Trên cơ sở 2 trình tự thu được từ vùng D1 - D2 của hai mẫu tảo độc hại trên, phần mềm Bioedit được sử dụng để sắp xếp, so sánh với các trình tự tham khảo (từ NBCI) tại vùng tương đồng D1 - D2 của các loài thuộc chi Alexandrium. Những khác biệt từ các trình tự bảo thủ này so với các loài khác là cơ sở cho việc chọn lọc trình tự phù hợp để thiết kế đầu dò đặc hiệu cho từng loài. Kết quả sắp xếp và so sánh đối với loài A. affine được thể hiện trong hình 3.7 và phụ lục 4. Theo đó, có 2 đoạn polynucleotit có trình tự khác biệt nhiều với các trình tự tương ứng của các loài khác thuộc chi Alexandrium là trình tự nucleotit từ vị trí 630 đến 649 và 657 đến 676.
Dựa trên các yêu cầu về thiết kế đầu dò ADN có kích thước khoảng 20 nucleotit, trình tự có tỷ lệ GC cao được lựa chọn làm khuôn để thiết kế đầu dò.
36
Trong nghiên cứu này, đoạn trình tự nucleotit từ 657 đến 676 được lựa chọn làm mẫu xây dựng trình tự đầu dò. Trình tự đầu dò cho loài A. affine được xác định là: 5’-TGTAAGCTCTAGTAGGGTAG-3’ có trình tự bổ sung với trình tự đoạn ADN trên. Đoạn trình tự đầu dò này đã được kiểm tra lại bằng BLAST trên NBCI và không thấy có trình tự nào bổ sung tương đồng. Kết quả này khẳng định rằng trình tự này phù hợp cho việc thiết kế đầu dò đặc hiệu cho loài A. affine.
Hình 3.7. So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A. affine với các loài Alexandrium
Tương tự như vậy, các kết quả so sánh đối với trình tự đoạn D1 – D2 của loài A. pseudogonyaulax (hình 3.8 và phụ lục 5) cũng cho thấy: sự khác biệt nhiều trong trình tự các nucleotit so với các loài khác trong cùng chi xuất hiện trong đoạn trình tự 774 đến 794. Đây có thể được coi là một đoạn bảo thủ, đặc trưng của loài. Dựa trên kết quả này, trình tự đầu dò được xác định là: 5’- ACAGCTGACAATCGCAATTG-3’. Kết quả kiểm tra lại bằng công cụ BLAST cho thấy đoạn trình tự này phù hợp cho đầu dò cần thiết kế do chúng không tạo liên kết bổ sung với đoạn ADN nào khác trong NCBI. Đồng thời, trình tự đầu dò
37
này khác với các trình tự đầu dò đã được nghiên cứu đối với loài này của Chong và các đồng nghiệp [22].
Hình 3.8. So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A. pseudogonyaulax với các loài Alexandrium
Các trình tự này sau đó được đặt sản xuất bởi công ty TOS (Nhật Bản) với điều kiện có gắn tín hiệu Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) vào đầu 5’ để phục vụ cho các thí nghiệm lai huỳnh quang tiếp theo.