Trên cơ sở đầu dò thiết kế được, các thí nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ kiểm tra cho 2 loài A. affine và A. pseudogonyaulax đã được tiến hành. Tuy nhiên do có sự khác biệt về đối tượng cũng như trình tự đầu dò nên yếu tố nhiệt độ lai cho từng đối tượng và đầu dò tương ứng đã được thử nghiệm.
Trên cơ sở các nghiên cứu trước đây, nhiệt độ lai trong kỹ thuật FISH thông thường chỉ từ 40 đến 50°C [18]. Mặt khác, việc bổ sung formamide nồng độ cao trong dung dịch đệm lai cũng sẽ giúp hạ nhiệt độ lai xuống thấp [18], nên các thử nghiệm về nhiệt độ lai trong nghiên cứu này được tiến hành trong dải nhiệt độ gồm 37°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C và 52°C.
38
Kết quả thử nghiệm cho thấy, có sự giống nhau về kết quả lai đối với cả 2 đầu dò trên hai đối tượng tảo khác nhau. Đối với loài A. affine, nhiệt độ lai phù hợp là 40°C và 43°C. Trong đó, tín hiệu huỳnh quang thu được rõ nét nhất ở tại 43°C (Hình 3.9). Độ nhạy của tín hiệu huỳnh quang tại nhiệt độ lai này lớn hơn rất nhiều so với tại nhiệt độ là 40°C. Trong khi đó, các mẫu có nhiệt độ lai khác đều cho tín hiệu huỳnh quang rất kém hoặc không có tín hiệu (phụ lục 6), mẫu đối chứng âm có sử dụng đầu dò A. affine cho việc nhận biết các loài gần gũi là
A. tamarense và A. catenella đều không có kết quả (không có tín hiệu). Như vậy, chúng tôi kết luận nhiệt độ lai thích hợp nhất đối với đầu dò được thiết kế cho loài A. affine là khoảng 43°C.
Hình 3.9. Tế bào A. affine dưới ánh sáng thường (trái) và phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với nhiệt độ lai 43°C
Hình 3.10.Tế bào A. pseudogonyaulax dưới ánh sáng thường (trái) và phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với nhiệt độ lai 43°C
39
Tương tự đối với loài A. pseudogonyaulax, kết quả thử nghiệm cũng đã cho thấy, đối với mẫu được lai ở nhiệt độ 43°C cho kết quả tốt nhất, hình ảnh sắc nét. Trong khi các mẫu còn lại, thử nghiệm ở các nhiệt độ 37, 40, 46, 49 và 52°C đều không thu được tín hiệu huỳnh quang khi hiển thị trên kính hiển vi. Điều này cho thấy với nhiệt độ không phù hợp, các phân tử đầu dò rất khó hoặc không lai được với trình tự đích (hình 3.10). Từ các hình ảnh thu được cũng cho thấy, với bước rửa cuối, việc loại bỏ những đầu dò dư thừa hay những trình tự gắn kết không hoàn toàn là thích hợp để thu được chỉ những đầu dò liên kết vững chắc với các trình tự đích và từ đó có thể có được những hình ảnh huỳnh quang tốt nhất. Như vậy nhiệt độ lai phù hợp trong thí nghiệm này thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của đầu dò theo tính toán thông thường. Kết quả này cũng trùng hợp với các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, việc bổ sung formamide vào trong dung dịch lai sẽ góp phần làm hạ thấp nhiệt độ lai trong lai tại chỗ FISH [18].
Như vậy với đầu dò được thiết kế, phép lai huỳnh quang tại chỗ đã được tiến hành thành công với hai loài vi tảo A.affine và A.pseudogonyaulax nuôi trong phòng thí nghiệm.
40
Nhằm hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật này, thử nghiệm lai huỳnh quang với các mẫu thu ngoài tự nhiên đã được tiến hành với nhiệt độ lai ở 43°C. Kết quả cho thấy, trong số 32 mẫu thu từ biển Cát Bà, đầu dò cho loài A. affine đã phát hiện ra 17 mẫu có sự hiện diện của loài này với mật độ tế bào khác nhau (Hình 3.11). Trong 15 mẫu còn lại, đầu dò không tìm được trình tự đích nào. Trong khi đó, một số phân tích thành phần của mẫu thì chỉ thu được rất ít thành phần loài của nhóm Alexandrium.
