ứng dụng kỹ thuật mlpa (multiplex ligation dependent probes amplification) trong xác định kiểu haplotype của các chủng salmonella enterica serovar typhi phân lập ở việt nam và một số nước châu á

Với sự phát triển không ngừng của kỹ thuật giải trình tự tự động thì SNP typing Single Nucleotide Polymorphism typing- phương pháp phân biệt dựa vào sự đa hình các trình tự nucleotide đư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

–R—

PHẠM THANH DUY

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA (MULTIPLEX LIGATION DEPENDENT PROBES AMPLIFICATION) TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU HAPLOTYPE CỦA

CÁC CHỦNG SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHI PHÂN LẬP Ở

VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ NƯỚC CHÂU Á

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS STEPHEN BAKER

TP HỒ CHÍ MINH – 2010

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tiến sỹ Stephen Baker, người trực tiếp hướng dẫn đề tài cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này Tiếp theo, tôi xin cảm ơn tiến sỹ

Trần Thụy Châu đã hướng dẫn tôi những thao tác sinh học phân tử trong

quá trình làm thí nghiệm cũng như chỉnh sửa luận văn này Tôi cũng xin

gửi lời cảm ơn đến bác sỹ James Campbell, anh Hoàng và các anh chị

trong phòng thí nghiệm vi sinh của đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford đã tận tình chỉ dạy tôi những thao tác vi sinh cơ bản và giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giảng dạy tại

khoa Sinh Học trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian đại học cũng như cao học

Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các thành viên trong gia đình tôi đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần trong suốt thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng tôi xin cảm ơn các anh chị đồng nghiệp đã luôn ở bên cạnh động viên, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm cũng như giúp đỡ tôi về mọi mặt trong quá trình làm đề tài

MỤC LỤC

Lời Cảm ơn

Mục

lục……… i

Danh mục các chữ viết tắt ………iv

Danh mục các bảng………v

Danh mục các hình vẽ……… vi

Giới thiệu……… vii

Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài………viii

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi (S.Typhi) 2

1.2 Đặc điểm cấu trúc và sinh lý, sinh hóa của S.Typhi 3

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc …4

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 5

1.3 Phương pháp phân lập và định danh S.Typhi 5

1.4 Đặc điểm di truyền của S.Typhi 6

1.5 Bệnh học sốt thương hàn do S.Typhi 7

1.5.1 Nguồn lây bệnh và con đường truyền nhiễm 7

1.5.2 Triệu chứng lâm sàng 7

1.5.3 Sự phát sinh bệnh do S.Typhi 8

1.5.4 Phòng bệnh sốt thương hàn 8

1.5.5 Điều trị sốt thương hàn 10

1.6 Tình hình kháng kháng sinh hiện nay của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn trên thế giới và Việt Nam 10

1.6.1 Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn trên thế giới 10

1.6.2 Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn tại Việt Nam 13

1.7 Các phương pháp phân biệt S.Typhi trong nghiên cứu dịch tễ và tìm hiểu

cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi 14

1.7.1 Các phương pháp cổ điển dựa trên kiểu hình 14

1.7.2 Các phương pháp phân tử dựa vào DNA 16

1.8 Phát triển phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) trong phân biệt các chủng S.Typhi 20

1.8.1 Giới thiệu phương pháp MLPA 20

1.8.2 Nguyên tắc của MLPA 22

1.8.3 Ưu điểm của kỹ thuật MLPA 23

1.9 Golden gate SNP typing 23

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Qui trình thực nghiệm 26

2.3 Hóa Chất – Thiết Bị - Phương Pháp Tiến Hành 26

2.3.1 Định danh vi khuẩn 27

2.3.1.1 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa cơ bản 27

2.3.1.2 Định danh sinh hóa bằng Kít Api 20E (Biomerieux, Paris, Pháp) 29 2.3.1.3 Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên–kháng thể 30 2.3.2 Xác định kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum inhibitory concentration) 32

2.3.3 Tách chiết DNA bộ gen S.Typhi bằng Wizard (Promega ) Kít 34

2.3.4 SNP typing bằng Golden gate Assay 35

2.3.5 Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification (MLPA) 35

2.3.5.1 Thiết kế mẫu dò 35

2.3.5.2 Quá trình thực hiện MLPA 38

2.3.5.3 Phân tích sản phẩm MLPA 39

2.3.6 PCR thông thường 42

2.3.7 Dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree) từ dữ liệu SNP typing và dữ liệu MLPA) 43

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả xác nhận S.Typhi bằng các phản ứng sinh hóa và Kít Api 20E 44

