Công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa bụp giấm (BSP) trên chuột nhắt trắng tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA BỘT SẤY PHUN
TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM (HIBISCUS SABDARIFFA L MALVACEAE)
TRÊN CHUỘT NHẮT TỔN THƯƠNG TẾ BÀO GAN CẤP TÍNH
BẰNG ETHANOL
Lê Thị Lan Phương*, Phạm Huy Kiến Tài*, Nguyễn Phương Dung*
TÓM TẮT
Mở đầu: Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) là một loài cây nhiệt đới đã được trồng ở Việt Nam
hơn 10 năm nay Bộ phận thường sử dụng là đài hoa với hàm lượng anthocyanin toàn phần khá cao đã được nghiên cứu bào chế thành dạng chế phẩm bột sấy phun, tuy nhiên, các nghiên cứu về công dụng của dạng chế phẩm này còn rất ít
Mục tiêu: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (BSP) trên chuột nhắt trắng
tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol
Phương pháp: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của BSP với liều 450 mg/kg (1/20 Dmax ) và 900 mg/kg (1/10
D max ) sử dụng trong 14 ngày trên mô hình gây tổn thương gan cấp tính bằng ethanol 40%, 5 g/kg, 3 lần, cách nhau 12 giờ Định lượng AST, ALT trong máu; MDA, GSH trong gan 4 giờ sau liều ethanol cuối và sinh thiết gan chuột
Kết quả: Liều 450 mg BSP/kg, làm giảm men gan AST 27% (p <0,01), ALT 25% (p < 0,05), MDA 30% (p
< 0,01) và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan so với nhóm gây độc Không có sự khác biệt về nồng độ GSH giữa các nhóm nghiên cứu
Kết luận: BSP thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol
Tác dụng này phụ thuộc liều sử dụng
Từ khóa: Hibiscus sabdariffa L Malvaceae, ethanol
ABSTRACT
EVALUATING THE PROTECTIVE EFFECT OF DRY POWDER OF HIBISCUS SABDARIFFA
CALYCES ON ETHANOL-INDUCED ACUTE HEPATOTOXICITY IN MICE
Le Thi Lan Phuong, Pham Huy Kien Tai, Nguyen Phuong Dung
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 1 – 2014: 75 - 79
Background and aimed: The calyce of Hibiscus sabdariffa L Malvaceae with high quantity of total
anthocyanin has been used in Vietnam since 10 years However, there is none researchs about its hepato protective
effects The present study was designed to evaluate the hepatoprotective effect of dry powder from Hibiscus’s
calyce on ethanol-induced acute hepatotoxicity in mice
Method: Studying the hepatoprotective effect of BSP at dose of 450 mg/kg (1/20 Dmax ) and 900 mg/kg (1/10 D max ) Using BSP during 14 days in acute hepatotoxicity mice by ethanol 40%, p.o., 5 g/kg x 3 times each 12 h Quantifying level AST, ALT, MDA, GSH 4 hours after the last dose of ethanol and test histopathological liver of mice
Results: The dose of 450 mg/kg BSP (1/20 Dmax ) showed significant reduction in AST level by 27% (p <
∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS.DS Lê Thị Lan Phương ĐT: 0907748591 Email: lanphuongd04@yahoo.com
Trang 20.01), ALT level by 25% (p < 0.05), MDA 30 % (p < 0.01) and also reduced microvesicular in acute hepatotoxicity mice However, no significant change in GSH level was observed
Conclusion: The results indicate that BSP exhibit the hepatoprotective effect on ethanol-induced acute
hepatotoxicity which belongs to the used dose in mice
Key words: Hepatoprotective, Hibiscus sabdariffa L Malvaceae, ethanol
MỞ ĐẦU
Trong nguồn nguyên liệu thiên nhiên vô
cùng phong phú của thế giới nói chung và
Việt Nam nói riêng, có rất nhiều động thực vật