Hình 3.11. Lai đầu dò A. affine với mẫu tự nhiên
Các mũi tên chỉ các tế bào A. affine dưới ánh sáng thường (trái) và được phát hiện với màu xanh đặc trưng (phải).
Hình 3.12. Lai đầu dò A. pseudogonyaulax với mẫu tự nhiên
Các mũi tên chỉ các tế bào A. pseudogonyaulax dưới ánh sáng thường (trái) và được phát hiện với màu xanh đặc trưng (phải)
41
Tương tự, với đầu dò A. pseudogonyalax đã phát hiện 9 mẫu có trình tự đích cần tìm (hình 3.12). Trong các mẫu còn lại, đầu dò cũng không tìm thấy trình tự đích nào.
Từ các kết quả thử nghiệm cho thấy, đầu dò lai huỳnh quang của cả hai loài đều hoạt động tốt. Kỹ thuật lai huỳnh quang có thể được dùng để xác định nhanh hai loài tảo độc hại A. affine và A. pseudogonyaulax.
Quy trình lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) sử dụng đầu dò rARN có gắn tín hiệu FITC đối với hai loài A. affine và A. pseudogonyaulax được tổng hợp lại và đề nghị như sau:
Mẫu (5000-7000 tế bào/ml) được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC).
Cố định tế bào bằng 1ml dung dịch PBS (5x) có chứa paraformandehyde (4%), để mẫu trên đá lạnh trong 5 phút.
Ly tâm mẫu 3000vòng/phút trong 1 phút (4oC). Loại nước trong mẫu theo 2 bước:
- Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC).
- Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC).
Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh quang (50 pmol)).
Lai tế bào ở 43°C trong 5 phút. Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần:
- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC).
- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC).
42
Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu FITC 490 nm, hiển thị và chụp ảnh tế bào bằng camera DS Nikon. Tổng thời gian thao tác cho quá trình này đã được tính toán là khoảng 2,5 giờ. Điều này cho phép các thí nghiệm nghiên cứu phát hiện các loài vi tảo biển độc hại chính xác, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp phân tích truyền thống bằng hình thái trước đây.
43 KẾT LUẬN
Chúng tôi đã rút ra được một số kết luận chính sau từ nghiên cứu này:
1. Đã xác định trình tự gen vùng mã hóa cho đoạn D1 – D2 của tiểu phần lớn (LSU) thuộc ribosome của hai loài tảo giáp độc hại A. affine và A. pseudogonyaulax biển Việt Nam.
2. Đã thiết kế và thử nghiệm thành công hai đầu dò phân tử gắn tín hiệu huỳnh quang FITC phục vụ cho ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với hai loài tảo độc A. affine và A. pseudogonyaulax biển Việt Nam. Các đầu dò hoạt động tốt trên cả mẫu nuôi cấy và mẫu thu ngoài tự nhiên và các đầu dò đảm bảo tính đặc hiệu của loài.
3. Đã ứng dụng thành công kỹ thuật FISH trong việc xác định nhanh chóng và chính xác 2 loài tảo độc hại biển Việt Nam nói trên, làm cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp quan trắc, đánh giá nhanh môi trường biển, nghiên cứu dự đoán diễn biến thủy triều đỏ tại các vùng ven biển Việt Nam sau này.
44 KIẾN NGHỊ
Cần nghiên cứu và thiết kế thêm các đầu dò nhằm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang để nhận diện nhanh, nhiều loài tảo biển độc hại khác trong các vùng biển và ven biển Việt Nam.
Cần có các nghiên cứu, ứng dụng các kỹ thuật di truyền trong việc quan trắc, phân loại nhanh đối với các loài vi tảo biển Việt Nam nhằm có thể theo dõi thường xuyên, đánh giá nhanh những biến đổi môi trường gây thủy triều đỏ do tảo biển độc hại gây ra, hạn chế thiệt hại trong nuôi trồng thủy sản ven biển.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường (2005), “Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down”, Tạp chí y học thực hành, 11, tr. 9-11.
2. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường, Nguyễn Thị Quỳnh Thơ (2006), “Chẩn đoán trước sinh hội chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối”, Tạp chí nghiên cứu y học, 1, tr. 4-8.
3. Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại”,
Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ V, Quyển 4 - Sinh học và nguồn lợi biển, tr. 261-268.
4. Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57, tr. 57-62.
5. Vũ Đình Quang, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Đinh Thị Hồng Nhung, Phùng Tuyết Lan, Trần Đức Hậu, Trần Ngọc Sơn, Nguyễn Thanh Liêm (2010), “Đánh giá sự khuếch đại gen NMYC trên bệnh nhân Neuroblastoma”, Tạp chí Nhi khoa, 3 (3), tr. 358-363.
6. Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”,Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, tháng 2, tr. 253-258.
46
7. Chu Văn Thuộc (2002), “Nghiên cứu thành phần loài, phân bố và thăm dò khả năng gây hại của một số loài tảo độc hại (harmful algae) thuộc ngành tảo giáp (Dinophyta) ở vùng cửa sông, ven biển miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ ngành sinh học, Viện nghiên cứu hải sản.
Tiếng Anh
8. Abé, T. H. (1967a), “The armoured Dinoflagellata: II. Prorocentridae and Dinophysidae (A)”, Publ. Seto Mar. Biol., 14(5), pp. 369 - 389.
9. Abé, T. H. (1967b), “The armoured Dinoflagellata: II. Prorocentridae and Dinophysidae (B), Dinophysis and its allied genera”, Publ. Seto Mar. Biol., 15(1), pp. 37 - 78.
10. Adachi M., Sako Y., Ishida Y. (1996), “Analysis of Alexandrium (Dinophyceae) species using sequences of the 5,8S ribosomal DNA and internal transcribed spacer regions”. J. Phycol, 32, pp. 424–432.
11. Alfreider A., Pernthaler J., Amann R., Sattler B., Glöckner F. O., Wille A., and Psenner R. (1996), “Community analysis of the bacterial assemblages in the winter cover and pelagic layers of a high mountain lake by in situ
hybridization”, Appl. Environ. Microbiol, 62, pp: 2138 - 2144.
12. Amann R., Fuchs B. M., Beherens S. (2001), “The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridization”, Curr. Opin. Biotechnol., 12, pp. 231 – 236.
13. Andersen, G. (2005), “Traditional Microalgae Isolation Techniques, Algal cuturing techniques”, Phycologycal society of America, 578p.
14. Anderson, P. (1996), “Design and implementation of some harmful agal monitoring system”, IOC Technical Series, 44, UNESCO.
47
15. Anderson, D.M. (1995), “Identification of harmful algal species using molecular probes, an emerging technology”, Harmful Marine Algal Blooms, Lavoiser Science Publishers, pp. 3–13.
16. Balech, I. (1995), “The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellata)”, Trans. Am. Microscop. Soc., 113, pp. 216 - 220.
17. Baoyu Z., Guofu C., Guangce W., Douding L. (2010), “Identification of two Skeletonema costatum-like diatoms by fluorescence in situ hybridization”.
Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 28(2), pp. 310 - 314.
18. Benedetta B., Danilo E., Monica G., Erasmo N. (2006), “Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects”,
Appl. Microbiol. Biotechnol., 73, pp. 485 – 494.
19. Bouvier T., Del G. (2003), “Factors influencing the detection of bacterial cells using fluorescence in situ hybridization (FISH)”, FEMS Microbiol. Ecol., 44, pp. 3 – 15.
20. Cho E. S., Hur H. J., Byun H. S., Lee S. G., Rhodes L. L., Jeong C. S. and Park J. G. (2002), “Monthly monitoring of domoic acid producer Pseudo- nitzschia multiseries (Hasle) Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea. Bot. Mar., 45, pp. 364 - 372.