3.2 Kết quả kháng sinh đồ và MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của các chủng

S.Typhi phân lập ở Việt Nam và các nước Châu Á 44

3.2.1 Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng

S.Typhi phân lập ở Việt Nam 45

3.2.2 Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng

S.Typhi phân lập ở một số nước Châu Á 46

3.2.3 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với OFX

(ofloxacin) và CIP (ciprofloxacin) của các chủng S.Typhi phân lập từ

Việt Nam và các nước Châu Á 48 3.2.4 Đánh giá giới hạn kháng-nhạy (breakpoint) với ciprofloxacin và

ofloxacin theo hướng dẫn của CLSI hiện nay: 49 3.3 Kết quả SNP typing bằng Golden gate assay 52

3.4 Kết quả phân loại các chủng S.Typhi bằng phương pháp MLPA 54

3.4.1 Kết quả phát hiện các đoạn gắn chèn-bị mất của S.Typhi bằng MLPA 54 3.4.2 Kiểm tra độ chính xác của phương pháp MLPA trên các chủng chứng 56

3.4.3 So sánh kết quả xác định haplotype của S.Typhi bằng Golden gate

SNP typing và MLPA 57 3.4.4 Kết quả phân tích sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của 217

S.Typhi bằng phương pháp MLPA 60

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN 65 4.2 ĐỀ NGHỊ 66TÀI LIỆU THAM KHẢO………

ix

PHỤ LỤC……… xxiii

MIC Minimum inhibotory concentration

MLEE Multilocus enzyme electrophoresis

MLPA Multiplex ligation dependent-probes amplification MLST Multilocuc sequence typing

RAPD Random amplified polymorphic DNA

RFLP Restriction fragment length polymorphism

SPIs Salmonella Pathogenicity islands

S.Typh

i Salmonella enterica serovar Typhi

TBE Tris-borat / EDTA

µg/ml Microgam/mililít

UV Ultra violet

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1……… 2

2.1……… 27

2.2……… 34

2.3……… 37

2.4……… 43

3.1……… 45

3.2……… 48

3.3……… 52

3.4……… 56

3.5……… 57

3.6……… 60

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.1……….3

1.2……….4

1.3……….11

1.4……….12

1.5……….13

1.6……….18

1.7……….21

1.8……….22

1.9……….25

2.1……….29

2.2……….30

2.3……….31

2.4……….32

2.5……….40

2.6……….41

2.7……….42

3.1……….46

3.2……….50

3.3……….51

3.4……….53

3.5……….55

3.6……….55

3.7……….62

Giới thiệu

Salmonella Typhi là nguyên nhân chính gây bệnh sốt thương hàn ở Việt

Nam và trên thế giới Theo thống kê, số ca nhiễm hàng năm lên đến 16-33 triệu

ca với khoảng 500.000-600.000 người chết [9] Bệnh lây truyền qua đường

phân-miệng nên rất phổ biến ở các nước đang phát triển, đặc biệt ở các nước Châu Á và Châu Phi [109] Kháng sinh là biện pháp hiệu quả nhất trong điều trị sốt thương hàn Tuy nhiên tình hình kháng thuốc lan tràn và không ngừng gia

tăng hiện nay của S.Typhi gây rất nhiều khó khăn trong điều trị [70] Nghiêm trọng hơn là sự gia tăng của quần thể S.Typhi đa kháng thuốc (kháng với

chloramphenicol, ampicillin và co-trimoxazole) kết hợp kháng nalidixic acid

So với những chủng nhạy thì những chủng đa kháng thuốc gây bệnh nặng hơn;

tỉ lệ biến chứng và tử vong cao hơn đặc biệt ở trẻ em dưới 2 tuổi và giới hạn

kháng sinh điều trị [109] Không những thế, tỉ lệ mang S.Typhi mãn tính sau

điều trị còn cao hơn gấp 10 lần so với sốt thương hàn gây ra bởi chủng nhạy

[70] S.Typhi kháng nalidixic acid (kháng sinh thế hệ I thuộc họ quinolone) gây

giảm nhạy với fluoroquinolone, là họ kháng sinh chủ yếu trong điều trị sốt

thương hàn hiện nay Sự giảm nhạy với fluoroquinolone của các chủng S.Typhi

thường dẫn đến việc điều trị kéo dài, nguy cơ thất bại cao và tăng gánh nặng điều trị [3, 8, 33, 49, 59, 78, 82]

Do đó, sốt thương hàn gây ra do các chủng S.Typhi đa kháng kết hợp

kháng nalidixic acid đang được quan tâm hiện nay ở nhiều nước đang phát

triển Nghiên cứu về dịch tễ cũng như cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi

là rất quan trọng và cần thiết để tìm hiểu sự lây lan, ngăn chặn sự bùng phát của bệnh trong tương lai và có phát đồ điều trị hợp lý Tuy nhiên, các nghiên cứu

đều gặp nhiều khó khăn do chủng S.Typhi có tính tương đồng di truyền cao Vi

khuẩn này rất ổn định về mặt di truyền, mức độ đa dạng trình tự thấp, khi so

sánh một vài trình tự gen thường không phân biệt được các dòng S.Typhi [54].