và khoáng vật đã được dùng làm cây thuốc và
vị thuốc giúp phục vụ cho việc bảo vệ và nâng
cao sức khỏe Một trong số đó là Bụp giấm, tên
khoa học Hibiscus sabdariffa L Malvaceae, một
loài cây nhiệt đới có khả năng thích nghi với
nhiều loại đất khác nhau, đã được trồng ở Việt
Nam hơn 10 năm nay với bộ phận thường
được thu hoạch sử dụng là đài hoa Các
nghiên cứu gần đây đã cho thấy thành phần
của đài hoa Bụp giấm có chứa nhiều các hoạt
chất chống oxy hóa rất tốt như anthocyanin,
acid protocatechic, acid ascorbic cũng như các
vi chất như magie, kali(4) giúp hỗ trợ điều trị
các bệnh lý rối loạn mỡ máu, tăng huyết áp,
chống ung thư Ngoài những tác dụng trên,
Bụp giấm còn có tác dụng bảo vệ gan và đã
được chứng minh trên mô hình thực nghiệm
gây tổn thương gan bằng paracetamol và
carbon tetrachlorid (1,2) Hiện nay, loại cây này
đang được trồng ở Bình Thuận với quy mô
rộng, đạt tiêu chuẩn VietGAP và nghiên cứu
sản xuất thành công dạng bột sấy phun từ đài
hoa, đây là nguyên liệu phù hợp để sản xuất
các dạng chế phẩm trong tương lai Tuy nhiên,
dạng bột sấy phun này chỉ mới được nghiên
cứu về tác dụng hạ lipid máu ở liều 450 mg/kg
(1/20 Dmax) và 900 mg/kg (1/10 Dmax) trên chuột
nhắt tăng lipid máu nội sinh và ngoại sinh(3)
Với mong muốn góp phần nghiên cứu một chế
phẩm điều hòa lipid máu đồng thời có tác
dụng bảo vệ gan để có thể sử dụng phối hợp
điều trị hoặc làm giảm các tác dụng không
mong muốn trên gan khi sử dụng dài ngày các
thuốc tân dược điều trị rối loạn lipid máu(9),
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt tổn thương gan cấp tính bằng ethanol
PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu
Bột sấy phun (BSP) từ đài hoa Bụp giấm
(Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) do Trung tâm
nghiên cứu và sản xuất dược liệu Miền trung cung cấp, chứa 0,215% anthocyanin toàn phần,
độ ẩm < 5%, có màu đỏ nâu, đạt yêu cầu về độ mịn, độ nhiễm khuẩn, kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật
Phương tiện
Ethanol dược dụng (99,5%) Thuốc đối chiếu: Silymarin 10g – Sigma
Thiết bị xét nghiệm: Máy sinh hóa tự động Biolis 24i
Súc vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng phái đực, trưởng thành (5 –
6 tuần tuổi), chủng Swiss abino, nặng 18 – 22 g
được cung cấp bởi viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh Chuột được nuôi ở nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối, mỗi lồng 6 – 8 chuột, sử dụng thức ăn là cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp, carbohydrat và vitamin trong suốt thử nghiệm
Phương pháp nghiên cứu (7)
Chuột thử nghiệm nuôi ổn định trước 1 tuần, chia chuột làm 5 nhóm (n = 7) Hai tuần trước khi gây mô hình, nhóm chứng và nhóm gây độc được cho uống nước cất, nhóm đối chiếu uống silymarin 50 mg/kg, nhóm thử 1 uống BSP liều
450 mg/kg (1/20 Dmax), nhóm thử 2 uống BSP liều
900 mg/kg (1/10 Dmax) với thể tích 10 ml/kg vào 8
Trang 3– 9 giờ sáng Ở ngày thứ 15, tất cả các lô, trừ lô
chứng, uống ethanol 40% liều 5 g/kg x 3 lần mỗi
12h (7h sáng, 7h tối, 7h sáng)
4 giờ sau khi gây độc bằng ethanol, chuột
được gây mê bằng đá CO2, tiến hành giải phẫu
lấy máu tim và gan, thực hiện các xét nghiệm xác
định AST, ALT, MDA và GSH Tách lọc gan để
khảo sát hình thái mô học
Phương pháp xác định hàm lượng các
aminotransferase (AST và ALT)
Chuột sau khi bị gây mê sẽ được lấy máu
toàn phần từ tim và đựng trong ống có chứa chất
chống đông heparin, ly tâm lấy huyết thanh
