ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang ( fish) nhằm xác định nhanh một số loại tảo độc hại biển việt nam

Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong phân loại các loài vi tảo độc hại biển, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang FI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lưu Xuân Hòa

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI

BIỂN VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lưu Xuân Hòa

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI

BIỂN VIỆT NAM

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2

1.1 Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 2

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH 2

1.1.2 Trình tự đích và đầu dò trong phép lai huỳnh quang tại chỗ 6

1.1.3 Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang 9

1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo biển độc hại 13

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam 17

1.3 Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH 18

1.4 Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu 19

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp thu và lưu giữ mẫu 21

2.3 Phương pháp phân loại hình thái 23

2.4 Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN và thiết kế đầu dò 23

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn 23

2.4.2 Phương pháp Singel cell PCR 23

2.4.3 Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN 24

2.4.4 Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu 25

2.5 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ 25

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái 27

3.1.1 Loài Alexandrium affine 27

3.1.2 Loài A pseudogonyaulax 28

3.2 Ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu 29

3.3 Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu 31

3.4 Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ 35

3.5 Tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò 37

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Nội dung tiếng Anh Nội dung tiếng Việt

1 ADN Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic

2 ARN Ribonucleic acid Axít ribonucleic

4 FISH Fluorescent in situ hybridization Phép lai huỳnh quang tại chỗ

5 FITC Fluorescein isothiocyanate Chất phát tín hiệu huỳnh quang

7 ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm phiên mã

9 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

10 PSP Paralytic shellfish poisoning Chất độc gây liệt cơ

11 rADN Ribosomal deoxyribonucleic

acid

Trình tự ADN mã hóa ribosome

12 rARN Ribosomal ribonucleic acid ARN ribosome

Bảng 1.2: Trình tự đầu dò cho một số loài Alexandrium 16

Bảng 3.1: Một số điều kiện thích hợp cho nhân nuôi sinh khối tảo A

affine và A pseudogonyaulax trong phòng thí nghiệm

31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dò 12

Hình 1.2 Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH 19

Hình 2.1 Sơ đồ phản ứng PCR nhân vùng D1-D2 của rADN 23

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái của A affine 27

Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái của A pseudogonyaulax 28

Hình 3.3 Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A affine 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A

pseudogonyaulax

30

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 32

Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại của một số loài thuộc chi Alexandrium 34

Hình 3.7 So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A affine với các loài

Alexandrium

36

Hình 3.8 So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A pseudogonyaulax

với các loài Alexandrium

37

Hình 3.9 Tế bào A affine dưới ánh sáng thường (trái) và phát huỳnh

quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C

38

Hình 3.10 Tế bào A pseudogonyaulax dưới ánh sáng thường (trái) và

phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C

38

Hình 3.11 Lai đầu dò A affine với mẫu tự nhiên 40

Hình 3.12 Lai đầu dò A pseudogonyaulax với mẫu tự nhiên 40

MỞ ĐẦU

Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc hại nói riêng, nhiều nhóm loài sinh vật rất khó hoặc hoàn toàn không thể phân loại đến loài nếu chỉ bằng phương pháp so sánh hình thái Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái bên ngoài và khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất

dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu phân loại Cùng với số lượng loài rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian Những điều này đã gây cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm loài nói riêng

Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền

tảng của kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) đã được phát triển Kể từ khi ra

đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà cả trong các nghiên cứu về sinh thái học, môi trường, trong chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh loài Kỹ thuật FISH ra đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật Các trở ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời gian phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc loài… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật FISH Bên cạnh đó, bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định tính mà còn có thể định lượng chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân

bố hay mối tương quan với môi trường của các vi sinh vật Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du trong môi trường biển nói chung

và các loài tảo độc hại nói riêng

Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong

phân loại các loài vi tảo độc hại biển, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật

phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam” Kết quả mong đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá,

quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại, cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng và hiệu quả hơn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH

Kỹ thuật FISH được ra đời vào những năm 1980 Tuy nhiên, trước đó, khi nghiên cứu tế bào, các nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp nhuộm mô đơn giản Trong đó, các chất màu nhuộm tự nhiên hoặc tổng hợp đã được sử dụng để nhuộm các cấu trúc hoặc các chất tích lũy trong tế bào Nhưng, một nhược điểm lớn

là các chất này thường không đặc hiệu do chúng có những ái lực với những đặc tính chung của các phần tử protein, axit nucleic, các lipit, cacbonhydrate Chính điều này

đã cản trở cho các nghiên cứu chuyên sâu Sau đó, các thuốc nhuộm đặc hiệu hơn đối với các thành phần của tế bào hay các phức hợp phân tử lớn như hemosiderin, amyloid, elastin đã được tìm thấy, phát triển và áp dụng trong việc nhuộm đặc hiệu một số thành phần cấu trúc ở cấp độ phân tử và dưới tế bào Dù đã có nhiều cải thiện về tính đặc hiệu, nhưng các chất nhuộm này cũng không được áp dụng phổ biến cho tất cả các đại phân tử sinh học được quan tâm Khả năng phát hiện sự giống và khác nhau của các đại phân tử đặc biệt ban đầu được dựa trên các phản ứng kháng nguyên kháng thể Vào những năm 1940, việc liên kết các kháng thể với fluorochome nhưng không làm mất đi sự đặc hiệu liên kết thụ thể của chúng đã được phát hiện Trên cơ sở này, kỹ thuật sử dụng tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc kháng thể nhằm phát hiện các phân tử axit nucleic lai đã được Rudkin và Stollar phát triển năm 1977 [58] Tuy vậy, trước đó, kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hybridization), tiền thân của kỹ thuật FISH, đã ra đời bởi nhóm các nhà khoa học Pardue, Gall và John [54] Trong phương pháp này, các thử nghiệm đã được tiến hành với việc nhận biết được các trình tự ADN đích có trong noãn bào của chủng vi khuẩn Xenopus bằng các đoạn đầu dò có bản chất là ADN hoặc ARN-28S đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ Sau đó chúng được ghi nhận bằng kỹ thuật phóng

xạ tự ghi Kỹ thuật ISH này đã giúp các nhà khoa học có thể đưa các đoạn ngắn

bào hay tính toàn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào Trên cơ sở đó, một số cải tiến kỹ thuật đã tiếp nối như việc ứng dụng các chất chỉ thị (reporter) dựa trên cơ sở các enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dò bằng vàng quan sát bằng kính hiển vi điện tử [55] Sau khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung thư bạch cầu và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài

Tuy nhiên, một số nhược điểm dễ nhận thấy của phương pháp ISH cũng đã bộc lộ Đầu tiên, rất nhiều vật liệu phóng xạ tự nhiên sử dụng cho đầu dò là kém bền Do các đồng vị phân rã theo thời gian nên hoạt động của đầu dò dễ bị thay đổi Thứ hai, mặc dù thông thường độ nhạy của phóng xạ tự ghi là cao nhưng mức độ phân giải lại bị hạn chế Thứ ba, để tạo ra tín hiệu có thể đo được trên film chụp X quang thì mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài Điều này làm chậm tiến trình thí nghiệm, phân tích kết quả, gia tăng nguy cơ phơi nhiễm với người sử dụng Ngoài ra, vì kỹ thuật này đòi hỏi sử dụng nguyên liệu là các đồng vị phóng xạ nên các đầu dò phóng xạ có giá thành cao; mặt khác đòi hỏi chúng phải được vận chuyển, thao tác, lưu trữ và loại bỏ theo những quy trình rất nghiêm ngặt, phức tạp

Vì những lý do đó, dù có nhiều ưu điểm nổi trội nhưng những hạn chế cơ bản trên

đã yêu cầu các nhà nghiên cứu cần phải tìm ra một biện pháp hiệu quả hơn Có lẽ vì vậy mà kỹ thuật ISH (với các đầu dò mang đồng vị phóng xạ) sau đó đã nhanh chóng được thay thế bởi một kỹ thuật mới có nhiều ưu điểm hơn mang tên kỹ thuật lai tại chỗ sử dụng các đầu dò axit nucleic có gắn tín hiệu huỳnh quang

(Fluorescence in situ hybridization - FISH) Với kỹ thuật FISH, các trở ngại về thời

gian thí nghiệm, độ phân giải và tính an toàn được giải quyết khá triệt để, mở đường cho sự phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu, phân tích định lượng và cho những hình ảnh tế bào sống động

Những nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng tín hiệu huỳnh quang đầu tiên trong phương pháp lai tại chỗ bắt đầu từ những năm 1980 Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học đã tiến hành gắn phân tử ARN trực tiếp với tín hiệu huỳnh quang ở đầu 3’

và thử nghiệm dùng nó là một đầu dò cho trình tự ADN đặc hiệu Kết quả cho thấy

rằng so với các đầu dò phóng xạ, đầu dò huỳnh quang sử dụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con người, đồng thời kết quả thu được cũng chính xác hơn [18] Ở những nghiên cứu khác, các đầu dò gắn biotin và các tín hiệu streptavidin kết hợp huỳnh quang đã được dùng cho việc phát hiện các trình tự ADN đích đặc trưng trên nhiễm sắc thể [46] và các trình tự trên mARN [60] Năm

1989, DeLong cũng đã tiến hành thử nghiệm sử dụng các đầu dò oligonucleotit (17

- 34 nucleotit) được đánh dấu huỳnh quang để dò tìm các vi khuẩn E.coli dựa vào

trình tự đích là đoạn ARN 16s [24] Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng nhiều đầu dò khác nhau cho phép xác định được các loại tế bào khác nhau trong cùng một nhóm và thậm chí với việc phân tích cường độ huỳnh quang cũng cho thấy được giai đoạn và tốc độ phát triển của các tế bào vi sinh vật [19, 24]

Với khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật FISH, ngày càng nhiều nghiên cứu được tiến hành trên các lĩnh vực khoa học Sự phát triển ngày càng cao của nhiều kỹ thuật phân tích đã cho thấy rằng số lượng loài có trong tự nhiên, nhất là đối với nhóm vi khuẩn, có con số vượt xa so với số lượng các loài đã được phát hiện và mô tả trước đó Do đó, sự đa dạng thành phần loài vi sinh vật trong thời gian trước đây đã từng bị đánh giá thấp Các phương pháp cổ điển trước đây hầu như không thể mô tả được chính xác và đầy đủ rất nhiều loài vi sinh vật Rất nhiều loài sau này được phát hiện mới bằng các phương pháp hiện đại và chính xác hơn, như phương pháp FISH FISH có khả năng đưa ra những hình ảnh chi tiết của môi trường vi sinh mà không cần phải qua những bước làm sạch hay khuếch đại Chính

vì vậy mà nó đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau về môi trường Phương pháp này hiện nay được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu

về sự đa dạng sinh học của các quần thể vi sinh vật ở nhiều điều kiện địa lý khác nhau trong tự nhiên, Llobet (1998) đã sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ như một công cụ để các nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong trầm tích biển Kết quả cho thấy, gần 45% số tế bào vi khuẩn có trong đó thuộc nhóm ngành đã biết với nhóm Cytophaga-Flavobacterium có trong hầu hết các lớp trầm tích [45] Hay các nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn bằng kỹ thuật FISH trong đại dương [31], trong

các tầng nước khác nhau tại vịnh Mariager Fjord, Đan Mạch [53], những nghiên cứu hệ vi khuẩn ở trong sông [42], trong thủy vực trên núi cao có băng bao phủ

quanh năm [11], hay các nghiên cứu về Bacillus trong đất [26]…

Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng rộng rãi trong y học Gersdorf (1993) đã tiến hành nghiên cứu hỗn hợp vi khuẩn phổ biến trong khoang miệng người bằng phương pháp FISH qua đó đã tìm thấy có hơn 300 loài vi khuẩn khác nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa từng được nuôi cấy Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này Trong khi một số kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt chỉ thu được rất ít thành phần loài trong sự đa dạng nhóm vi sinh vật này Những lợi ích khi sử dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện rõ trên những vi

khuẩn kị khí gram âm, như Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và

Prevotella intermedia có trong thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng

[28, 29] Cũng thông qua kỹ thuật FISH, các phân tích sâu hơn đã cho thấy một số lượng lớn và đa dạng về hình thái của các loại xoắn khuẩn trên các vết bẩn của mảng bám răng có trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng của bệnh viêm răng [21, 52] Trong một thử nghiệm lâm sàng với các mẫu đờm và mẫu gạc họng, một tập hợp các đầu dò oligonucleotit được thiết kế để

dò tìm đặc hiệu đối với các mầm bệnh phân lập từ tế bào xơ gan của bệnh nhân được tiến hành Kết quả cho thấy, các đầu dò đã phát hiện nhanh chóng và chính

xác các vi khuẩn gây cấp tính ở bệnh nhân xơ nang, bao gồm Pseudomonas

aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus và Candida albicans So với các kỹ thuật nuôi cấy thông

thường, FISH chứng tỏ là công cụ chính xác và hiệu quả [33, 34] Ở một nghiên cứu

y học khác, khả năng ứng dụng của FISH để định danh các vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu máu nhiễm bệnh đã được khảo sát Các đầu dò oligonucleotit sử dụng đặc hiệu cho từng mầm bệnh điển hình đã cho thấy hiệu quả khi chúng dò tìm thấy các nhóm gây bệnh bao gồm Staphylococci, Streptococci, Enterococci,