Do đó để phân biệt các chủng S.Typhi cần phải có những phương pháp nghiên

cứu sâu hơn

Với sự phát triển không ngừng của kỹ thuật giải trình tự tự động thì SNP typing (Single Nucleotide Polymorphism typing)- phương pháp phân biệt dựa vào sự đa hình các trình tự nucleotide được xem là phương pháp chuẩn hiện nay Tuy nhiên phương pháp này rất tốn kém, đòi hỏi thời gian và thiết bị kỹ thuật đắt tiền nên không thể áp dụng ở những vùng dịch tễ của sốt thương hàn thường là những vùng kinh tế thấp

Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi muốn phát triển một

phương pháp giúp xác định nhanh các kiểu di truyền của S.Typhi một cách đơn

giản, có hiệu quả phân biệt cao, lặp lại Phương pháp này có thể được áp dụng tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử thông thường ở Việt Nam cũng như các nước đang phát triển

Phương pháp này hứa hẹn sẽ trở thành công cụ hiệu quả trong các nghiên cứu về dịch tễ học giúp tìm hiều nguồn gốc lây lan của dịch bệnh, con đường lan truyền, tìm hiểu mối quan hệ giữa kiểu gen với vùng địa lý, mối quan hệ giữa kiểu gen với kiểu hình kháng thuốc; nguồn gốc và sự tiến hóa các

kiểu gen khác nhau ở S.Typhi…Ngoài ra phương pháp còn giúp xác định cấu trúc di truyền trong quần thể S.Typhi ở những vùng nhất định, điều mà trước

đây hầu như không thể tiếp cận bằng các phương pháp thông thường

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica

serotype Typhi (S.Typhi) [17] [22]

Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [16] Họ

vi khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di

động được Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella Trong

đó Kauffmann-White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003 Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết thanh

với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng

nguyên H

Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng của màng tế bào Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu đơn vị Mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường Những thay đổi trong thành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng nguyên O khác nhau Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4…(Ban đầu các nhóm O phổ biến được qui ước bằng chữ cái và đến nay vẫn còn dùng ở một số

nơi) Ví dụ S.Typhimurium thuộc nhóm O4 hay còn gọi nhóm B; S.Typhi thuộc

nhóm O9 (nhóm D1); S.Paratyphi thuộc nhóm O2 (nhóm A)

Kháng nguyên H là phần tạo thành cấu trúc roi của vi khuẩn Kháng nguyên H có bản chất là protein, hình thành từ các tiểu đơn vị protein flagellin

Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại kháng

nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau [22] Tuy nhiên hoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H được biểu hiện

ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn [22] Hai kháng nguyên H này được xếp vào pha 1 và pha 2 Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2 Ngoài ra, một số týp huyết thanh “đơn pha” do tự nhiên như

S.Enteriditis, S.Typhi…

Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài:

Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V) Salmonella enterica được chia thành 6 phân

loài qui định bằng tên hoặc số La Mã Trong đó S.Typhi thuộc phân loài I Bảng 1.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp Kauffmann-

White [17]

Loài và phân loài Số lượng týp huyết Vật chủ

Salmonella thanh trong mỗi phân loài

S.enterica subsp.enterica (I) 1454 Động vật máu nóng

S.enterica subsp.salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.arizonae (IIIa) 94 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường

giống Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica

S.Typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I 9,12(Vi):d:-

để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9, 12 và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không có kháng nguyên H pha 2

Phần lớn (59%) týp huyết thanh của Salmonella thuộc S.enterica phân

loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là O2, O4, O9…

gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu

nóng [75]

1.2 Đặc điểm cấu trúc và sinh lý, sinh hóa của S.Typhi

Đặc điểm về cấu trúc của S.Typhi đóng vai trò quan trọng trong sự gây

bệnh, tính đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ và các phương pháp chẩn đoán bệnh