21. Choi, B. K. (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis”. Infect. Immun., 62, pp. 1889 – 1895.
22. Choong J. K., Yoshihiko S. (2005), “Molecular identification of toxic
Alexandrium tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”,
48
23. Deere, D. (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett. Appl. Microbiol., 27, pp. 352 – 356.
24. DeLong, E. F. (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells”, Science, 243, pp. 1360 – 1363.
25. DeLong E. F., Taylor L. T., Marsh T. L. and Preston C. M. (1999), “Visualization and enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization”,
Applied and Environmental Microbiology, 65, pp. 5554 - 5563.
26. Felske, A. (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch grassland soils”, Appl. Environ. Microbiol., 64, pp. 4588 – 4590. 27. Fuchs B. M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R. (2000), “In situ
accessibility of Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl. Environ. Microbiol., 67, pp. 961 – 968.
28. Gersdorf H. (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from patients with advanced periodontitis”, J. Clin. Microbiol., 31, pp. 941 – 946.
29. Gersdorf, H. (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram-negative an aerobes in subgingival plaque samples”,
FEMS Immunol. Med. Microbiol., 6, pp. 109 – 114.
30. Glockner, F. O. (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria”, Syst. Appl. Microbiol., 19, pp. 403 – 406.
31. Glöckner F. O., Fuchs B. M. and Amann R. (1999), “Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl. Environ. Microbiol., 65, pp. 3721 - 3726.
49
32. Hallegraeff G. M., Anderson D. M., Cembella A. D., Enevoldsen H. O. (1995), “Manual on harmful marine microalgae, IOC Manual and Guides”,
UNESCO, 33, 794p.
33. Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 818 – 825.
34. Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ
hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J. Clin. Microbiol. 38, pp. 818 – 825.
35. Hougaard D. M., Hansen H. and Larsson L. I. (1997), “Non-radioactive in situ hybridization for mRNA with emphasis on the use of oligodeoxynucleotide probes”, Histochem. Cell Biol., 108, pp. 335 - 344. 36. Inacio J., Beherens S., Fuchs B. M., Fonseca A., Spencer M. I., Amann R.
(2003), “In situ accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3- labeled oligonucleotide probes comprising the D1 and D2 domains”, Appl. Environ. Microbiol., 69, pp. 2899 – 2905.
37. Jansen, G. J. (2000), “Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 814 – 817.
38. Jeffrey M. L. and Robert H. S. (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past, present and future”, Journal of Cell Science, 116, pp. 2833 – 2838. 39. Johannes Z., Wolfgang L., Karl H. S. (2001), “DNA polynucleotide probes
generated from representatives of the genus acinetobacter and their application in fluorescence in situ hybridization of environmental samples”,
System. Appl. Microbiol., 24, pp. 238 – 244.
40. Kagiyama, N. (1993), “A novel fluorescent method for in situ hybridization”,
50
41. Kempf, V. A. (2000), “Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 830 – 838.
42. Kenzaka, T. (1998), “rRNA targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial community structure in river water”, Microbiology, 144, pp. 2085 – 2093.
43. Kim C. J., Kim C. H., Sako Y. (2005), “Development of molecular identification method for genus Alexandrium (Dinophyceae) using whole- cell FISH”, Marine Biotechnology, 7, pp. 215 – 222.
44. Langendijk P. S, Schut F., Jansen G. J., Raangs G. C., Kamphuis G. R., Wilkinson M. H. F., Welling G. W. (1995), “Quantitative fluorescence in situ
hybridization of Bifidobacterium spp. with genus-specific 16S rRNA- targeted probes and its application in faecal samples”, Appl. Environ. Microbiol., 61, pp. 3069 – 3075.
45. Larsen J. and Nguyen N. L. (2004), “Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters”, Opera Botanica, 140, 216p.
46. Llobet B., Rosselló M., and Amann R. (1998), “Microbial community composition of wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ
hybridization”, Appl. Environ. Microbiol., 64, pp. 2691 - 2696.
47. Manuelidis L., Langer P. R. and Ward D. C. (1982), “High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes”, J. Cell Biol.,