Enterobacteriaceae và nấm trên các bệnh nhân nhiễm bệnh Các nhà nghiên cứu kết luận rằng phương pháp FISH có độ nhạy và đặc hiệu tuyệt vời và kết quả thu được chỉ trong 25 phút cho tới 2,5 giờ Trong khi đó, việc định danh các loài bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống thường mất từ 24 đến 72 giờ mới hoàn thành

Sự phát hiện nhanh chóng các nguyên nhân mầm bệnh trong máu bằng phương pháp FISH cho phép các bác sỹ dễ dàng đưa ra được các phương pháp trị liệu thích hợp và do đó có thể hoàn thiện việc chẩn đoán cho các bệnh nhân bị nhiễm trùng máu [37, 41]

Cho đến nay, với các ưu thế về độ nhạy, tiết kiệm thời gian, đơn giản… kỹ thuật FISH đã và đang là một công cụ hữu dụng trong những ứng dụng về nghiên cứu sinh thái, đa dạng sinh học, y học, di truyền học và nhiều lĩnh vực khác

1.1.2 Trình tự đích và đầu dò trong phép lai huỳnh quang tại chỗ

Bản chất của kỹ thuật FISH là sự lai chính xác một đoạn oligonucleotit có gắn tín hiệu huỳnh quang (đầu dò) với một trình tự ADN đích đặc trưng Với nhiều mục đích khác nhau mà người ta có thể sử dụng kỹ thuật FISH nhằm dò tìm hay phát hiện các trình tự ADN hay ARN đích thuộc các phần khác nhau của hệ gen quan tâm Các trình tự này có thể là một trình tự đặc trưng nằm trên nhiễm sắc thể

mã hóa cho một chức năng gen nào đó cần quan tâm Với các đầu dò đặc hiệu cho từng locut gen, chúng được tạo ra từ một phần của gen Do vậy, khi lai, chúng sẽ kết hợp bổ sung với phần đặc hiệu đó của gen trên nhiễm sắc thể Từ đó người ta có thể xác định được chính xác vị trí trên nhiễm sắc thể mà gen đó tồn tại Đối với các trình tự đích là những đoạn lặp vùng tâm động hay vùng Alphoid, đầu dò được thiết

kế sẽ cho phép chúng ta tìm thấy vùng tương ứng bổ sung tại tâm động của các nhiễm sắc thể Trong nhiều trường hợp, các nhiễm sắc thể được đánh dấu bởi các màu huỳnh quang khác nhau của đầu dò Từ đó người ta có thể xác định được cá thể

có mang đúng số lượng các nhiễm sắc thể hay không Đối với phép lai toàn bộ nhiễm sắc thể, tập hợp những đầu dò nhỏ được sử dụng để lai cho từng đoạn ngắn trình tự đích dọc trên nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể phát quang với các màu sắc

khác nhau của đầu dò giúp người ta có thể phân biệt được dễ dàng các nhiễm sắc thể khác nhau thay vì phải căn cứ vào các vạch sáng tối trên nhiễm sắc thể theo các phương pháp truyền thống Mặt khác, chúng cũng giúp cho việc nhận biết dễ dàng những bất thường trong cấu trúc của nhiễm sắc thể

Trong một nghiên cứu của mình về bệnh bạch cầu (ABL), Michael đã tiến hành thử nghiệm hệ thống tổ hợp các đầu dò oligonucleotit (COMBO) thông qua kỹ thuật FISH nhằm nhận diện vùng ABL (gây bệnh bạch cầu) thuộc nhiễm sắc thể số

9 của người Kết quả cho thấy hệ thống COMBO hoạt động rất hiệu quả và có thể coi đây như một cách tiếp cận mới trong việc gắn nhãn đặc hiệu tại những vị trí cần quan tâm của hệ gen người [48] Các kết quả nghiên cứu thử nghiệm khác cũng chỉ

ra rằng để quá trình lai bổ sung được hiệu quả thì thông thường các trình tự này phải

ở giai đoạn chuẩn bị của nhiễm sắc thể trong nguyên phân hoặc trong giai đoạn gian

dò huỳnh quang trong phép lai tại chỗ nhằm định lượng nhóm vi khuẩn

Bifidobacterium spp cộng sinh trong đường tiêu hóa của người [44] Với mỗi mục

tiêu nghiên cứu, các vùng khác nhau của các tiểu phần ribosome ngày càng được khai thác và sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng kỹ thuật FISH khác nhau [18, 27,

36, 68] Trong nhiều nghiên cứu về phân loại, các trình tự đích được sử dụng phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều

Nhiều kết quả khác cũng đã cho thấy, việc sử dụng thành phần đích là phân

tử mARN đặc hiệu cũng có thể giúp ích trong nhiều nghiên cứu có liên quan vì mARN là một mắt xích quan trọng trong chuỗi hoạt động sinh hóa và di truyền của

tế bào và của cơ thể [18, 25, 65]

Cùng với việc khai thác có hiệu quả và đa dạng các trình tự đích, các loại đầu

dò phục vụ trong kỹ thuật FISH cũng được nghiên cứu chế tạo và cải tiến tùy theo từng mục tiêu Một số nghiên cứu đã sử dụng các đầu dò là các đoạn polynucleotit Đây là những đoạn polynucleotit có kích thước lớn từ 200 – 300 nucleotit Trong một số nghiên cứu, người ta đã sử dụng chúng cho việc dò tìm các trình tự đích là vùng siêu biến III thuộc 23s ARN ribosome của các vi khuẩn Những đầu dò

polynucleotit này đã thể hiện tính hữu dụng trong việc phát hiện Pseudomonas

putida, Acinetobacter spp [64] và nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ phù du trong

nước biển [25] Trong một nghiên cứu khác, bảy đầu dò polynucleotit đã xây dựng,

thiết kế nhằm nhận biết các loài Acinetobacte baumannii, A calcoaceticus, A

haemolyticus, A junii, A radioresistens, A lwoffii, A johnsonii cũng dễ dàng được

ứng dụng thông qua kỹ thuật FISH [39]

