ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI

MỤC LỤC MỞ ĐẦU Phần 1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI 1.1. Chất thải nguy hại 1.2. Quản lý chất thải nguy hại tại Việt Nam 1.3. Xử lý sinh học chất thải nguy hại Phần 2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌ CHẤT THẢI NGUY HẠI 2.1. Vi sinh vật và kỹ thuật phân tử ứng dụng trong sử lý sinh học chất thải nguy hại 2.2. Tiềm năng sử dụng các phương pháp sinh thái học vi sinh vật mức độ phân tử để xử lý sinh học chất thải nguy hại Phần 3 KẾT LUẬN

MỤC LỤC MỞ ĐẦU Phần 1.1 1.2 1.3 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI Chất thải nguy hại Quản lý chất thải nguy hại Việt Nam Xử lý sinh học chất thải nguy hại Phần ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌ CHẤT THẢI NGUY HẠI 2.1 Vi sinh vật kỹ thuật phân tử ứng dụng sử lý sinh học chất thải nguy hại 2.2 Tiềm sử dụng phương pháp sinh thái học vi sinh vật mức độ phân tử để xử lý sinh học chất thải nguy hại Phần KẾT LUẬN TAI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Cơng nghệ sinh học định nghĩa “ứng dụng nguyên lý kỹ thuật khoa học việc xử lý vật liệu tác nhân sinh học để cung cấp sản phẩm phục vụ” (Cator,2000) Trong lịch sử, công nghệ sinh học sử dụng nấm men để lên men bia, rượu, váuwr dụng vi khuẩn để tạo sữa chua Năm 1972, năm sinh công nghệ DNA tái tổ hợp đưa công nghệ sinh học tới tầm cao hình thành cơng nghiệp tiến công nghệ sinh học thực ghi nhận Trong vòng năm khám phá kỹ thuật DNA tái tổ họp, vi sinh vật chuyển gen (GMOs) tạo insulin nguời, interferon, hocmon sinh trưởng người Ngày nay, công nghệ DNA tái tổ hợp sản phẩm GMOs ứng dụng rông rãi công nghệ sinh học môi truờng (Glick Pasternark,1988; Cowan,2000) Xử lý sinh học chất thải nguy hại lĩnh vực phát triển mạnh công nghệ sinh học môi trường Sử dụng xử lý sinh học chất thải nguy hại để làm môi trường phổ biến nhờ chi phí thấp người chấp nhận Thực sự, xử lý sinh học chất thải nguy hại đạt hiệu cao, nhanh hỗ trợ kỹ thuật phân tử vốn phát triển nhiều lĩnh vực khác công nghệ sinh học Những năm 1990 thập kỷ cho sinh thái vi sinh vật phân tử phát triển Việc áp dụng kỹ thuật phân tử giúp nhà khoa học nhận cộng đồng vi sinh vật mơi trường tụ nhiên phục vụ tốt nhiều phương pháp nuôi cấy truyền thống Sử dụng phương pháp sinh thái học phân tử, tách chiết DNA trực tiếp từ mẫu môi trường, điên di gel gradient biến tính (DGGE), phương pháp PCR, phương pháp lai phân tử, nghiên cứu quần thể vi sinh vật có khả phân hủy chất thải môi trường Những phương pháp hứa hẹn hiểu biết điều khiển tốt trình cơng nghệ sinh học mơi trường, nhờ cho phép việc xử lý sinh học môi trường bị ô nhiễm chất thải độc hiệu tốn Phần 1.1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI Chất thải nguy hại 1.1.1.Định nghĩa - Theo UNEP Chất thải độc hại chất thải (khơng kể chất thải phóng xạ) có hoạt tính hóa học, có tính độc hại, cháy nổ, ăn mịn gây nguy hiểm gây nguy hiểm đến sức khỏe môi trường hình thành tiếp xúc với chất thải khác Chất thải không bao gồm định nghĩa trên: + Chất thải phóng xạ xem chất thải độc hại không bao gồm định nghĩa hầu hết quốc gia quản lý kiểm sốt chất phóng xạ theo qui ước, điều khoản, qui định riêng + Chất thải rắn sinh hoạt gây nhiễm mơi trường chứa chất thải nguy hại nhiên quản lý theo hệ thống chất thải riêng Ở số quốc gia sử dụng thu gom tách riêng chất thải nguy hại rác sinh hoạt - Theo Luật bảo vệ môi trường CTNH chất thải chứa yếu tố độc hại, phóng xạ, dễ cháy, dễ nổ, dễ ăn mịn, dễ lây nhiễm, gây ngộ độc đặc tính nguy hại khác (khoản 11, điều 3, chương Luật Bảo Vệ Môi Trường) QLCTNH gồm hoạt động liên quan đến việc phòng ngừa, giảm thiểu, phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ, xử lý (kể tái chế, thu hồi), tiêu huỷ CTNH (khoản 1, điều 2, chương Thơng Tư 12/2006/TT-BTNMT) 1.1.2.