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc

S.Typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0.5 µm, cấu trúc gồm 2

màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng

nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào Màng trong và màng ngoài đều là các

lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào

Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi

tế bào chất

Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O Ở S.Typhi và

S.Paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của acid

N-acetylglucosamine uronic, nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng

nguyên O S.Typhi còn mang các roi dài 2-5 µm là sự kéo dài của các thể nền

bên trong tế bào Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp cho sự

gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ Những sợi lông này có đường kính

khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các tiểu

đơn vị fimbrillin hoặc pilin

Cấu trúc bề mặt của S.Typhi đóng vai trò quan trọng quyết định các đặc

tính sinh lý và sự bám vào các mô của tế bào chủ Nếu Salmonella mất hoặc

Hình 1.1 : Cấu trúc tế bào vi khuẩn S.Typhi [55]

không biểu hiện kháng nguyên O sẽ không có khả năng sống sót trong tế bào chủ do kháng nguyên O là lớp lipopolisaccharide bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của các bổ thể của hệ miễn dịch [55]

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa [55]

S.Typhi là trực trùng gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy

ý, di động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37oC; có khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, có thể tạo một ít H2S từ cơ chất sulphat tan Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trong quá trình sống

S.Typhi khác so với hầu hết Salmonella ở chỗ chúng không

bao giờ sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc

decarboxylate orthinine và không lên men rhamnose S.Typhi không sinh

indole, thử nghiệm Voges-Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase và urease âm tính Các đặc tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử

nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh trong định danh S.Typhi

S.Typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây bệnh ở

bất kỳ sinh vật nào khác S.Typhi có khả năng thay đổi để chống lại các điều

kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp; vì vậy rất khó để loại bỏ tận

gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn S.Typhi có thể tồn tại ở thịt chưa được

nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản acid dạ dày để gây bệnh ở người [44]

1.3 Phương pháp phân lập và định danh S.Typhi

Sốt thương hàn do S.Typhi rất khó chẩn đoán vì bệnh không có triệu

chứng lâm sàng đặc trưng và có nhiều triệu chứng tương tự các bệnh sốt khác

như sốt xuất huyết hay sốt rét S.Typhi có thể được phân lập từ nhiều nguồn

khác nhau như dịch não tủy, máu, phân, nước tiểu Trong đó cấy máu được xem là phương pháp chẩn đoán chuẩn, cho kết quả dương tính từ 60-80% bệnh nhân sốt thương hàn [72] Độ nhạy của phương pháp cấy máu cao hơn trong tuần đầu tiên của bệnh, giảm khi bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó và tăng khi thể tích cấy máu tăng Phương pháp cấy tủy có độ nhạy cao hơn, cho kết quả dương tính 80-95% bệnh nhân sốt thương hàn bất kể bệnh nhân có sử

Hình 1.2: S.Typhi [111]

dụng kháng sinh hay chưa và bất kể thời gian bệnh Phương pháp cấy phân cho

tỉ lệ thành công 30% trong các bệnh nhân sốt thương hàn cấp tính Tính nhạy của phương pháp này tùy thuộc lượng phân dùng để cấy và thời gian bệnh [72]

S.Typhi có thể được định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa kết hợp

với thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh đặc hiệu O9, Vi Tuy nhiên phương pháp ngưng kết kháng nguyên-kháng thể này gặp trở ngại do một số

týp huyết thanh của Salmonella cũng mang các kháng nguyên thân của

S.Typhi S.Typhi cũng mang các epitope phản ứng chéo với các Enterobacteriaceae khác [72] Ngoài ra thử nghiệm Widal cũng được sử dụng

khá rộng rãi để định danh S.Typhi dựa vào phản ứng ngưng kết để phát hiện kháng thể kháng S.Typhi trong huyết thanh bệnh nhân Những kháng thể này

xuất hiện trong thời gian từ tuần thứ hai đến thứ ba của bệnh [55].

1.4 Đặc điểm di truyền của S.Typhi

Trình tự bộ gen của chủng S.Typhi đa kháng thuốc CT18 phân lập ở

bệnh viện Nhiệt Đới TPHCM đã được công bố lần đầu tiên trên thế giới vào năm 2001 [68] Bộ gen có kích thước 4.809.037 bp với khoảng 4599 gen, mang

nhiều đoạn gắn chèn lớn gọi là các đảo độc tính ở Salmonella (Salmonella

pathogenicity islands-SPIs) Các đảo độc tính này chứa các gen quan trọng cho

sự xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn trong tế bào chủ Đặc biệt bộ gen S.Typhi

mang 204 pseudogen chiếm hơn 4% trình tự mang mã, tương tự với bộ gen của

S.Paratyphi [53, 60] (Pseudogen là những trình tự DNA mang mã nhưng

không được dịch mã Những gen này có thể bị bất hoạt do đột biến tạo stop codon, đột biến gây lệch khung, mất đoạn hay tái sắp xếp đoạn) Trong khi hầu

hết các týp huyết thanh của S.enterica đều gây bệnh ở nhiều kí chủ khác nhau

và giới hạn ở viêm dạ dày-ruột thì S.Typhi và S.Paratyphi chỉ gây bệnh ở người

và còn gây nhiễm trùng hệ thống Trình tự DNA bộ gen S.Typhi và S.Paratyphi

có mức độ tương đồng cao nhất so với các týp huyết thanh còn lại Sự bất hoạt những gen đóng vai trò quan trọng trong tương tác với các tế bào chủ, các gen

làm thay đổi chu trình kí sinh nội bào…được xem là cơ chế tiến hóa để S.Typhi cũng như S.Paratyphi trở thành vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người [53, 60]