Bên cạnh đó, các đoạn oligonucleotit với kích thước chỉ khoảng 15 - 30 nucleotit có gắn các nhãn tín hiệu khác nhau cũng được nghiên cứu thiết kế và sử dụng làm đầu dò tìm các thành phần đích là phân tử mARN, rARN đặc hiệu trong nhiều nghiên cứu [25, 65] Xét về tính hiệu quả, trong kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ nguyên vẹn tế bào, các đầu dò oligonucleotit với trình tự ngắn lại có hiệu quả tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc hiệu với trình tự đích Đối với các trình tự đích thuộc các tiểu phần ribosome 5s, 16s, 23s hoặc 28s của vi khuẩn, các loài thông thường được nhận diện bằng các đầu dò oligonucleotit Chính

vì vậy mà các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH với đầu dò oligonucleotit cho các mục đích xác định vi khuẩn, phân tích cấu trúc nhóm vi khuẩn, xem xét các mối quan hệ tương tác về không gian và thời gian của các quần thể vi sinh vật trong môi trường sống của chúng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm trong thời gian qua

tượng là những sinh vật phù du nước ngọt cũng như các loài phù du sống ven biển, ngoài khơi và cả những loài thu được từ trầm tích đáy biển Kỹ thuật FISH đã cho thấy được ưu thế trong khả năng xác định nhanh chóng và chính xác số lượng rất nhỏ các tế bào vi khuẩn cũng như có khả năng phát hiện được sự đa dạng phong phú của các quần thể sinh vật này [11, 18, 31, 46]

1.1.3 Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang

Trong lịch sử phát triển kỹ thuật FISH, nhiều biến thể của tín hiệu (thuốc nhuộm) gắn trực tiếp hoặc gián tiếp đã được đưa ra Điều này cho phép các nhà nghiên cứu có thể lựa chọn, tùy theo độ đặc hiệu, độ nhạy, độ phân giải, màu sắc phát quang của đầu dò để thiết kế các đầu dò phù hợp với các điều kiện thí nghiệm khác nhau Đồng thời, việc đa dạng hóa các loại tín hiệu đánh dấu (đa dạng màu sắc) sẽ làm cho hình ảnh của một kết quả lai huỳnh quang trở nên sinh động Hình ảnh thu được có thể minh họa rõ ràng cho việc phân tích sự tổ hợp của hệ gen về mặt không gian hay dễ dàng trong việc phát hiện nhiễm sắc thể và sự sai lệch của chúng trong chu trình tế bào Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang thường được gắn với đầu dò bằng các liên kết cộng hóa trị Chúng thường có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau, vì vậy cho phép phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật bằng một lần tiến hành lai phân tử duy nhất đồng thời cho ra những hình ảnh màu sắc sinh động Các chất nhuộm thường sử dụng cho FISH trong phân loại vi sinh vật là các dẫn xuất của fluorescein (như Fluorescein-Isothiocyanate (FITC), 5(6)carboxyfluorescein-N-hydroxysuccimide-ester (FluoX)) hoặc dẫn xuất của rhodamine (như Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate (TRITC), Texas Red), ngoài ra còn có các loại thuốc nhuộm cyanine khác như là Cy3 và Cy5… [12, 39]

Bảng 1.1 Một số chất huỳnh quang được dùng phổ biến trong kỹ thuật FISH

[18]

Bước sóng Chất

Huỳnh quang Màu Kích thích cực đại

(nm)

Phát xạ (nm)

so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [23] Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn chất huỳnh quang trên cả hai đầu 3’ và 5’ [62] Trong nghiên cứu của mình, Trebesius cùng các đồng nghiệp (1994) đã sử dụng các đầu dò polynucleotit cho các trình tự đích 23s ARN ribosome

của vi khuẩn Các đầu dò này không gắn tín hiệu phóng xạ mà được thay bằng dẫn xuất phát huỳnh quang của UTP (fluorescein-12-UTP, digoxigenin-11-UTP, 7-amino-4-methyl-coumarin- 3-acetyl-6-UTP, hoặc tetramethylrhodamine-6-UTP) Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, với đầu dò dạng này thì hiệu quả mang tín hiệu huỳnh quang tăng gấp khoảng 26 lần so với đầu dò ngắn oligonucleotit [64]

Tuy vậy, ở một một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp tỏ ra có hiệu quả hơn Sự tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG) đã được thực hiện và sau đó phức hợp này sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang [69] Ngoài ra, người ta có thể tăng độ nhạy của FISH bằng việc sử dụng enzym nhằm khuếch đại tín hiệu của đầu dò trong nhiều nghiên cứu định danh vi khuẩn Ban đầu, mỗi oligonucleotit vẫn sẽ được đánh dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzym phosphatase kiềm Enzym này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, chất này tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi kết hợp với Fast Red TR Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách này có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotit chỉ gắn nhãn huỳnh quang duy nhất [40, 67]

Sau này, phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín hiệu Tyramide” (TSA) Hệ thống này làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần

so với ban đầu Tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, do quá trình xâm nhập của các chất cao phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường nên số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất một chất huỳnh quang Mặc dù enzym lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu

dò vào trong tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương Trong một số trường hợp, việc kết hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit, được đánh

dấu với digoxygenin, song song với việc sử dụng hệ thống TSA là một giải pháp tốt Sự kết hợp này đã được ứng dụng thành công khi dò tìm và phát hiện trực quan các loài Listeria gây độc [65] Về khía cạnh khác, các đầu dò oligonucleotit với trình tự ngắn lại có hiệu quả tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc hiệu với trình tự đích so với các đầu dò polynucleotit

Để tăng độ nhạy của đầu dò trong kỹ thuật FISH, việc tính toán đến số lượng bản sao của trình tự đích cũng là một giải pháp được tính đến nhằm khuếch đại tín hiệu để có được hình ảnh rõ nét hơn Trong nhiều trường hợp, các trình tự đích là các rARN hay các mARN (thường có nhiều trong tế bào) được lựa chọn để sử dụng với các đầu dò oligonucleotit mang được ít tín hiệu đánh dấu [18]

Hình 1.1 Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dò [18]

Gắn nhãn trực tiếp (a, b) và gián tiếp (c–e) của đầu dò sử dụng 1 phân tử chỉ thị như digoxygenin (DIG) mà nó sau đó được phát hiện bởi kháng thể huỳnh quang, horseradish peroxidase (HRP) sử dụng phức hợp fluorescein–tyramide như một cơ chất cho sự khuếch đại tín hiệu bằng enzym theo hệ thống TSA, hoặc sự kết hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit với hệ thống TSA

Như vậy, bằng kỹ thuật FISH, các nhà nghiên cứu không chỉ có thể phân biệt được các vi sinh vật quen thuộc mà còn xác định được các vi sinh vật mới, chưa biết

Gắn nhãn vào đầu 5’ (a) Gắn nhãn vào đầu 3’ (b)

Sử dụng chất chỉ thị (c)

Sử dụng enzym (d)

Đầu dò dạng polynucleotit (e)

rõ về điều kiện và môi trường nuôi cấy Đồng thời, kỹ thuật FISH có thể giúp chúng

ta phân tích được sự phân bố không gian của chúng và biết rõ về hệ thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật Việc xác định số lượng, cường độ các tín hiệu phát ra bằng các oligonucleotit của rARN đích cho phép ước tính được tỷ lệ tăng trưởng của các tế bào riêng lẻ [38] Cho đến nay, độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật giúp kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ - FISH trở thành công cụ rất hữu hiệu cho nhiều nghiên cứu về di truyền, sinh thái, môi trường Qua quá trình phát triển và cải tiến, cho đến nay chúng được xem là một trong những công cụ di truyền phân tử ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu về sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán bệnh và phát sinh loài