Đặc tính chất thải nguy hại - Chất có khả gây cháy: chất có nhiệt độ bắt cháy 12,5; chất ăn mịn thép Dạng thường gặp chất có tính axit bazo… - Chất có tính độc hại: Những chất thải mà thân có tính độc đặc thù xác định qua bước kiểm tra Chất thải phân tích thành phần pha hơi, rắn lỏng Khi có thành phần hóa học lớn tiêu chuẩn cho phép chất thải xếp vào loại chất thải nguy hại Chất độc hại gồm: Các kim loại nặng thủy ngân, cadmium, asenic, chì muối chúng; dung môi hữu toluen, benzen, axeton, cloroform…; Các chất có hoạt tính sinh học (thuốc sát trùng, trừ sâu, hóa chất nơng nghiệp…); Các chất hữu bền điều kiện tự nhiên tích lũy mơ mỡ đến nồng độ định gây bệnh (PCBs: Poly Chlorinated Biphenyls) - Chất có khả gây ung thư đột biến gen: Dioxin (PCDD), Asen, cadmium, benzen, hợp chất hữu chứa clo… 1.1.3.Nguồn gốc phát sinh chất thải nguy hại Theo khoảng 2, Quyết định số 23/2006/QĐ-BTNMT, ngày 26/12/2006, Chất thải nguy hại phát sinh từ 19 nhóm: 1) Chất thải từ ngành thăm dị, khai thác, chế biến khống sản, dầu khí than 2) Chất thải từ ngành sản xuất hố chất vơ 3) Chất thải từ ngành sản xuất hoá chất hữu 4) Chất thải từ ngành nhiệt điện trình nhiệt khác 5) Chất thải từ ngành luyện kim 6) Chất thải từ ngành sản xuất vật liệu xây dựng thuỷ tinh 7) Chất thải từ trình xử lý, che phủ bề mặt, tạo hình kim loại vật liệu khác 8) Chất thải từ trình sản xuất, điều chế, cung ứng, sử dụng sản phẩm che phủ (sơn, véc ni, men thuỷ tinh), chất kết dính, chất bịt kín mực in 9) Chất thải từ ngành chế biến gỗ, sản xuất sản phẩm gỗ, giấy bột giấy 10)Chất thải từ ngành chế biến da, lông dệt nhuộm 11) Chất thải xây dựng phá dỡ (kể đất đào từ khu vực bị ô nhiễm) 12) Chất thải từ sở tái chế, xử lý, tiêu huỷ chất thải, xử lý nước cấp sinh hoạt công nghiệp 13) Chất thải từ ngành y tế thú y (trừ chất thải sinh hoạt từ ngành này) 14) Chất thải từ ngành nông nghiệp, lâm nghiệp thuỷ sản 15) Thiết bị, phương tiện giao thông vận tải hết hạn sử dụng chất thải từ hoạt động phá dỡ, bảo dưỡng thiết bị, phương tiện giao thơng vận tải 16) Chất thải hộ gia đình chất thải sinh hoạt từ nguồn khác 17) Dầu thải, chất thải từ nhiên liệu lỏng, chất thải dung môi hữu cơ, môi chất lạnh chất đẩy (propellant) 18) Các loại chất thải bao bì, chất hấp thụ, giẻ lau, vật liệu lọc vải bảo vệ 19) Các loại chất thải khác 1.1.4.Phân loại Trên thực tế, có nhiều hệ thống phân loại chất thải nguy hại Hệ thống phân loại theo tiêu chuẩn Việt Nam phân loại theo đặc tính chất thải, TCVN 6706:2009 chia CTNH thành nhóm sau: Bảng 1: Hệ thống phân loại CTNH theo TCVN 6706:2009 Mã số TT Nhóm loại Mơ tả tính chất nguy hại BASEL Chất thải dễ bắt lửa, dễ cháy (C) 1.1 H 1.2 H 4.1 Chất thải lỏng dễ cháy Chất thải dễ cháy 1.3 H 4.2 Chất thải tự cháy 1.4 H 4.3 H8 2.1 Chất thải có tính axit 2.2 Chất thải tạo khí dễ cháy Chất thải gây ăn mòn (AM) Chất thải có tính ăn mịn H1 Chất thải dễ nổ (N) Chất thải dễ bị xi hóa (OH) Chất thải lỏng có nhiệt độ bắt cháy 60oC Chất thải không chất lỏng, dễ bốc cháy bị ma sát điều kiện vận chuyển, bị ẩm, bị ướt xảy tự phản ứng bốc cháy, cháy nhiệt độ áp suất khí Chất thải có khả tự bốc cháy tự nóng lên điều kiện vận chuyển bình thường, tự nóng lên tiếp xúc với khơng khí có khả bốc cháy Chất thải gặp nước, tạo phản ứng giải phóng khí dễ cháy khí tự cháy Chất thải (bằng phản ứng hóa học) gây ăn mòn tiếp xúc với vật dụng, bình chứa, hàng hóa mơ sống động vật, thực vật Chất thải lỏng có pH nhỏ Chất thải thể lỏng ăn mịn thép với tốc độ lớn 6,35 mm/năm nhiệt độ 55oC Là chất rắn lỏng hỗn hợp rắn – lỏng tự phản ứng hóa học tạo nhiều khí, nhiệt độ áp suất gây nổ 4.1 H 5.1 4.2 H 5.2 Chất thải có chứa clorat, pecmanganat, Chất thải chứa tác nhân oxy peoxyt vô cơ, nitrat chất oxy hóa hóa vơ khác tiếp xúc với khơng khí, tích lũy oxy kích thích cháy chất vật liệu khác Chất thải chứa peoxyt hữu Chất thải hữu có cấu trúc phân tử - O – O - không bền với nhiệt độ nên bị phân hủy tạo nhiệt nhanh Chất thải gây độc cho người sinh vật (Đ) 5.1 H 6.1 5.2 H 11 5.3 H 10 H 12 H 6.2 Chất thải gây độc tính cấp Chất thải có chứa chất độc gây tử vong tổn thương trầm trọng tiếp xúc qua đường tiêu hóa, hơ hấp qua da với liều nhỏ Chất thải có chứa chất gây ảnh hưởng Chất thải gây độc chậm độc chậm mãn tính, gây ung thư mãn tính tiếp xúc qua đường tiêu hóa, hơ hấp qua da Chất thải chứa chác thành phần mà tiếp xúc với khơng khí tiếp xúc với nước giải phóng khí độc người sinh vật Chất thải độc hại cho hệ sinh Chất thải chứa thành phần mà thái (ĐS) gây tác động có hại nhanh từ từ mơi trường thơng qua tích lũy sinh học và/hoặc gây ảnh hưởng đến hệ sinh vật Chất thải lây nhiễm bệnh (LN) Chất thải có chứa vi sinh vật sống độc tố chúng, biết nghi ngờ có mầm bệnh gây bệnh có Chất thải sinh khí độc người cho gia súc 1.1.5.