Trên cơ sở ADN khuôn thu được từ sản phẩm PCR lần 1 (nhân đoạn ADN mã hóa cho rARN của tảo Alexandrium, từ vùng tiểu phần nhỏ SSU tới vùng D6 của tiểu phần lớn LSU), sản phẩm PCR lần 2 nhằm nhân đoạn ADN mã hóa vùng D1 - D2 của ribosome đã có kết quả. Ở mỗi mẫu thí nghiệm, đoạn mồi D1R, D2C đã nhân được một đoạn ADN duy nhất có kích thước tương ứng với đoạn dự kiến, khoảng gần 700bp, trong khi sản phẩm PCR của mẫu đối chứng âm không cho băng nào. Điều này chứng tỏ rằng phản ứng PCR rất đặc hiệu. Kết quả được thể hiện ở sản phẩm điện di trên gel agarose 1,5% (hình 3.5).
32
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2
(M1: Marker5 (ФX174/HincII), M2: Wide Range DNA Ladder 50- 10.000bp. L1-3: A.affine, L4-6: A.pseudogonyaulax; L7: Đối chứng âm)
Sản phẩm PCR lần 2 (L3 và L4) của 2 loài nói trên đã được tiến hành giải trình tự. Kết quả cho thấy, vùng D1-D2 của mẫu L3 có kích thước gồm 651bp và có trình tự nucletotit như sau:
CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCAAGCAGAAGCATTTTGCCAGC AATTGTGTGCCAGGGCTTGTAAGCTCTAGTAGGGTAGGCCCAGCTTC AAGAAATGAGCAATTACAAAAGCACCAGACACATGTATCAAAACAC AAATCATCACAAACACATGCAATCCAAACCCCGCAGGAAAATTACCA TTCATGTGCAAGGGTAATCAAATGTACAAATAGAAACTGGCAAGCAA AGCAAGAATCATCACACCCACAATCAAAACCTATTGTCAAGCAAGCA CCACAATCTCACCAAGCAACATCAAATCTGTTTATTTTCTGTTCAGCA AATACAAACTCATTTAATTCTCTTTTCAAAGTCCTTTTCATATTTCCCT CATGGTACTTGTGTGCTATCAGTCTCAATCCTATATTTACCTTTACAT GAAACTTACCACCCACTTTGCATTCCAATGCCAAGGAGTGTGACTCA GCAAACATACACCGTGCACAGAGGATTGCACATGACAAACAGGATTC TCACCCTCATTGACGCTTTCTTTCAATAGGCTGACACCTGCACCTCTG M2 1000bp 750bp 500bp M1 1057bp 770bp 612bp
33
TTGGTAATACATTTCAAAAATACAAGTCGAAGCCAGAGGCTCCAATT GTCAAGCTAAGCATGTCCTTGTTCATTCGCATAC
Đối với mẫu L4, vùng D1-D2 có trình tự ADN thu được bao gồm 650 bp và có trật tự các nucleotit như sau:
CCCGCTGAATTTAAGCATATAAGTAAGCGGTGGAAAATGAACCAAAT GGGATTCCTTTAGTAATTGCGAATGAACAAGGATGTGCTCAGCTTGA CAAATGGAGTTTTTGAGCTTTGAATTGTAATTTTGCAATGCATCACCA GCGGAGGTACAGTTGCAAGCCTTTTGAAAGACAGCGCCATTGAGGGT GAAATTCCTTTTTGTCTTCTGCAACCTTTGTGCACGGTATGTATTTGGT GAATCACATTCCTCGGCATTGGAATGCAAATTGGGTGGTAAATTTCA CGCAAGGGAAAATATATTATTGAGTCTGATAATGAACAAGTACCATG AGGGAAATATGCAAAGGACTTTGAAAAGAAAATTAAAAGAGCTTGC ATTTGCTAAACAGAAAACTAGCAGAAGTGCTTTATCTTGGTAAGATT GCTGCGCATGGGTTTACTGTGTAAATTGTATGAGCATTGGTTCTTACT TTGTGTGTCAATTCCATTGTCAATTTTAATATCTTTGCTCATGAATTGT GAAATGCTTGCGGGTGTTAGATTGCATGTGCATTCATTAATTTGGACT TGGTGCAGTGCTTGGCAACAGCTTGCATGTAGAGTGTGCGTGCAATG TACAATTGCGATTGTCAGCTGTTGCCAACCACTTTTGTTGGCAATGTG ATTCTGCTTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGG
34
Kết quả phân tích BLAST trình tự L3 (Sp6.1) với các dữ liệu trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Mega 5.03 cho thấy: giá trị cực đại tương đồng (max ident) thu được cao nhất là 100% khi trình tự này (L3) được so sánh với các kết quả nghiên cứu vùng D1-D2 của loài
A. affine trên Genbank (Hình 3.6, phụ lục 2).
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của một số loài thuộc chi Alexandrium Cây được xây dựng dựa trên vùng trình tự D1 - D2 thuộc đoạn rADN 28S theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần. Số liệu thống kê với độ tin cậy lớn hơn 50% được hiển thị trên mỗi nhánh phân loại. Fragilidium subglobosum với trình tự
có số hiệu AF260387 được chọn làm loài ngoài nhóm. Các trình tự có số hiệu (trong ngoặc đơn) được tải về từ ngân hàng gen.
35
Chủng SP 6.1 có trình tự vùng D1-D2 tương đồng với các chủng thuộc loài Alexandrium affine thu thập tại các vùng bờ Biển Nhật Bản (AFF37), Hàn Quốc (JHW0210), Hong Kong (A10), Thái Lan (CU1), Pháp (X21) và Tây Ban Nha (Pa4V). Như vậy có thể thấy trình tự này rất tương đồng và trùng với các kết quả nghiên cứu trước đây. Điều này cũng là cơ sở khẳng định đây chính là loài A. affine và những kết quả phân loại loài qua hình thái đã nói ở trên là phù hợp.
Đối với trình tự L4 (Sp7.5), các kết quả so sánh độ tương đồng và xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng đã chỉ ra rằng, L3 có trình tự phù hợp với các trình tự đoạn D1 – D2 của loài A. pseudogonyaulax có trên nguồn dữ liệu của Genbank (NCBI). Chủng SP 7.5 có trình tự vùng D1 - D2 tương đồng với các chủng thuộc loài Alexandrium pseudogoniaulax thu thập tại các vùng bờ Biển Newzeland (CAWD54) và Nhật Bản (KAGAWA-39, APSN). Điều này giúp khẳng định loài Sp7.5 thu được là A. pseudogonyaulax (Hình 3.6, phụ lục 3).