1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo biển độc hại

Vi tảo biển (Microalgae) là bộ phận sinh vật có thành phần rất phong phú trong hệ sinh thái thủy sinh của biển Trong chuỗi thức ăn, vi tảo biển là sinh vật sản xuất sơ cấp, là một mắt xích thức ăn, nguồn cung cấp dinh dưỡng của nhiều loài động vật phù du, ấu trùng giáp xác và nhiều loài động vật khác [7] Bên cạnh chức năng quan trọng đó, việc bùng phát hoặc tiết các chất gây độc của một số loài vi tảo biển lại có thể gây nguy hại cho các loài thủy sinh, thậm chí gây nguy hiểm đến tính mạng con người và gây ô nhiễm môi trường, phá hủy cân bằng sinh thái Điển hình cho những tác hại này chính là hiện tượng thủy triều đỏ hay tảo độc nở hoa, đã được ghi nhận ở nhiều vùng biển khác nhau trên thế giới, trong đó có Việt Nam Đây cũng là nguyên nhân làm chết nhiều loài sinh vật biển trong tự nhiên và nuôi trồng thủy sản

Một số chi tảo điển hình cho hiện tượng thủy triều đỏ là Alexandrium và

Pseudo-nitzschia Đây là những chi tảo biển có phân bố rộng, có thể bắt gặp ở nhiều

vùng biển khác nhau ở Việt Nam và trên thế giới Chúng có khả năng sản sinh các

độc tố gây liệt cơ (PSP) và có thể gây chết người [45] Mặt khác, rất nhiều loài vi

tảo có cấu tạo phức tạp và rất giống nhau về hình thái ngoài, do vậy thường dẫn đến

sự lẫn lộn về danh pháp giữa các loài trong cùng một chi Điều này dẫn đến những

khó khăn rất lớn cho việc quan trắc, cảnh báo nguy cơ bùng phát và hạn chế những tác hại của chúng trong tự nhiên Tuy nhiên, kỹ thuật FISH ra đời và ngày càng hoàn thiện đã phần nào giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc rà soát và phát hiện nhanh tảo độc hại và quan trắc, cảnh báo môi trường một cách hiệu quả hơn Phương pháp này thường được sử dụng trong các nghiên cứu quan trắc môi trường biển cho các loài vi tảo độc hại, đặc biệt khi có những biến động bất thường

về môi trường và sự nở hoa vi tảo biển [59]

Một trong những thử nghiệm đầu tiên sử dụng các đầu dò phân tử như một công cụ để phân loại các loài tảo độc hại được tiến hành bởi Anderson (1995) Kết quả nghiên cứu này cho thấy độ nhạy của đầu dò lai huỳnh quang trong việc phát

hiện Pseudonitszchia pungens là rất tốt Sự kết hợp giữa 2 loại đầu dò huỳnh quang

và đầu dò kháng thể làm tăng đáng kể hiệu quả hình ảnh thu được [15] Năm 1996,

Adachi và đồng nghiệp đã sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân loại hai loài A

tamarense và A catenella thuộc chi Alexandrium Đầu dò ADN được thiết kế đối

với trình tự của ADN mã hóa ribosome (rADN) tại vùng ITS Nhóm đối tượng được

tiến hành thử nghiệm bao gồm A affine, A insuetum, A pseudogonyaulax, A

lusitanicum, A fraterculus, Gymnodinium mikimotoi, Prorocentrum micans, Amphidinium carterae, Heterocapsa triyuetra, Heterosigma akashiwo, Chattonella antiyua và Skeletonema costatum Kết quả cho thấy, hai đầu dò cCAT-F1 và

cTAM-F1 chỉ bắt cặp tương ứng với các chủng khác nhau thuộc hai loài

Alexandrium catenella và A tamarense Ngoài ra, chúng không hề có phản ứng với

các chủng tảo độc khác hoặc xảy ra phản ứng chéo trong cùng điều kiện lai Kết quả

này chứng tỏ, cCAT-F1 và cTAM-F1 có tính đặc hiệu cao với các loài Alexandrium

catenella, A tamarense và có thể dùng làm đầu dò đặc hiệu để nhận dạng hai loài

vi tảo biển này [10]

Một số công bố sau đó cũng cho thấy phương pháp FISH có khả năng áp dụng tốt trong việc phân loại các loài đặc hiệu ngay cả trong mẫu nuôi cấy và mẫu ngoài tự nhiên [10, 59] Cùng thời gian này, Miller và Scholin đã ứng dụng FISH

nitzschia Tám đầu dò phân tử đặc hiệu (auD1, puD1, muD1, muD2, heD2-2, frD1,

deD1, và amD1) được thiết kế và sử dụng để phân loại một cách dễ dàng tám loài

khác nhau, đó là: P australis, P pungens, P multiseries, P heimii, P fraudulenta,

P delicatisima, P pseudodelicatisima và P americana Kết quả cũng cho thấy tính

tiện dụng, chuẩn xác và tiết kiệm thời gian của phương pháp phân loại bằng các đầu

dò huỳnh quang hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống [50, 51] Ở một nghiên cứu khác, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng thử nghiệm để nhận dạng 10

chủng tảo độc thuộc một số loài Pseudo-nitzschia được thu thập ở nhiều vùng khác

nhau trên thế giới (Nhật Bản, Mĩ và Canada) với trình tự đích là ARN Kết quả cho

thấy, đầu dò có tín hiệu rất mạnh đối với các chủng Pseudo-nitzschia multiseries và

P pungens, thu thập từ Mĩ và Canada Phép lai phân tử cũng cho thấy tín hiệu

huỳnh quang giảm nhẹ khi tế bào nuôi cấy ở giai đoạn muộn chứng tỏ lượng ARN

đã giảm trong tế bào Việc định lượng tế bào Pseudo-nitzschia bằng sử dụng kết

hợp kỹ thuật FISH cũng trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn [59] Khả năng ứng

dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với các mẫu Pseudo-nitzschia đã được cố