Ảnh hưởng chất thải nguy hại Tác động vài chất thải nguy hại đến môi trường:  Khí SO2 + SO2 chất khí khơng màu, có mùi hăng cay nồng độ khí 1ppm Sunfurơ nguồn ô nhiễm khí gây ảnh hưởng tới sức khỏe người, độ bền vật liệu nhân tố gây nên mưa axit theo cấu sau: SO2 + H2O > H2SO3 H2SO3 -> H+ + HSO3- > 2H+ + SO32SO32- + H2O > H2SO4 + Hơi axit gặp lạnh ngưng tụ thành sương mù axit, chúng tồn lơ lửng không khí hấp thụ thêm nước tạo thành giọt axit lỗng H2O - H2SO4 ngun nhân gây nên mưa axit + SO2 tương đối nặng nên thường gần mặt đất, ngang với tầm sinh hoạt người Sunfurơ có khả hồ tan nước cao khí gây nhiễm khác, nên dễ phản ứng với quan hô hấp người động vật Khi hàm lượng thấp SO2 làm sưng niêm mạc, hàm lượng cao (>0,5 mg/m3) SO2 gây tức thở, ho, viêm loét đường hơ hấp + Khi có mặt đồng thời SO2 SO3, cần nồng độ thấp chúng có tác động hợp lực, phản ứng sinh lý phát sinh mạnh so với phản ứng chất riêng biệt, chí gây co thắt phế quản mạnh nồng độ cao dẫn đến nguy hiểm chết người  Các hợp chất chứa Halogen + Khi hít phải Cl, vào phế quản, phế nang Clo tiếp xúc với chất nhày ướt mô sống thể, tạo HClO vượt qua màng tế bào phá hủy tế bào, Cl tạo nên dẫn suất nitơ clo hóa + Các hợp chất khí chứa halogen cần nồng độ nhỏ gây độc, nhiễm độc nặng có khả gây nhiễm phạm vi rộng lớn + HF gây bệnh sụn xương, viêm phế quản, tổn thương HF hạn chế độ sinh trưởng cây, làm rụng quả, lép + HCl làm giảm độ bóng mỡ lá, gây thương tổn cho trồng, tổn thương vật nuôi làm giảm lượng sữa  Các hợp chất hữu + Các hợp chất hữu thường độc với thể người vật Một số hợp chất hữu Bezen PAH (hợp chất cacbuahydro thơm đa nhân) nguyên nhân gây bệnh ung thư + Một số chất hữu halogen xúc tác cho trình phân hủy ozon tầng bình lưu Một số chất hữu hoạt tính khác, lại xúc tiến cho q trình phân hóa vật chất đặc biệt số chất hữu gây ô nhiễm mùi mecaptan alđêhyt Mùi gây cảm giác khó chịu đơi cịn kèm theo nhiễm độc nguyên nhân gây bệnh cho người + Dioxin furan chất độc Ở hàm lượng thấp gây bệnh da, phụ nữ có thai tiếp xúc với với chất sinh thiếu tháng quái thai Nhiễm độc nặng gây nên bệnh gan, máu, kể ung thư dẫn đến tử vong Động vật bị nhiễm Dioxin Furan giảm trọng lượng tới 50% chết vòng – tuần  Kim loại nặng + Kim loại nặng khái niệm để kim loại có nguyên tử lượng cao, thường có độc tính sống, thường có liên quan đến vấn đề ô nhiễm môi trường Nguồn gốc phát thải kim loại nặng tự nhiên (như asen-As), từ hoạt động người, chủ yếu từ công nghiệp (các chất thải công nghiệp) từ nông nghiệp, hàng hải (tràn dầu)… + Việc sử dụng nhiều loại chế phẩm công nông nghiệp làm nước đất nhiều vùng, cặn lắng dịng sơng, bị nhiễm kim loại nặng mức độ cao + Có số hợp chất kim loại nặng thụ động đọng lại đất, song có số hợp chất hoà tan tác động nhiều yếu tố khác nhau, độ chua đất, nước mưa Điều tạo điều kiện để kim loại nặng phát tán rộng vào nguồn nước ngầm, nước mặt gây ô nhiễm đất + Một số chất tẩy rửa gia dụng có chứa tác nhân tạo phức mạnh (như EDTA, NTA) thải góp phần làm tăng khả phát tán kim loại nặng + Các kim loại nặng có mặt nước, đất qua nhiều giai đoạn khác trước sau vào chuỗi thức ăn người Chẳng hạn vi sinh vật chuyển thuỷ ngân (Hg) thành hợp chất metyl thủy ngân (CH3)2Hg, sau qua động vật phù du, tơm, cá mà thuỷ ngân vào thức ăn người Sự kiện ngộ độc hàng loạt Vịnh Manimata (Nhật Bản) năm 1953 minh chứng rõ trình nhiễm thủy ngân từ cơng nghiệp vào thức ăn người + Khi nhiễm vào thể, kim loại nặng tích tụ lại mơ Đồng thời với q trình thể lại đào thải dần kim loại nặng Nhưng nghiên cứu cho thấy tốc độ tích tụ kim loại nặng thường nhanh tốc độ đào thải nhiều Thời gian để đào thải nửa lượng kim loại nặng khỏi thể xác định khái niệm chu kỳ bán thải sinh học, ví dụ với thuỷ ngân chu kỳ vào khoảng 80 ngày, với cadimi 10 năm Điều cho thấy cadimi tồn lâu thể bị nhiễm phải Bảng 2: Tác hại số kim loại nặng Độc tố kim loại Mức độ nguy Triệu chứng/Hậu lâu dài nặng hại Arsenide – Asen XXXXX (III) Arsenide – Asen X (V) Lead – Pb – Chì XXX