho kẹo dẻo Tạp chí khoa học tập Đại học Đồng Tháp số 17 Trần Anh Tuấn (2014) Nghiên cứu khả gây bệnh hoại tử gan tụy cấp số loài vi khuẩn vibrio tơm ni nước lợ số tỉnh phía bắc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Trần Linh Thước (2003) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước thực phẩm mĩ phẩm, nhà xuất giáo dục Việt Nam: 11(1), 131-136 Trịnh Thanh Tâm, Nguyễn Bình Kha, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Kim Pha (2012) Nghiên cứu sản xuất nước giải khát từ đài hoa Bụp Giấm Trương Thị Mỹ Hạnh, Phạm Thị Yến, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Phạm Thị Vân, Nguyễn Đình Vĩnh, Trương Thị Thành Vĩnh (2016) Hiện trạng sử dụng 40 thuốc tính kháng kháng sinh V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm Quỳnh Lưu - Nghệ An Tạp chí khoa học - cơng nghệ thủy sản Turker, H., Yıldırım, A.B and Karakaş, F.P., (2009) Sensitivity of Bacteria Isolated from Fish to Some Medicinal Plants Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 9: 181-186 Tzu-Lilin; Lin, H.H.; Chen, C.C.; Lin, M.C.; Chou, M.C and Wang, C.J (2007) Hibiscus Sabdarif a extract reduces serum cholesterol in men and women Nutrition Research 27: 140-145 Wahid A Luvonga, M S Njoroge, A Makokha, P W Ngunjiri (2010) Chemical characterisation of Hibiscus sabdariffa (roselle) calyces and evaluation of its functional potential in the food industry Pp 631-637 Wong Peng Kong (2002) Physico-chemical characteristics of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) Calyx and effect of processing and storage on the stability of anthocyanins in roselle juice Đại học Putra Malaysia Yagoub A, Mohamed B, Ahmed A, Tinay A (2004) Study on furundu, a traditional sudanese fermented roselle (Hibiscus sabdariffa L.) seed: Effect on in vitro protein digestibility, chemical composition, and functional properties of the total proteins J Agric Food Chem 52:61436150 41 PHỤ LỤC Phụ lục A: Các phương pháp phân tích A.1 Xác định vịng kháng khuẩn cao chiết (mm) Hoạt tính kháng khuẩn kiểm định đánh giá cách đo đường kính vịng ức chế vi sinh vật (ĐK) theo cơng thức: ĐK (mm) = A - a Theo y tế (2015) Trong - A: đường kính vịng kháng khuẩn đo - a: đường kính đĩa giấy kháng - ĐK: Đường kính vịng kháng khuẩn A.2 Mật số vi khuẩn tính theo cơng thức: N A (CFU/g hay CFU/mL) = n1Vf1 +……+ niVfi A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn g hay mL mẫu; N: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn; ni: Số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i; V: Thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào đĩa; fi: Độ pha loãng tương ứng Phụ lục B: Kết phân tích thống kê B.1 Kết thí nghiệm 2: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường thạch Bảng 12: Kết thống kê bảng ANOVA 42 Bảng 13: Kết thống kê bảng Duncan B.2 Kết thí nghiệm 3: Khảo sát khả kháng khuẩn từ cao chiết đài hoa Bụp giấm vi khuẩn Vibrio spp môi trường lỏng Bảng 14: Kết thống kê bảng ANOVA 24 Bảng 15: Kết thống kê bảng Duncan 24 Bảng 16: Kết thống kê bảng ANOVA 48 43 Bảng 17: Kết thống kê bảng Duncan 48 Bảng 18: Kết thống kê bảng ANOVA 72 Bảng 19: Kết thống kê bảng Duncan 72 44 Phụ lục C: Một số hình ảnh thí nghiệm Hình 16: Thu mẫu vi khuẩn Hình 17: Kết trãi từ dịch tăng sinh (bên trái), Kết sau cấy truyền 24 (bên phải) Hình 18: Máy quay chân (bên trái), Cao chiết Bụp giấm pha loãng nồng độ (bên phải) 45 Hình 19: Thử kháng sinh dịch cao chiết nồng độ trước ủ Hình 20: Vi khuẩn tăng sinh sau 24 Hình 21: Bổ dung cao chiết nồng độ lắc máy lắc sau 24 46 Hình 22: Bổ dung cao chiết nồng độ lắc máy lắc sau 48 Hình 23: Đĩa trãi từ ống chứa cao chiết vi khuẩn sau 24 47