cộng sự (2005) [60])
Phản ứng PCR được tiến hành để nhân vùng D1 – D2 của gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome. Tuy nhiên, do lượng ADN khuôn ban đầu ít (từ 1 tế bào) nên quy trình PCR được thực hiện thông qua 2 phản ứng theo sơ đồ hình 2.1).
Sản phẩm phản ứng PCR 2 (vùng ADN mục tiêu) Pr28- PrS1R PrD2 PrD1 SSU ITS1 5S ITS2 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 ……
SSU ITS1 5S ITS2 D1 D2 D3 D4 D5
ADN mã hóa Ribosom Cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR1 Sản phẩm phản ứng PCR1 PCR 1 PCR 2 D1 D2 Cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR2
24
Phản ứng PCR lần 1: Nhân đoạn ADN dài khoảng 5.000 bp, mã hóa cho rARN của Alexandrium từ vùng tiểu phần nhỏ SSU tới vùng D6 của tiểu phần lớn LSU. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 1: S1R (5’-TACCTGGTTGATCCTGCCAG- 3’) và 28-1483R (5’-GCTACTACCACCAAGATCTGC-3’). Chu trình nhiệt: 950C 5phút, (950C 1phút, 550C 1phút, 720C 5phút 30 giây) x 35 chu kỳ, 720C 10 phút .
Thể tích phản ứng PCR là 25µl có chứa các thành phần như sau:
- MgCl2: 20mM (1x đệm Takara Ex Taq)
- dNTPs: 200µM (Takara Ex)
- Taq: 1U (Takara Ex Taq)
- Mồi: 1µM mỗi mồi (TOS-Nhật Bản)
- ADN khuôn: 5µl
Phản ứng PCR lần 2: Nhân đoạn D1-D2 của tiểu phần LSU, với độ dài khoảng 700bp. Thể tích phản ứng PCR lần 2 là 25µl có thành phần tương tự như trên, sử dụng ADN khuôn là 5µl sản phẩm PCR lần 1. Cặp mồi sử dụng là: D1R
(5’-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3’) và D2C (5’-
CCTTGGTCCGTTTCAAGA-3’). Chu trình nhiệt: 95oC 5phút, (95oC 30 giây, 55oC 30 giây, 72oC 1phút 50 giây) x 35 chu kỳ, 72oC 10 phút.
Các phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR Thermal Perkin Elmer 9600.
Kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR lần 2 được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm trong ethidium bromide, soi trên đèn UV có bước sóng 365nm để kiểm tra và đánh giá kết quả.