Cadmium – Cd – XXX Cadmi Nickel – Ni – XX Niken Nickel – Ni – XX Niken Selenium – Se XX Antimony – Sb XX Barium – Ba – Bari Cyanide (free) – Syanua Chromium – Cr(VI) – Crôm Manganese – Mn – Mangan Iron – Fe – Sắt Floride – F – Flo Copper – Cu – Đồng Hg – Thủy ngân Aliuminium – Al – Nhôm Zinc – Zn – Kẽm Trẻ em: Chậm phát triển thể chất, trí tuệ tinh thần Người lớn: Gây hại thận tim mạch Ngắn hạn: Tiêu chảy, tổn thương gan Dài hạn: Gây bệnh thận, tim mạch, gan Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan Rụng tóc, móng tay chân, ngón tay, ngón chân vấn đề tim mạch Tăng Cholesterol máu giảm đường huyết XX Tăng huyết áp XX Nguy hại hệ thần kinh XX Gây dị ứng, mẩn ngứa X X Chuyển màu nước từ nâu – đen gây cặn đen vị Màu cam đỏ nước, có váng sắt, vị Gây xỉn răng, ố vàng X Vị tanh, váng màu xanh X Gây xỉn da, chấm nâu lòng trắng mắt X Nước đổi màu X Vị X Sự kiện bị ngộ độc cadimi giới kiện xảy Nhật Bản với bệnh Itai - Itai tiếng có liên quan đến nhiễm nguồn nước cadimi Cadimi dễ dàng tạo tương tác với protein chuyển vào gan, thận Thuỷ ngân chì lại dễ vào hệ thần kinh tạo thành hợp chất alkyl lipit Các kim loại nặng chì, cadimi tập trung xương, ức chế emzym axit 5amino-levulin gây bệnh thiếu máu Cadimi có khả đuổi kẽm khỏi số emzym gây bệnh máu heamatopoiesis, v.v… 1.2 Quản lý chất thải nguy hại Việt Nam Nước ta trình chuyển đổi từ kinh tế kế hoạch tập trung sang kinh tế thị trường Với mục tiêu phấn đấu đến năm 2020, Việt Nam trở thành nước cơng nghiệp hóa tất yếu thị hóa thành phố lớn Theo dự báo, đến năm 2020 tỷ lệ thị hóa nước ta đạt 45% tương ứng với quy mô dân số đô thị năm 2020 khoảng 46 triệu người Với quy mô đô thị hóa nước ta, gia tăng dân số cơng nghiệp hóa lượng chất thải nói chung chất thải nguy hại nói riêng tăng lên nhanh chóng Việc xử lý chất thải nguy hại áp lực lớn với công tác bảo vệ môi trường nước ta tương lai Theo số liệu điều tra Cục Môi trướng, riêng tổng lượng chất thải rắn nguy hại (CTRNH) phát sinh hàng năm chủ yếu khu vực kinh tế trọng điểm Hà Nội, Hải Phịng, Quảng Ninh phía Bắc, thành phố Hồ Chí minh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu phía Nam Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi miền Trung Trong đó, CTRNH phát sinh khu vực kinh tế trọng điểm phía Nam khoảng 80.332 tấn/ năm, lớn gấp lần khu vực phía Bắc lớn gấp 20 lần lượng phát sinh khu vực miền Trung Theo Thống kê Cục Môi trường, tổng lượng CTRNH phát sinh hàng năm toàn quốc 152.000 tấn, bao gồm chất thải ngành công nghiệp nhẹ (60.000 tấn), hóa chất (45.000 tấn), khí luyện kim (26.000 tấn), y tế (10.000 tấn), chất thải sinh hoạt đô thị (5.000 tấn) chất thải chế biến thực phẩm, điện - điện tử có số lượng số ngành (2.000 tấn) lại chứa chất hữu khó phân hủy PCB kim loại nặng, chất đặc biệt nguy hại tới sức khỏe người môi trường Bên cạnh chất thải ngành có chất thải từ thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tồn lưu Theo số liệu Cục Môi trường sở công nghiệp địa phương, năm 2000 - 2001 , tổng lượng thuốc BVTV tổn lưu phạm vi 61 tỉnh/ thành phố khoảng 300 tấn, thuốc BVTV dạng lỏng 9.7.374 lít thuốc BVTV dạng bột 109.145 kg; bao bì chứa thuốc BVTV 2.137.850 (bao gồm hộp, chai lọ) hình kết có sử dụng phương pháp phân rử để xác định mối quan hệ phát sinh loài quần thể vi khuẩn phân hủy hydrocacbon Để phân tích quần thể vi sinh vật, số kết hợp kỹ thuật phân tử áp dụng, như: Điện chuyển gel gradient biến tính (DGGE), PCR, TRFLP, lai acid nucleic (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) (Hazen Jimenez,1988; Harry cộng sự, 2000) Những kỹ thuật có thuận lợi phương pháp truyền thống vốn thiếu tính đặc hiệu nhạy cảm cần thiết việc điều khiển xử lý sinh học chất thải nguy hại Các phương pháp dựa phân lập xác định acid nucleic cá thể mục tiêu khắc phục vấn đề Chúng có tiềm có ích cho việc phát điều khiển trì thường xuyên phân tán vi sinh vật tự nhiên vi sinh vật phóng thích vào môi trường (Atlas cộng sự,1992) Sự kết hợp phương pháp phụ thuộc vào nuôi cấy ( phương pháp truyền thống) không phụ thuộc vào nuôi cấy kỹ thuật phân tử, hóa sinh cho ta đường linh động để thiết lập đa dạng vi sinh vật mẫu mơi trường Tính đặc hiệu cao, nhạy phương pháp PCR