Sự tích lũy pseudogen cũng diễn ra ở vi khuẩn gây nhiễm trùng hệ thống khác

như Yesinia Pestis và vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc như Mycobacterium

lepriae

Một đặc điểm quan trọng khác ở S.Typhi là vi khuẩn này mang rất ít đặc tính đa dạng di truyền Khi giải trình tự vài gen để phân biệt S.Typhi chỉ thu

được rất ít vị trí đa hình [54] Việc tìm hiểu những vi khuẩn có tính đa dạng di

truyền thấp như S.Typhi gặp rất nhiều khó khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức

tạp [2]

1.5 Bệnh học sốt thương hàn do S.Typhi

1.5.1 Nguồn lây bệnh và con đường truyền nhiễm

Sốt thương hàn là bệnh nhiễm trùng hệ thống do S.Typhi gây ra Con người là kí chủ duy nhất của S.Typhi [14, 55, 72, 105] Người lành mang trùng

có thể thải từ 106 đến 109 vi khuẩn thương hàn trong mỗi gram phân S.Typhi

có thể tồn tại trong nước ao, hồ, nước ngầm; trong sữa, thịt, trứng và sò bị nhiễm khuẩn Liều gây bệnh là 103 đến 106 vi khuẩn theo đường miệng [72].

Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa Đa số các trường hợp mắc bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấu chín Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thực phẩm và nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặc được rửa bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh [14, 55, 72] Nguy cơ khác bao gồm tiếp xúc với người lành mang mầm bệnh, điều kiện vệ

sinh ăn ở kém và tiền sử nhiễm Helicobacter pilori Những người từng nhiễm

Helicobacter pilori bị giảm acid trong dạ dày tạo điều kiện thuận lợi cho S.Typhi xâm nhập qua rào cản acid dạ dày [14] Do liên quan đến những yếu tố

điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở những nơi có mật độ dân số cao cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh

1.5.2 Triệu chứng lâm sàng

Sau khi S.Typhi xâm nhập vào cơ thể từ 7-21 ngày thì bắt đầu xuất hiện

các triệu chứng khó ở, mệt mỏi, nhức đầu, biếng ăn, sốt nhẹ Sau đó sốt cao dần, đặc biệt về đêm (39-40oC), kéo dài hàng tuần nếu không điều trị; cùng với

đó là tiêu chảy hoặc táo bón, ho, nôn mửa, đau bụng, cổ cứng Bệnh nhân còn

có thể bị chậm nhịp tim, lách to, mơ sảng [14, 55, 72, 105] Trong tuần thứ hai

30% bệnh nhân có những đốm hồng ở bụng, ngực, lưng còn gọi là hồng ban [72] Sau tuần thứ ba bệnh nhân dần hồi phục Tuy nhiên 10% bệnh nhân bị tái phát hay biến chứng nặng hơn [14, 105] Các biến chứng nguy hiểm bao gồm xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột

Ngoài ra, 1-6% bệnh nhân trở thành nguồn mang S.Typhi mãn tính Những người này có thể mang vi khuẩn S.Typhi trong tủy xương hay túi mật từ

vài tháng đến cả cuộc đời, đồng thời thải vi khuẩn qua phân và nước tiểu theo định kỳ mà không hề biểu hiện triệu chứng bệnh nào [14, 29, 46, 55, 62] Đây

là vấn đề y tế công cộng quan trọng vì những người này là có thể là nguồn lây nhiễm và làm bùng phát dịch bệnh trong tương lai

1.5.3 Sự phát sinh bệnh do S.Typhi [14, 32, 55, 62]

Các nghiên cứu về sự phát sinh bệnh do S.Typhi gặp nhiều khó khăn do

con người là kí chủ duy nhất của vi khuẩn này Hầu hết những hiểu biết về sự

phát sinh bệnh do S.Typhi đều dựa trên những nghiên cứu ở S.Typhimurium-

một týp huyết thanh gây bệnh tương tự bệnh sốt thương hàn ở chuột [14]