định bằng hóa chất bảo quản cũng đã được thử nghiệm Các mẫu vi tảo cố đã được

cố định bằng êtanol cũng đã có phản ứng dương tính đối với thí nghiệm lai Tuy nhiên, độ nhạy của tín hiệu huỳnh quang thu được tùy thuộc vào thời gian cố định

và một số điều kiện bảo quản của mẫu trước khi thí nghiệm Đối với các mẫu sau khi lai với đầu dò huỳnh quang được lưu giữ ở 4oC sẽ duy trì được sự phát quang trong thời gian dưới 1 tuần [49] Trong những nghiên cứu khác, các các tiểu đơn vị

của ribosome cũng đã được lấy làm các trình tự đích cho việc quan trắc

Pseudo-nitzschia thu thập từ vịnh Chinhae Bay (Hàn Quốc) Kỹ thuật FISH với các đầu dò

đặc hiệu đã được sử dụng gồm muD1, puD1, auD1, heD2-2, frD1, deD1, amD1 Nghiên cứu này cũng cho thấy, một số đầu dò cho tín hiệu huỳnh quang yếu hơn các đầu dò khác Điều này được giải thích là liên quan đến trạng thái sinh lí của tế bào [20]

Sau này, việc sử dụng các đầu dò phân tử phát huỳnh quang trong kỹ thuật FISH để nhận dạng và phát hiện các loài tảo độc hại ngày càng phổ biến hơn Đầu

dò được thiết kế dựa trên trình tự đích thuộc vùng D1- D2 của tiểu đơn vị lớn LSU rADN của các loài vi tảo đã được thử nghiệm trong phép lai FISH đặc hiệu trên tế

bào nguyên vẹn Các đầu dò ADN đặc hiệu cho 6 loài Alexandrium: A tamarense,

A catenella, A affine, A fraterculus, A insuetum và A pseudogonyaulax đã cho kết

quả tốt và không biểu hiện ở các phản ứng lai với các loài Alexandrium khác [43]

Cũng nghiên cứu về một số loài thuộc chi Alexandrium, một số nhà khoa học khác

cũng đã thành công trong việc phát triển phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ với

các đầu dò được thiết lập từ các trình tự đích thuộc rARN có trong tế bào A

tamarense và A catenella với cả mẫu nuôi cấy và mẫu tảo thu ngoài tự nhiên [63]

Một số thử nghiệm lai tại chỗ trên Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae) với các

đầu dò thiết kế các trình tự ARN và ADN đích đã cho thấy: đối với đầu dò rARN, kết quả là các ARN trong tế bào chất được lai với đầu dò và làm cho toàn bộ tế bào bắt màu xanh; còn với đầu dò ADN, đầu dò lai với ADN trong nhân nên chỉ có nhân tế bào là bắt màu xanh [21]

Khai thác trình tự vùng D1-D2 ADN mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome (LSU), một số nhà khoa học đã thiết kế các đầu dò và phát triển phép lai huỳnh quang tại chỗ với tín hiệu FITC nhằm định loại nhanh cho nhiều loài tảo độc hại trong nhiều thủy vực [22]

Bảng 1.2 Trình tự đầu dò cho một số loài Alexandrium [22]

AB088316 AB088280 AB088290 AB088298 AB088279 AB088302 Trong nhiều nghiên cứu về sau này, một số cải tiến của kỹ thuật FISH đã được

khác nhau [17] Với những ưu thế về độ chính xác, độ nhạy và tiết kiệm thời gian,

kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ vẫn được xem là một công cụ rất hữu hiệu cho nhiều nghiên cứu sinh học

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam

Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y học Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH đã được tiến hành Các nghiên cứu này được dựa trên các trình

tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng với các bệnh di truyền được quan tâm [4] Trong một số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang được dùng để chẩn đoán trước sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho kết quả thành công Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi so sánh với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối [1, 2] Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong việc phát hiện các lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ cũng đã thành công Trên cơ sở phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn 17 - 25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội chứng Patau (trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất thường cánh dài của NST 16 Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y Quy trình chuẩn nhằm chẩn đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn cũng đã được hoàn thiện [6] Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại gen NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các bệnh viện Nhi trung ương và cho kết quả tốt đẹp Một số biến đổi di truyền trong u nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng nhất đã được tìm thấy Kết quả thành công này có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác

sỹ lâm sàng trong việc phân nhóm bệnh nhân và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp [5]

Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH đối với các loài sinh vật thủy sinh tại Việt Nam gần như rất ít Trong một nghiên cứu gần đây tại Viện nghiên cứu hải sản về ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh 2

loài tảo giáp độc hại A tamarense và A catenella, một số thử nghiệm đã được tiến

hành Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2 trên nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần lớn LSU của ribosome của loài được lấy làm cơ sở thiết kế đầu dò Tín hiệu huỳnh quang FITC được thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các trùng lặp, giống nhau về đặc điểm hình thái của các loài tảo giáp từng gây khó khăn trong quan trắc tảo độc hại đã phần nào được giải quyết nhờ kỹ thuật FISH Đây cũng là một trong những cơ sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong quan trắc cảnh báo về sự bùng phát các đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ tại Việt Nam [3]

1.3 Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH

Sự ra đời của kỹ thuật FISH dựa trên các cải tiến của kỹ thuật ISH đã ra đời

và là sự kết hợp chính xác của phép lai một đoạn oligonucleotit (đầu dò) có gắn tín hiệu huỳnh quang với một trình tự ADN đích đặc trưng Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, các phân tử huỳnh quang phát sáng với những màu sinh động cho phép hiển thị các đoạn ADN, nhiễm sắc thể hay tế bào đích Nhờ đó mà các nhà nghiên cứu có thể nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào sinh vật trong mẫu môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh phẩm

Quy trình này bao gồm các bước cơ bản sau:

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu và đầu dò có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình

tự đặc hiệu cần nhận biết

- Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu

- Bước 3: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu

- Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai (đầu dò tự do)

- Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang

Hình 1.2 Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH 1.4 Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu

Alexandrium affine được xác định là một trong số 31 loài tảo độc hại thuộc

phân chi Alexandrium nom nud của chi Alexandrium (chi tảo Hai roi) trên thế giới Chúng được xác định có phân bố phổ biến ở vùng biển Việt Nam Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy rằng chúng phát triển mạnh vào thời gian từ tháng 12 đến tháng 2 hàng năm và bắt gặp nhiều trong các thủy vực Thừa Thiên Huế Loài này cũng đã bắt gặp phát triển mạnh tại các vịnh Văn Phong, Cam Ranh (Khánh Hòa) vào mùa khô thuộc các tháng 3 và 4 Một kết quả phân tích độc tố của loài này

đã cho thấy rằng, thành phần độc tố của chúng bao gồm các loại NeoSTX, STX, GTX1-4 với nồng độ <2,28µmol/tế bào Đây là các chất độc được sản sinh ra khi chúng bùng phát mạnh với mật độ cao trong môi trường thủy sinh Các chất độc này làm chết nhiều đối tượng thủy sinh [45] Trong các nghiên cứu vi tảo biển độc hại,