phát trình tự DNA đặc hiệu mẫu mơi trường phức tạp đóng góp quan trọng vào bước tiến tìm hiểu vi sinh học mơi trường (Holben Tjedje,1998; Holben cộng sự,1988; Pickup,1991; Bej Mahbubani,1992; Amann cộng 1995; Onuki cộng sự, 2000) Mục đích nhà khoa học mơi trường khơng để hạn chế chất ô nhiễm, mà xa để làm vùng bị ô nhiễm để tránh lan truyền dần chất ô nhiễm tới xung quanh bề mặt nguồn nước Hình1 : Tách chiết DNA Các kỹ thuật tách chiết DNA trực tiếp đóng phần quan trọng vào việc nghiên cứu sinh thái vi sinh vật Chúng hữu ích để xác định có mặt vi khuẩn gốc vi khuẩn đưa vào môi trường, GMOs GEMs sinh vật chuyển gen (Torsvik,1980; Steffan cộng sự, 1988; Sommerville cộng sự, 1989; Tsai Olson,1991; Saano Lindstrom,1995) Với phân đoạn lớn, thường khoảng 90-99% tế bào vi sinh vật có mẫu mơi trường nuôi cấy môi trường vi sinh Những vi sinh vật tồn thu hồi lại phần từ mẫu môi trường nhờ phương pháp truyền thống Việc phát chúng thông qua kỹ thuật phân tử thường yêu cầu phải có hiểu biết thực sintêh thái vi sinh vật môi trường Hai kỹ thuật khác để phân lập DNA từ đất thực hiện: - Phương pháp tách chiết tế bào giải trình tự, - Phương pháp phân tích trực tiếp Hình 2: Trong kỹ thuật đầu, việc tách chiết tế bào vi sinh vật từ đất thực trước chiết rút DNA, công nghệ thứ DNA tách chiết trực tiếp từ đất Hầu hết phương pháp miêu tả dựa tách chiết DNA từ môi trường nước, đất, trầm tích (Ogram cộng sự, 1987; Atlas, 1992; Saano Lindstrom,1995; Zhou cộng ,1996) Các phương pháp có mục đích: lượng DNA tinh khiết tách chiết có hàm lượng cao thuận lợi cho việc xác định sử dụng sinh học phân tử Lượng DNA tinh khiết tách chiết nhận biết gel agarose so sánh với ngân hàng DNA Nồng độ DNA biểu thị nanogram/ gram trầm tích (đất) khơ nanogram/ml nước (Pickup,1991) Kỹ thuật phân tích trực tiếp thuận lợi cho việc thu hồi DNA từ vi sinh vật hấp thụ mạnh bị đào thải phương pháp tách chiết tế bào Kỹ thuật phân tích trực tiếp gặp phải trở ngại mùn độ pH đất tách chiết Tất phương pháp có mục đích thu lượng DNA cao đủ độ tinh khiết cho việc phân tích phân tử phương pháp lai DNA-DNA, phương pháp phân tích đa dạng chiều dài đoạn giới hạn cuối (TRFLP) phương pháp khuyếch đại phản ứng chuỗi polymerase Các hợp chất mùn đất sét nhiều mẫu đất ức chế q trình phân tích, có mặt chất keo collid làm cho việc tách chiết DNA gặp vấn đề Vì lý này, thêm bước tinh sơ đồ quy trình phân lập DNA cần thiết (Sambrook cộng sự,1989; Dijkmans cộng sự,1993; Volossionk cộng sự,1995) Việc phân lập DNA điển hình gồm bước sau (Sambrook cộng sự,1989; Pickup,1991): Phá hủy tế bào; Tách DNA từ thành phần tế bào polysaccharit protein; Tinh DNA chiết rút từ phần đất thành phần axit humic, đất sét, ion; Kết tủa DNA Như cơng bố 300ng DNA gần 100 ng DNA chiết rút từ 10 g đất (Saano Lindstrom,1995) Một vài phương pháp thu hồi DNA kết chuyển đổi bảng Q trình tinh kết hợp siêu li tâm CsCl-EtBr , hydroxylapatite, sắc ký lực, chiết tách chloroform/ phenol, kết tủa etanol, thẩm tách, xử lý polyvinylpoly-pyrrolidone (PVPP) (Sambrook cộng sự,1989; Pickup,1991) Trong nhiều trường hợp, sơ đồ tinh tiêu chuẩn không thao tác với mẫu môi trường, điều kiện yêu cầu phải thích ứng với cách phân tích riêng biệt Một số tạp chí gần cho thấy tiến của phát triển phương pháp phân lập DNA (Holben cộng sự,1988; Sayler Layton,1990; Pickup,1991) Bảng 4: PCR- phản ứng chuỗi polymerase Sử dụng phương pháp PCR vi sinh học môi trường công bố Bej Mahbubani (1992) Sự phát triển kỹthuật khám phá phương pháp luận sinh học phân tử Phương pháp sử dụng nhiều phòng thí nghiệm liên tâm đến sinh học phân phân tử từ việc chuẩn đoán đến nghiên cứu tinh khiết Với tính đặc hiệu cao, nhạy PCR phát trình tự DNA đặc trưng mẫu mơi trường hỗn hợp, điều đóng góp hữu ích vào tiến hiểu rõ vi sinh vật học môi trường lĩnh vực cần nghiên cứu ( phát bệnh vi sinh vật gây ra, chuẩn đoán bệnh, phát đột biến, hình thành mẫu dị DNA sinh sản vơ tính từ sản phẩm PCR) (Pillai cộng sự, 1991; Toze,2000; Watson Blackwell,2000) Ứng dụng quan trọng thu từ phương pháp nâng cao khả phát đầu dò chuỗi gen đặc trưng Bằng cáh khuyếch đại chỗi mục tiêu, PCR tăng khả phát trình tự gặp hỗn hợp DNA tách từ mẫu môi trường PCR kỹ thuật khuyếch đại DNA lớn, hứa hẹn phương pháp đặc hiệu, nhạy để kiểm soát cá vi sinh vật mơi trường (Steffan Atlas,1991) Một q trình PCR điển hình địi hỏi số lượng chu trình khuyếch đại chuỗi DNA đặc trưng Mỗi chu trình gồm giai đoạn: Biến tính, bắt cặp, tổng hợp Một chu kỳ thường kéo dài đến phút Mỗi bước suốt trinh khuyếch đại thường thực nhờ thiết bị block nhiệt cài đặt trương trình tự động Nhìn chung, phương pháp PCR gồm chu kỳ lặp lại nhiệt độ cao với nhiệt độ biến tính DNA, nhiệt độ tương đối thấp cho phép primer gắn hoàn toàn vào vùng DNA mục tiêu, nhiệt độ trung bình cho phép primer kéo dài chép Trong nghiên cứu môi trường, phương pháp PCR sử dụng để phát vi sinh vật, vi sinh vật tháo tác gen (GMOs, GEMs), bệnh, sinh vật định Steffan Atlass (1998) sử dụng PCR để khuyếch đại vùng đặc biệt dài 1.0-kilobase (kb) vốn phần chuỗi dài 1.3-kb gen vi khuẩn phân hủy thuốc diệt cỏ Pseudomonas cepacia AC11000 giúp tăng tính nhạy phương pháp dot-blot sinh vật DNA vi khuẩn phân lập từ mẫu trầm tích (cát, bùn ) Sau q trình khuyếch đại, P.cepacia AC1100 phát nồng độ tế bào/ g bùn Điều làm tăng độ nhạy gấp 10 lần so với mẫu không khuyếch đại Chaudhry cộng (1989) sử dụng phương pháp PCR để phát vi sinh vật thao tác gen Pennisetum purpureum Kết phát GMOs mẫu môi trường nhờ kỹ thuật PCR có nghiên cứu Jansson (1995) Prosser (1994) Vai trò quan trọng khác sử dụng kỹ thuật PCR phân tích chuỗi RNA ribosom để nhận diện mơ tả đặc điểm phát sinh lồi vi sinh vật Điều thuận lợi trình nghiên cứu sinh thái vi sinh vật Xác định phát sinh lồi tìm vi sinh vật quan tâm chỗ mà không cần nuôi cấy, công bố Amam công (1995) Số lượng thông tin thu mà liên quan đến vùng khác trì cao rRNA 5S 16S cho phép lựa chọn đơn giản vị trí mục tiêu primer để khuyếch đại chuỗi gen rRNA mong muốn (Olsen vầ cộng sự,1986; Lin cộng sự,1997; Laupara cộng sự,2000) Manz cộng (1994) làm mẫu dị oligosachrit đặc hiệu ứng dụng xử lý chỗ quần thể vi sinh vật mùn hoạt tính xử lý nước thải Trong báo khác, tế bào vi khuẩn đất mùn phát nhờ phương pháp PCR (Tsai Olson,1991) Jansson cộng (2000) tổng kết phát triển mà sử dụng maker sinh học ( trình tự DNA đưa vào thể sinh vật vốn khác kiểu gen kiểu hình để quản lý hiệu xử lý sinh học chất thỉa nguy hại Một ví dụ khác sử dụng kỹ thuật phân tử xử lý sinh học chất thải nguy hại nhờ đặc tính quần thể vi khuẩn trao đổi metan có vị vị bề mặt nước bị nhiễm trichloroethylene (Bowman công sự, 1993) Các vị trí bị nhiễm hydrocacbon chlororinate, trichloroethylene (TCE), tetrachloroethylene (PCE) đe dọa đến an tồn nguồn nước uống Sự khống hóa hồn tồn TCE tạo CO2 đạt nhờ kết hợp hoạt động trao đổi metan trao đổi dị dưỡng quần thể vi sinh vật Từ lúc vi sinh vật trao đổi metan đưa vào tự nhiên, chúng xem phương tiện xử lý sinh học chất thải chỗ bị ô nhiễm Đặc điểm vi khuẩn trao đổi metan bao gồm phân hủy TCE thực nhờ tách chiết DNA giải trình tự đầu dò gen ( gen sMMD enzyme methane monooxygenase ) mẫu môi trường Chuỗi gen rRNA 16S Phương pháp nhận biết áp dụng với vi khuẩn cổ vi khuẩn Eukarya Nó dựa vào xác định vị trí phát sinh lồi sinh vật chưa biết sô sinh vật biết Chuỗi xem tốt cho việc xác đinh tiến hóa lồi bảo tồn cao lồi (Head cơng sự,1998) Có thể thu nhận chuỗi rRNA16S nhiều cách Một cách thông dụng hiệu PCR, tạo chuỗi rRNA16S Sau chuỗi so sánh với trình tự vi sinh vật khác có liệu Woese cộng (1990) xây dựng cấu trúc lớp vi sinh vật ( vi khuẩn cổ, vi khuẩn, eukarya ) mối quan hệ với thành phần khác dựa khác nucleotide chuỗi rRNA16S chúng Các cặp trình tự từ vi sinh vật khác xếp, khác trình tự nucleotide tính tốn Số điểm khác tạo sở để xây dựng q trình tiến hóa lồi Hơn nữa, biết vị trí phát sinh lồi vi sinh vật không cần nuôi cấy, chưa biêt đến đơi cho phép suy đặc tính sinh lý nhờ đưa điều kiện ni cấy để phân lập Phần TIỀM NĂNG SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH THÁI HỌC VI SINH VẬT MỨC ĐỘ PHÂN TỬ ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI NGUY HẠI Để tiến hành xử lý sinh học khu vực mối quan hệ ảnh hưởng việc xử lý tác động lên hệ sinh thái cần làm sáng tỏ Do đó, việc phân tích quần thể vi sinh vật chiếm phần thiếu xử lý sinh học chỗ Nhưng nay, việc phân tích