định lượng AST, ALT
Phương pháp xác định hàm lượng
malondialdehyde (MDA) và glutathione
(GSH)
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong
dung dịch đệm KCl 1,15% theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt
độ 0 -5oC Lấy 2 ml dịch đồng thể thêm vào 1 ml
dung dịch đệm Tris - HCl, ủ ở 37oC trong 1 giờ
Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic
10%, ly tâm 10000 vòng/phút, và lấy dịch trong
Tiến hành định lượng hàm lượng MDA và GSH
trong gan chuột như sau:
Xác định hàm lượng MDA (6)
Lấy 2 ml dung dịch trong cho phản ứng với 1
ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 15 phút
và đo quang ở bước sóng λ = 532 nm Hàm
lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương
trình hồi quy chất chuẩn MDA
y = 0,0637x – 0,0029 (R2 = 0,9981) CnMMDA/ml
Hàm lượng MDA (nM/g protid): C =
CnMMDA/ml dịch đồng thể x 1000 / Cprotid
Với Cprotid = 36,629 (mg protid / ml dịch đồng thể )
Hàm lượng MDA trong các mẫu thử
(nM/ml): C thử = (ODthử / ODchuẩn) x Cchuẩn
Trong đó: OD là mật độ đo quang; C là Hàm
lượng MDA (nM/ml)
Hoạt tính chống oxy hoá (HTCO): HTCO (%)
= ((CMDA chứng - CMDA thử) / CMDA chứng ) / 100
Xác định hàm lượng GSH (5)
Lấy 1ml dịch trong cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA phosphate vừa đủ 3
ml Để 3 phút ở nhiệt độ phòng sau đó tiến hành
đo quang ở bước sóng λ = 412 nm Hàm lượng GSH (nM/g protid) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH
y = 0,0022x – 0,0334 (R2 = 0,998) → CnMMDA/
Hàm lượng GSH (nM/g protid): C =
Với Cprotid = 36,629 (mg protid / ml dịch đồng thể )
Giải phẫu bệnh
Sau khi lấy máu, chuột được mổ, tách gan và thận chuột, cố định trong dung dịch formol 10% Sau đó mẫu mô được xử lý bằng các phương pháp thường quy và đúc tiêu bản trong paraffin
và cắt thành lát dày 4 μm để nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) để quan sát trên kính hiển vi ở vật kính hiển vi, độ phóng đại40
và 100 lần(8)
Phương pháp thống kê – xử lý dữ liệu
Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình
± sai số chuẩn (M ± SD) Phân tích số liệu bằng phép kiểm t-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Minitab 15.0
KẾT QUẢ Tác dụng của BSP trên chuột nhắt gây tổn thương gan cấp tính bằng ethanol
Ở lô gây độc bằng ethanol, các chỉ số AST, ALT tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,001), MDA tăng (p < 0,05) so với nhóm chứng, đồng thời kết quả sinh thiết gan cho thấy có sự tổn thương gan, hoại tử ở mức độ nhẹ và có biểu hiện của phản ứng viêm trong tế bào Nhóm uống silymarin có giá trị AST giảm (p < 0,05), ALT và MDA giảm (p < 0,01) và mức độ viêm tại tế bào gan cũng giảm so với nhóm gây độc Nhóm
Trang 4uống BSP với liều 450 mg/kg có giá trị AST giảm
(p < 0,01), ALT giảm (p < 0,05) và MDA giảm (p <
0,01) so với nhóm gây độc Nhóm uống BSP liều
900 mg/kg có biểu hiện giảm AST, ALT và MDA
so với nhóm gây độc nhưng chưa đạt ý nghĩa
thống kê Sinh thiết gan cho thấy mức độ giảm tổn thương gan ở nhóm uống BSP 450 mg/kg Giá trị GSH không có sự khác biệt giữa các nhóm thử nghiệm
Bảng 1 Kết quả định lượng AST, ALT, MDA và GSH của các nhóm thử nghiệm
P * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 so với nhóm chứng; P # < 0,05, ## < 0,01 so với nhóm gây độc
Bảng 2 Kết quả vi phẫu gan của các nhóm thử nghiệm (mức độ tăng của các nhóm so với nhóm chứng uống
nước cất)
hoại tử
Xâm nhập TB viêm đơn nhân