A affine là một trong những đối tượng được quan tâm vì chúng cũng là một trong

những yếu tố chỉ thị môi trường quan trọng [7]

Một loài tảo khác là Alexandrium pseudogonyaulax đã được xác định là một

trong 15 loài tảo độc hại thuộc chi Alexandrium (phân chi Gessnerrium) có ở biển

Việt Nam A pseudogonyaulax được coi là loài tảo gây hại trong nhiều thủy vực

nước mặn và lợ ven biển Việt Nam Các kết quả điều tra nghiên cứu trước đây đã

cho thấy rằng: A pseudogonyaulax có phân bố rộng và rất dễ bùng phát và đã từng

bùng phát nhiều đợt, làm thiệt hại nghiêm trọng tới nhiều thủy vực nuôi trồng thủy sản tại các vùng ven biển miền trung và Nha Trang [7] Tuy không phải là nhóm vi tảo hai roi sản sinh độc tố, nhưng do khả năng dễ tạo mật độ cao trong các thủy vực

nên A pseudogonyaulax được đánh giá là một trong những loài tiềm tàng gây hại

cao, là nguyên nhân gây thiệt hại cho nhiều đầm nuôi thủy sản trong thời gian qua Chính vì vậy đây cũng là một trong những đối tượng chỉ thị môi trường quan trọng trong nhiều thủy vực ven biển [45]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi vì vậy đã tiến hành thử nghiệm ứng dụng

kỹ thuật lai huỳnh quang FISH nhằm nhận diện nhanh được 2 loài tảo độc hại là

Alexandrium affine và A pseudogonyaulax thu thập ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu

Hai mẫu tảo độc hại được thu tại vùng biển Cát Bà – Hải Phòng, gồm có:

+ Mẫu A sp6 (Alexandrium affine) được thu vào ngày 20/7/2010 tại khu vực

cửa biển thuộc Bến Bèo (Cát Bà, Hải Phòng) với điều kiện môi trường như sau: độ mặn nước biển: 27‰, pH 7,72

+ Mẫu A sp7 (Alexandrium pseudogonyaulax) được thu vào ngày 27/4/2011

tại khu vực vịnh cảng Cát Bà (Hải Phòng) với các điều kiện môi trường nước biển như sau: độ mặn nước biển: 29‰, pH 7,44

2.2 Phương pháp thu và lưu giữ mẫu

Mẫu vi tảo nghiên cứu được thu theo hướng dẫn của Hallegraeff và đồng nghiệp [32] và Anderson [15]

Mẫu được thu bằng lưới thu thực vật phù du có đường kính 20cm, kích thước mắt lưới 20µm, thu theo phương thẳng đứng Mẫu sau đó được bảo quản trong lọ và giữ trong điều kiện nhiệt độ từ 4 – 15oC Mẫu này sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập

Đối với các mẫu vi tảo thu ngoài tự nhiên để thử nghiệm đầu dò, 2 phương pháp bảo quản, xử lý mẫu được tiến hành:

- Xử lý mẫu thu được từ lưới kéo như trên và sau đó mẫu này được sử dụng cho các thí nghiệm lai như trình bày ở phần sau

- Các mẫu thu từ ngoài tự nhiên không kịp tiến hành thí nghiệm lai với đầu

dò ngay trong ngày thì được cố định bằng etanol 70% hoặc formandehyt 10% Các mẫu này sau đó được đưa vào thí nghiệm lai như mô tả ở phần sau (Shoko và cộng sự [60])

2.2.1 Phân lập các chủng vi tảo (theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ bằng

micropipet của Richmon [57] và Andersen [13]:

Mẫu tảo sau khi chuyển về phòng thí nghiệm, được phân lập bằng pipet mao quản (pipet thủy tinh kéo dài) Sau đó, tế bào được rửa sạch bằng cách hút chuyển từng tế bào cần phân lập vào môi trường nuôi tảo vài lần có cùng độ mặn, cho tới khi mẫu sạch hoàn toàn Tiếp theo, mỗi tế bào được chuyển sang một giếng nuôi đã chứa sẵn môi trường đã được pha sẵn với độ mặn tương ứng ngoài tự nhiên

Môi trường nuôi được sử dụng là môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium)

2.2.2 Phương pháp nuôi giữ các chủng vi tảo thu được (theo Shoko và cộng sự

[60], Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự [3]):

Các mẫu tảo sau khi thu thập được nuôi giữ như sau:

+ Bước 1 - Nuôi trong giếng: Mẫu sau khi phân lập được rửa sạch, mỗi tế bào (hoặc chuỗi tế bào) được chuyển vào một giếng Giếng nuôi có đường kính 16mm, thể tích khoảng 5ml (loại 24 giếng/khay của hãng Corning - Mỹ) Sau 3 đến

5 ngày nuôi và theo dõi, nếu tảo đã thuần và phát triển tốt, tiến hành cấy truyền sang

lọ nuôi bằng nhựa (flask) Đối với các mẫu chưa thuần, phân lập được lặp lại cho tới khi thuần hoàn toàn

+ Bước 2 - Nhân nuôi sinh khối trong lọ nhựa hoặc bình tam giác: Mẫu tảo phát triển tốt được tiếp tục nuôi tạo sinh khối trong lọ nhựa hoặc bình tam giác 50ml làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

Mẫu tảo độc được nuôi trong các điều kiện nhân tạo được kiểm soát về các thông số môi trường, bao gồm:

Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, bằng hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon); Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, được điều khiển bởi

đồng hồ đóng ngắt tự động;

Nhiệt độ nuôi: ổn định ở 24oC liên tục trong buồng có điều hòa nhiệt độ;

Môi trường nuôi: IMK (hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Nhật Bản)

2.3 Phương pháp phân loại hình thái

Việc phân loại các mẫu tảo giáp được thực hiện chủ yếu dựa vào công thức tấm vỏ tế bào đã được nhuộm Calco - fluor, quan sát dưới kính hiển vi quang học và

có sự hỗ trợ của chuyên gia phân loại hình thái Các tài liệu chính để phân loại là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen và cộng sự (2004) [8, 9, 16, 45]

2.4 Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN và thiết kế đầu dò

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn (Sebastián và cộng sự (2001) [62]):

Chuẩn bị ADN khuôn: Một tế bào được phân lập từ mẫu nuôi bằng pipet

pasteur thủy tinh kéo dài Tế bào được rửa 3 lần bằng nước biển lọc có độ mặn giảm dần từ 27‰ đến 20‰ và 15‰ Cuối cùng, tế bào được rửa 3 lần bằng nước cất trước khi đưa vào trong ống PCR chứa sẵn 10µl nước khử ion đã được tiệt trùng Tế bào được giữ ở -20oC và sau đó được đưa vào sốc nhiệt để phá vỡ tế bào, chuẩn bị cho phản ứng PCR