thách thức nhà sinh vật học phần lớn vi khuẩn môi trường tự nhiên nhân giống (nuôi) kỹ thuật thơng thường phịng thí nghiệm mà cần bổ sung kỹ thuật ni cấy để hiểu sâu cấu trúc tính động lực quần thể vi sinh vật (5,6) Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát xác định vi sinh vật marker phân tử xác định ngày sử dụng thường xuyên nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật, phương pháp sử dụng xử lý sinh học chỗ Phát giám sát vi khuẩn đích Sự phát giám sát vi khuẩn đích, liên quan trực tiếp đến suy thối chất gây nhiễm, cần thiết để theo dõi tối ưu hóa trình xử lý sinh học Các phát mức độ đơn bào vi sinh vật cụ thể công nhận kỹ thuật hiệu để phái liệt kê vi khuẩn xác định phức hợp quần thể vi sinh vật (45- 47) Các kỹ thuật phát mức độ đơn bào gồm: Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang chỗ Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang chỗ (FISH) với RNA ribosom (rRNA) gắn đầu dị oligonucleotide (oligonucleotide probes) sử dụng thành cơng nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật Các phân tử rRNA bao gồm vùng bảo tồn cao xen kẽ với vùng biến đổi (48,49) Do chuỗi rRNA thường sử dụng để xây dựng phân loại, trình tự số nhóm lồi vi khuẩn định từ xác định (50-52) FISH liên quan đến sư lai hóa tín hiệu huỳnh quang – đầu dị oligonucleotide đánh dấu nội bào rRNA Những tế bào có lai hóa đặc biệt với đầu dị nhận diện đếm kính hiển vi huỳnh quang Hiệu nữa, phân tích phương pháp đếm tế bào dòng chảy cho phép xác định đếm lượng lớn các tế bào thời gian ngắn (1.000 tế bào/giây) (45) Tuy nhiên,vể độ nhạy kỹ thuật FISH, sử dụng chuẩn FISH với FITC đơn (mono-FITC) – đầu dị đánh dấu phát tín hiệu mạnh tế bào hoạt động trao đổi chất chứa lượng lớn rRNA (53-55) Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang chỗ HNPP - FISH, sử dụng 2-hydroxy-3naphthoic axit 2’-phenylanilide phosphate (HNPP) Fast Red TR Kỹ thuật có tín hiệu huỳnh quang gấp lần so với FITC - FISH Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang chỗ sử dụng đầu dò oligonucleotide đánh dấu Cy3 có hiệu để làm tăng độ nhậy(59,60) Hình 3: Nguyên tắc kỹ thuật lai hóa huỳnh quang chỗ Kỹ thuật PCR chỗ Kỹ thuật PCR khuếch đại phát gen mục tiêu bên tế bào vi khuẩn riêng biệt Kỹ thuật cho phép phát gen chức cụ thể có đơn lẻ (single coppy) lượng nhỏ (low copy numbers) tế bào nguyên vẹn mà kỹ thuật FISH khơng thể phát (61) Ví dụ Kurokawa cộng (62) độ đa dạng phân bố vi khuẩn mang gen sltII nước sông kỹ thuật PCR chỗ Bên cạnh đó, sử dụng kết hợp phiên mã ngược chỗ với PCR chỗ, nghiên cứu biểu gen tế bào vi khuẩn đáp ứng với điều kiện môi trường Chen cộng (63) sử dụng kỹ thuật để phát Pseudomonas putida F1 biểu gen tod C1 nước biển tiếp xúc với toluene Hình 4: Nguyên tắc PCR chỗ (In situ PCR) Bên cạnh phát mức độ đơn bào, phương pháp PCR định lượng sử dụng số lượng lớn ADN từ quần thể vi sinh vật tự nhiên cách tiếp cận hiệu để giám sát vi khuẩn đích Nghiên cứu Nakamura cộng (10) thành công việc giám sát lượng Ralstonia eutropha KT-1 thử nghiệm tăng sinh học TCE –nước mặt bị ô nhiễm phương pháp PCR định lượng với LightCyclerTM (Roche) đích theo trình tự lặp đối xứng ngồi gen (REP) Giám sát thay đổi đa dạng vi sinh vật Quần thể vi sinh vật đóng vai trị quan trọng chu trình địa hóa sinh học góp phần vào việc trì hệ sinh thái (2-4) Do đó, điểu tra ảnh hưởng xỷ lý sinh học dựa quần thể vi sinh vật cần thiết để chứng minh tính an tồn xử lý sinh học chỗ Các phương pháp giám sát thay đổi đa dạng vi sinh vật gồm: Điện di gel biến tính gradient (Denaturing gradient gel electrophoresis – DGGE) PCR khuếch đại phần rDNA 16S sử dụng công cụ tiện lợi mạnh mẽ để xác định khác thời gian không gian quần thể vi sinh vật để giám sát thay đổi đa dạng quần thể vi sinh vật (64-71) PCR - khuếch đại phần 16S rDNA từ quần thể vi sinh vật, có kích thước, tách thành dải đơn riêng rẽ trinh điện di gel polyacrylamide có chứa gradient tuyến tính tăng DNA bị biến tính Sự phân tách dựa giảm điện tích di động phân tử DNA bị biến tính phần gel Trong DGGE, phân tử DNA sợi đơi riêng biệt bị biến tính theo trình tự chúng Mỗi phần biến tính chúng di động dừng lại vị trí định, cách tạo dải riêng biệt