Sau khi vào cơ thể, vi khuẩn tấn công vào ruột Tại đây chúng xâm nhập qua các tế bào M của mảng Peyer hoặc di chuyển qua các tế bào biểu mô hấp thu để xuyên qua lớp dưới niêm mạc ruột non Tiếp đó vi khuẩn kích thích phản ứng viêm và hoạt động thực bào bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào; đồng thời huy động tế bào bạch huyết B và T Vi khuẩn này có thể tồn tại và

nhân lên trong các bạch cầu đơn nhân, qua đó giúp S.Typhi phát tán theo đường

máu và bạch huyết đến các hạch bạch huyết mạng treo ruột và các mô sâu hơn [55] Sau khi phát tán vi khuẩn sẽ gây nhiễm trùng máu sơ cấp với các triệu

chứng nhẹ như hồng ban, ho; tiếp đó S.Typhi nhiễm vào lách, gan và tủy xương gây nhiễm trùng máu thứ cấp Trong tuần thứ hai của bệnh, S.Typhi nhiễm vào

túi mật Sau đó vi khuẩn nhân lên, theo ống mật vào ruột non và được thải ra ngoài qua phân [55]

1.5.4 Phòng bệnh sốt thương hàn

Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễm khuẩn nên biện pháp quan trọng hàng đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, cải thiện hệ thống xử lý chất thải và nguồn cung cấp nước [14, 38, 51,

55, 70, 71] Ở các nước phát triển, bệnh chủ yếu xảy ra ở khách du lịch trở về

từ các nước có dịch nên khách du lịch khi đến những vùng này cần chú ý đến vấn đề an toàn thực phẩm [26]

Do S.Typhi chỉ gây bệnh ở người nên nguồn gốc lây lan bệnh luôn liên

quan đến những người mắc sốt thương hàn hoặc mang mầm bệnh mãn tính Những người chế biến thực phẩm mang mầm bệnh mãn tính có thể là nguyên nhân của những đợt dịch sốt thương hàn nghiêm trọng Ví dụ điển hình cho

nguy cơ từ những người mang S.Typhi mãn tính là trường hợp “Typhoid Mary

” những năm 1900 Mary-một phụ nữ khỏe mạnh mang S.Typhi mãn tính làm

nghề nấu ăn được xem là người gây ra dịch sốt thương hàn năm 1903 làm chết

1300 người [46, 55] Những người mang S.Typhi mãn tính có thể làm lan tràn

bệnh dịch nếu họ gây nhiễm nguồn cung cấp nước Vì vậy, việc tầm soát và

chữa trị cho những người mang S.Typhi mãn tính là hết sức quan trọng trong

công tác phòng chống dịch

Vắc-xin là một biện pháp hiệu quả trong phòng bệnh sốt thương hàn

Vắc-xin đầu tiên là chủng S.Typhi bị bất hoạt do nhiệt, phenol…Tuy nhiên

vắc-xin này gây nhiều phản ứng phụ [14, 71, 72] Tiếp theo là Vắc-vắc-xin Ty21a có

nguồn gốc từ chủng S.Typhi Ty2 được làm yếu và không mang vỏ Vi Đây là

vắc-xin dạng uống, uống 3 lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày Vắc-xin này tương đối an toàn cho hiệu quả bảo vệ trong 5 năm và ít có tác dụng phụ, tuy nhiên lại không được sử dụng cho trẻ em dưới 6 tuổi [14, 55, 72, 108] Vắc-xin thứ 3 có bản chất là polysaccharide Vi tinh chế, được dùng ở dạng tiêm một lần duy nhất Do vắc-xin này ít tác dụng phụ nên được sử dụng rộng rãi và có thể dùng cho trẻ em trên 2 tuổi Tuy nhiên hiệu quả bảo vệ cũng chỉ khoảng 2-3 năm Sau 3 năm phải tiêm nhắc lại [14, 71, 104, 107] Vắc-xin này thường được tiêm cùng với một số vắc-xin khác cho những người đi du lịch đến các vùng lưu hành dịch Ngoài ra còn có vắc-xin tái tổ hợp Vi cho trẻ em từ 2-5 tuổi ở Việt Nam Vắc-xin này cho hiệu quả bảo vệ 91.1% trong 27 tháng, có thể dùng cho trẻ em dưới 2 tuổi và đã được đưa vào chương trình tiêm chủng quốc gia mở rộng [14]

1.5.5 Điều trị sốt thương hàn

Ở các vùng dịch tễ sốt thương hàn, hơn 60-90% trường hợp bệnh được điều trị tại nhà bằng kháng sinh và nghỉ ngơi hợp lý [72] Đối với bệnh nhân nhập viện sẽ được điều trị bằng kháng sinh, dinh dưỡng, chăm sóc hợp lý, cân bằng điện giải, bù nước và dịch…