Phương pháp sốc nhiệt : Các ống mẫu chứa tế bào được chuyển đột ngột qua

lại 3 lần giữa hai trạng thái lạnh (-20oC ) và nóng (90oC) trong thời gian mỗi 20 giây

ở mỗi điều kiện, nhằm làm vỡ tế bào và dung giải ADN ra ngoài Các mẫu được lắc rung (votex) và ly tâm trở lại (5000vòng/phút) chuẩn bị cho phản ứng PCR

2.4.2 Phương pháp Singel cell PCR (Sebastián và cộng sự (2001) [62], Shoko và

cộng sự (2005) [60])

Phản ứng PCR được tiến hành để nhân vùng D1 – D2 của gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome Tuy nhiên, do lượng ADN khuôn ban đầu ít (từ 1 tế bào) nên quy trình PCR được thực hiện thông qua 2 phản ứng theo sơ đồ hình 2.1)

Sản phẩm phản ứng PCR 2 (vùng ADN mục tiêu)

PrS1R

Pr28-PrD2 PrD1

SSU ITS1 5S

ITS2 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 ……

SSU ITS1 5S ITS2 D1 D2 D3 D4 D5

ADN mã hóa Ribosom Cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR1

Sản phẩm phản ứng PCR1

Phản ứng PCR lần 1: Nhân đoạn ADN dài khoảng 5.000 bp, mã hóa cho rARN của

Alexandrium từ vùng tiểu phần nhỏ SSU tới vùng D6 của tiểu phần lớn LSU Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 1: S1R (5’-TACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’) và 28-1483R (5’-GCTACTACCACCAAGATCTGC-3’) Chu trình nhiệt: 950C 5phút, (950C 1phút, 550C 1phút, 720C 5phút 30 giây) x 35 chu kỳ, 720C 10 phút Thể tích phản ứng PCR là 25µl có chứa các thành phần như sau:

- MgCl2: 20mM (1x đệm Takara Ex Taq)

- dNTPs: 200µM (Takara Ex)

- Taq: 1U (Takara Ex Taq)

- Mồi: 1µM mỗi mồi (TOS-Nhật Bản)

- ADN khuôn: 5µl

Phản ứng PCR lần 2: Nhân đoạn D1-D2 của tiểu phần LSU, với độ dài

khoảng 700bp Thể tích phản ứng PCR lần 2 là 25µl có thành phần tương tự như trên, sử dụng ADN khuôn là 5µl sản phẩm PCR lần 1 Cặp mồi sử dụng là: D1R

(5’-CCTTGGTCCGTTTCAAGA-3’) Chu trình nhiệt: 95oC 5phút, (95oC 30 giây, 55oC

30 giây, 72oC 1phút 50 giây) x 35 chu kỳ, 72oC 10 phút

Các phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR Thermal Perkin Elmer 9600

Kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR lần 2 được điện di trên gel agarose

1,5%, nhuộm trong ethidium bromide, soi trên đèn UV có bước sóng 365nm để kiểm tra và đánh giá kết quả

2.4.3 Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN

Giải trình tự ADN vùng D1-D2: Sản phẩm thu được của PCR lần 2 được tinh

sạch bằng cột tinh sạch của hãng Promega và gửi đi giải trình tự trên máy Applied Biosystems 3130 Series (tại phòng thí nghiệm của Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội)

Kiểm tra phân loại bằng ADN: Dựa trên trình tự vùng D1 - D2 thu được,

chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp kết nối lân cận (neighbor joining) sử dụng thuật toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần, sử dụng trình tự số hiệu AF260387 trên ngân hàng gen (genbank) làm loài ngoài nhóm để so sánh Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần mềm Mega phiên bản 5.03

2.4.4 Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu

Dựa trên trình tự ADN thu được, sử dụng công cụ ClustalW, phần mềm BioEdit để sắp xếp, so sánh các trình tự nucleotit thu được với trình tự của những loài gần gũi về mặt phân loại Trên cơ sở đó, lựa chọn đoạn ADN đặc trưng nhất cho loài để thiết kế đầu dò Đầu dò được thiết kế và được đặt hàng tại công ty TOS (Nhật Bản) để chế tạo, với yêu cầu gắn thêm chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) ở đầu 5’ để phục vụ cho việc hiển thị sự hiện diện của trình

tự đặc trưng

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ giữ nguyên vẹn tế bào được áp dụng Các đầu dò huỳnh quang gắn tín hiệu FITC được thiết kế để gắn đặc hiệu với trình tự đích trên tiểu phần lớn của ribosome của tế bào vi tảo Với số lượng lớn các ribosome trong mỗi tế bào, kết quả lai tốt sẽ cho lượng lớn các đầu dò

có gắn tín hiệu huỳnh quang được gắn lên ribosome trong mỗi tế bào của loài Dưới

sự tác động của chùm sáng 490nm, tín hiệu FITC được kích thích và phát sáng (xanh lam) đặc trưng sẽ làm toàn bộ tế bào phát sáng xanh lam Do đó tế bào dễ dàng được phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang

2.5 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (dựa theo phương pháp của Shoko

 Ly tâm mẫu 3000vòng/phút trong 1 phút (4oC)

 Loại nước trong mẫu theo 2 bước:

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3.000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3.000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

 Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh quang (50 pmol))

 Lai tế bào ở các thang nhiệt độ khác nhau: 37°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C, 52°C trong 5 phút

 Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần:

- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC)

Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu FITC 490 nm, hiển thị và chụp ảnh tế bào bằng camera DS Nikon

Chi tiết thành phần các dung dịch được thể hiện trong phụ lục 1

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái

Trên cơ sở các mẫu thu được từ vùng biển Cát Bà, 2 chủng vi tảo độc hại

đã được phân lập, nuôi giữ và phân loại sơ bộ dựa trên các đặc điểm về hình thái Hai loài tảo giáp được xác định sơ bộ là thuộc chi Alexandrium bao gồm:

3.1.1 Loài Alexandrium affine

Một số đặc điểm hình thái của tế bào được ghi nhận qua công thức tấm vỏ của loài đặc trưng như sau: Kích thước tế bào khoảng 38 - 45µm, có dạng bất đối xứng Tấm 1' liên kết trực tiếp với tổ hợp lỗ đỉnh và có một lỗ bụng nhỏ ở vị trí trung tâm trên mép phải tấm 1' nơi tiếp xúc với tấm 4' Tấm S.a có dạng hình thang và không có phần phụ đi kèm Một số hình ảnh loài được ghi nhận qua hình 3.1

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái của A affine

Hình dạng ngoài của tế bào (A); Tấm 1' với lỗ bụng và tổ hợp lỗ đỉnh (B, C);

Tấm S.a hình thang, không có phần phụ (D)