gel Do đó, đa dạng quần thể vi sinh vật quan sát thấy dải riêng biệt DGGE Bằng cách gắn với GC giữ, GC- nhiều trình tự, phần DNA, tất trình tự phát (72) Các dải riêng biệt tách ra, tái khuếch đại xác định trình tự lai hóa với đầu dị oligonucleotide để xác định thành phần quần thể vi sinh vật Bên cạnh đó, phân tích định lượng dải mẫu làm cho DGGE trở nên hữu ích giám sát tập tính quần thể vi sinh vật thời gian dài (73-77) Hình 5: Nguyên tắc DGGE Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài phân đoạn DNA dựa đầu cuối điểm cắt giới hạn (terninal restriction fregment lengh polymorphism) (TRFLP) (81) Trong phương pháp này, tín hiệu huỳnh quang – mồi đánh dấu dùng để khuếch đại vùng gen vi khuẩn mã hóa rRNA 16S xuất phát từ quần thể vi sinh vật Các sản phẩm PCR bị cắt enzyme giới hạn, tín hiệu huỳnh quang- đầu cuối phần giới hạn đánh dấu đo xác máy giải trình tự DNA tự động Hình 6: Độ dài phần sau cắt enzyme giới hạn khác phụ thuộc vào trình tự chuỗi DNA Kỹ thuật T-RFLP có độ phân giải cao chút so với DGGE (82) Marshi cộng phát triển mạng lưới công cụ nghiên cứu giúp nhà điều tra, nghiên cứu có đường nhanh chóng để tối ưu hóa mồi enzyme giới hạn kết hợp phân tích quẩn thể vi sinh vật T-RFLP Phần KẾT LUẬN Phương pháp sinh học phân tử cung cấp cho nhà vi sinh vật học môi trường công cụ độc đáo với giá trị thiết lập để nghiên cứu quần thể vi sinh vật, khả tiềm tàng môi trường cụ thể quần thể vi sinh vật phân hủy đặc biệt bao gồm trình xử lý sinh học Phương pháp dựa DNA chứng minh đáng tin để theo dõi vi sinh vật cụ thể Đặc biệt sàng lọc DNA chúng áp dụng số hoạt động vi sinh vật để đánh giá chất lượng loại đất, trầm tích, nước… bị nhiễm Bảng 5: Các mẫu dò DNA vi sinh vật sử dụng nghiên cứu môi trường (Theo Hazen Jimenez, 1988) Kỹ thuật PCR sử dụng phổ biến nghiên cứu môi trường Đây phương pháp hữu ích (theo Bej cộng sự, 1992) để: - Theo dõi biến đổi gen (di truyền) vi sinh vật giám sát số quần thể, tác nhân gây bệnh nước, đất trầm tích - Đo lường biểu gen vi sinh vật tồn phát quẩn thể cụ thể dựa trình tự gen chẩn đốn - Nhân dịng gen, cho phép tạo trình tự gen, chí từ vi sinh vật quan trọng với môi trường chưa thể nuôi cấy Sử dụng axit nucleic (DNA, RNA) bước ngoặt phân tích mơi trường Nhiều nghiên cứu chứng minh tính khả thi việc phát triển loạt mẫu dò (probes) đặc biệt gen vi sinh vật quan trọng với môi trường Các nhà vi sinh vật học mơi trường áp dụng kỹ thuật để phát hiện, định lượng vi sinh vật môi trường nghiên cứu chuyển gen, trì chúng quần thể tự nhiên Kỹ thuật sinh học phân tử có tiềm lớn phân tích đa dạng vi sinh vật, kết nghiên cứu cịn Mặc dù đa dạng quần thể vi sinh vật lớn với phương pháp kỹ thuật này, chủng vi sinh vật nhận biết, phân lập, mơ tả đặc điểm/ tính chất phát sinh loài sinh lý học Bên cạnh đó, giám sát chỗ cho phép nghiên cứu vi sinh vật nơi khu trú chúng Các kỹ thuật sinh học phân tử cịn cho phép kiểm sốt, giám sát phát triển chiến lược xử lý sinh học tốt hơn, mang lại hiệu chí phí, thân thiện với môi trường hiệu làm môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Grazyna Plaza, Krzysztof Ulfig, Terry C.hazen, Robin L.Brigmon Use oF moleculer techniques in bioremediation 2001.205-218 Tomatada Iwamoto and Masao Nasu Current Bioremediation Practice and Perspective Journal of bioscience and bioengineering 2001 M.Vidali Bioremediation An overview 2001 1163-1172 http://www.gr-indtech.com/web/?frame=news&id=42 Goggle search: Báo cáo thực tập-Tìm hiểu quy trình xử lý chất thải nguy hại phương pháp lò đốt công ty cổ phần Môi Trường Việt Úc ... TỬ TRONG XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI 2.1 Vi sinh vật kỹ thuật phân tử ứng dụng sử lý sinh học chất thải nguy hại Xử lý sinh học chất thải nguy hại dựa phân hủy chất ô nhiễm lợi dụng khả... sử dụng maker sinh học ( trình tự DNA đưa vào thể sinh vật vốn khác kiểu gen kiểu hình để quản lý hiệu xử lý sinh học chất thỉa nguy hại Một ví dụ khác sử dụng kỹ thuật phân tử xử lý sinh học chất. .. xử lý sinh học môi trường bị ô nhiễm chất thải độc hiệu tốn Phần 1.1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI Chất thải nguy hại 1.1.1.Định nghĩa - Theo UNEP Chất thải độc hại chất thải