Trong các kháng sinh sử dụng điều trị sốt thương hàn hiện nay thì fluoroquinolone (oxfloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin) được xem là họ kháng sinh hiệu quả nhất [71, 72] Hiệu quả của các kháng sinh này

đã được chứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng [25, 70, 73]

Tuy nhiên việc vi khuẩn kháng quinolone ở những vùng lưu hành dịch

đã làm giảm hiệu quả của fluoroquinolone Ở những nơi vi khuẩn vẫn nhạy với quinolone thì fluoroquinolone là lựa chọn tốt nhất để điều trị sốt thương hàn Ngược lại, nếu vi khuẩn kháng quinolone thì hiệu quả điều trị với fluoroquinolone giảm, thời gian điều trị kéo dài, liều dùng phải cao và tăng nguy cơ thất bại [8, 57, 69, 71, 81]

Ngoài fluoroquinolone thì azithromycin và cephalosporin thế hệ thứ 3 (ceftriaxone, cefixime, cefotaxime và cefoperazone) cũng là những kháng sinh hiệu quả trong điều trị sốt thương hàn [25, 70] Chloramphenicol, amoxicillin

và co-trimoxazole vẫn là lựa chọn thích hợp trong điều trị sốt thương hàn ở những nơi vi khuẩn vẫn còn nhạy với các kháng sinh này

1.6 Tình hình kháng kháng sinh hiện nay của S.Typhi và dịch tễ học sốt

thương hàn trên thế giới và Việt Nam

1.6.1 Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt

thương hàn trên thế giới

Năm 1948 chloramphenicol là kháng sinh được lựa chọn hàng đầu trong điều trị sốt thương hàn [110] Hai năm sau khi sử dụng kháng sinh này, chủng

S.Typhi kháng chloramphenicol bắt đầu xuất hiện Tuy nhiên, trong những năm

1950-1960 hầu hết các chủng S.Typhi phân lập được đều nhạy với

chloramphenicol Năm 1972, dịch sốt thương hàn gây ra do chủng S.Typhi

kháng chloramphenicol bùng phát ở Mexico, Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Hàn Quốc và Peru [63] Những chủng này cũng kháng sulfonamides, tetracycline và streptomycin Amoxcilin và co-trimoxazole là những kháng sinh thay thế để

điều trị sốt thương hàn do S.Typhi kháng chloramphenicol [72]

Vào những năm 1980-1990, S.Typhi đa kháng với tất cả kháng sinh ưu

tiên sử dụng trong điều trị sốt thương hàn (gồm chloramphenicol,

co-trimoxazole và ampicillin) [63] Các chủng S.Typhi đa kháng thuốc-MDR

(multiple drug resistance) tiếp tục gây ra các đợt dịch liên tiếp ở thung lũng Kashmir (Ấn Độ) với 230 ca, Pakistan (1990), Bangladesh, Việt Nam (1993),

Trung Đông và Châu Phi [72] Các nghiên cứu cho thấy chủng S.Typhi đa

kháng thuốc mang các gen kháng nằm trên một plasmid duy nhất [37, 72]

Fluoroquinolone, cephalosporin phổ rộng và gần đây là azithromycin là những kháng sinh thay thế hiệu quả trong điều trị sốt thương hàn đa kháng thuốc Tuy nhiên những kháng sinh này khá đắt tiền và một số phải sử dụng

dạng tiêm Ngoài ra S.Typhi kháng các kháng sinh họ cephalosporin phổ rộng

và fluoroquinolone cũng đã xuất hiện và trở thành vấn đề quan trọng ở nhiều khu vực Châu Á [11, 15, 79, 80, 85, 103]

Sự xuất hiện quần thể chủng S.Typhi kháng nalidixic acid và nhạy với ciprofloxacin nhưng có MIC từ 0.125-1 mg/l ngày càng trở nên phổ biến Những chủng này được xem là kháng nalidixic acid và giảm nhạy với

fluoroquinolone Chủng S.Typhi kháng nalidixic acid và giảm nhạy với

fluoroquinolone đã gây ra đợt dịch ở Tajikistan năm 1997 làm 8000 người mắc bệnh trong 6 tháng và 150 người chết [61] Tình hình kháng fluoroquinolone sẽ

còn diễn biến phức tạp hơn khi chủng S.Typhi kháng hoàn toàn ciprofloxacin

đã được công bố tại Ấn Độ [79, 80], Bangladesh [3] Nepal [24] và Kuwait [30]