Xâm nhập TB viêm đa nhân
Viêm khoảng cửa
Tăng sinh tái tạo TB gan
Độc
Tăng 2% loại không bào nhỏ rải rác
trong tiểu thùy, 2% loại không bào
lớn trong tiểu thùy và quanh TMTT
tiểu thùy
Kết quả được đọc bởi Khoa Giải Phẫu Bệnh – Bệnh viện Chợ Rẫy TP.Hồ Chí Minh
Hình 1 Giá trị men gan AST, ALTcủa các nhóm thử nghiệm P: * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 so với nhóm chứng, # < 0,05, ## < 0,01 so với nhóm gây độc
Hình 2 Giá trị MDA, GSH của các nhóm thử nghiệm P: * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 so với nhóm chứng, #
< 0,05, ## < 0,01 so với nhóm gây độc
Trang 5KẾT LUẬN
Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm đã thể hiện
tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt gây tổn
thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol 40%, 5 g
x 3 lần Liều 450 mg/kg bột sấy phun làm giảm
men gan AST 27%, ALT 25%, MDA 30% và làm
giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan
Những nghiên cứu trước đây được thực hiện
trên những giống chuột khác nhau đã cho thấy
tác dụng bảo vệ gan của đài hoa Bụp giấm trên
mô hình gây độc gan bằng acetaminophen, bằng
CCl4 qua việc đánh giá các chỉ tiêu AST, ALT,
MDA, GSH, sinh thiết gan, Tuy nhiên, chưa có
nghiên cứu được công bố về tác dụng của Bụp
giấm trên mô hình gây độc cấp tính bằng
ethanol
Nhóm tác giả xin cảm ơn Sở khoa học và
Công nghệ TP Hồ Chí Minh đã tài trợ kinh phí
thông qua Chương trình Vườn ươm sáng tạo
khoa học và công nghệ trẻ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ali BH, Mousa HM, El-Mougy S (2003) "The effect of a water
extract and anthocyanins of Hibiscus sabdariffa L on
paracetamol-induced hepatoxicity in rats" Phytother Res, 17(1),
pp 56 - 59
2 Dahiru D, Obi OJ, Umaru H (2003) "Hibiscus sabdariffa extract
enhances the recovery from hepatic damage induced by carbon
tetrachloride" Biokemistri, 15(1), pp 27 - 33
3 Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2013) "Đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp
giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) trên chuột nhắt" Tạp chí
Y học, 17 (Phụ bản của số 1), tr 369 - 373
4 Mahadevan N, et al (2009) "Hibiscus sabdariffa Linn.–An
overview" Natural Product Radiance, 8(1), pp.77 - 83
5 Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Trần Mỹ Tiên, Trần Công Luận, Phạm Khánh Biền (2008)."Nghiên cứu tác dụng dược lý thực nghiệm của chế phẩm “Kỷ thược địa hoàng gia vị”
theo hướng tăng cường thể trạng và chức năng gan" Tạp chí Y
học Tp Hồ Chí Minh, 12 (phụ bản của số 4), tr 152 - 158
6 Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2010)
"Nghiên cứu chống oxy hoá theo hướng bảo vệ gan của nấm
linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)" Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh,
14 (phụ bản số 2), tr 129 - 134
7 Song Z, Deaciuc I, Song M, Lee DY, Liu Y, Ji X, et al (2006)
Hepatotoxicity in Mice" Alcohol Clin Exp Res, 30(3), pp 407 - 413
8 Tuñón MJ, Alvarez M, Culebras JM, González-Gallego J (2009)
"An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure"
World J Gastroenterol, 15 (25), pp 3086 - 3098
9 Trần Thị Thu Hằng (2009) Dược lực học, Nhà xuất bản Phương
Đông, tr 569 - 583
10 Võ Văn Chi (2012) Từ điển cây thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Y
Học Hà Nội, tập 1, tr 265 – 266
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/10/2013,
17/10/2013