Theo số liệu gần đây ước tính sốt thương hàn làm 21.6 triệu người bị bệnh và 216.500 người chết trong năm 2000 [28] Tỉ lệ mắc sốt thương hàn cao (>100 ca/100.000 người/năm) ở Nam Á, Đông Nam Á và phía nam Châu Phi ; trung bình (10-100 ca/100.000 người/năm) ở phần còn lại của Châu Á, Châu Phi, Mỹ Latin, Châu Đại Dương (ngoại trừ Úc và New Zeland); tỉ lệ nhiễm thấp ở phần còn lại của thế giới (<10 ca/100.000 người/năm) (hình 1.4) Ở các nước trong vùng dịch, hầu hết người mắc bệnh là trẻ em 1-5 tuổi và thanh niên [14] Đa số ca nhiễm đều tập trung ở những nước đang phát triển như Việt Nam, Nepal, Ấn Độ, Bangladesh …Ở các nước phát triển như Mỹ, sốt thương hàn chủ yếu ở khách du lịch trở về từ vùng có dịch Theo số liệu báo cáo từ năm 1993-1999 tại Mỹ có 1393 ca nhiễm sốt thương hàn, trong đó 74% liên quan đến những người trở về từ vùng có dịch [67]

Hình 1.4 : Sự phân bố địa lý của sốt thương hàn năm 2000 [28]

1.6.2 Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt

thương hàn tại Việt Nam [24] [42, 70] [58] [20, 83, 101, 102]

Việt Nam là một trong những nước phải đối mặt với sốt thương hàn trong nhiều năm qua, đặc biệt là các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và một số

vùng của thành phố Hồ Chí Minh Chủng S.Typhi gây sốt thương hàn kháng

chloramphenicol đầu tiên được phân lập năm 1973 tại bệnh viện Chợ Quán [20] Tỉ lệ chủng phân lập kháng chloramphenicol tăng đến 80% vào năm 1975 nhưng sau đó giảm xuống 54% khi co-trimoxazole được sử dụng thay thế cho chloramphenicol trong điều trị sốt thương hàn [42, 58] Năm 1995, 90% chủng

S.Typhi phân lập từ mẫu cấy máu ở bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh

đều là chủng đa kháng thuốc và số bệnh nhân nhập viện tăng vọt Fluoroquinolone sau đó được sử dụng rộng rãi trong điều trị sốt thương hàn ở bệnh viện và trong cộng đồng Điều này giúp giảm số ca nhập viện trong năm

1996 và đầu năm 1997

Cuối năm 1997 và đầu năm 1998, dịch bệnh lại xuất hiện tại một số

quận của thành phố Hồ Chí Minh, gây ra bởi chủng S.Typhi đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid [69] Năm 1998, 87% chủng S.Typhi phân lập kháng với

nalidixic acid Từ năm 1998, số lượng bệnh nhân sốt thương hàn nhập viện vào bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh giảm đáng kể Tuy nhiên tại một số tỉnh của đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Kiên Giang…sốt thương hàn vẫn rất phổ biến

Ở S.Typhi, sự kháng nalidixic acid xảy ra do các đột biến điểm trong vùng gen gyrA mã hóa cho tiểu đơn vị A của men gyrase (còn gọi là vùng quyết

định cho sự kháng quinolone) [19, 102] Các đột biến này gây ra sự thay thế amino acid tại vị trí serine 83 hoặc aspartate 87, do đó làm thay đổi cấu trúc của gyrase, là men giúp cho quá trình sao chép DNA của vi khuẩn [24, 69, 102]

Trong nghiên cứu công bố năm 2006 của Roumagnac thì ở Việt Nam

đang có sự mở rộng của quần thể vi khuẩn S.Typhi kháng nalidixic acid [83] Hầu hết các chủng S.Typhi kháng nalidixic acid phân lập ở Việt Nam đều là

chủng đa kháng thuốc [24] Những chủng này gây giới hạn lựa chọn kháng sinh, tăng nguy cơ thất bại điều trị (lên đến 20%) và kéo dài giai đoạn mang khuẩn trong phân [70, 72]

1.7 Các phương pháp phân biệt S.Typhi trong nghiên cứu dịch tễ và tìm

hiểu cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi

Tình hình dịch tễ sốt thương hàn và kháng kháng sinh của S.Typhi cho

thấy sốt thương hàn vẫn là vấn đề y tế quan trọng ở Việt Nam và trên thế giới

Có nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển nhằm nghiên cứu dịch tễ

cũng như tìm hiểu cấu trúc di truyền của S.Typhi, bao gồm các phương pháp cổ điển và các phương pháp dựa trên DNA

1.7.1 Các phương pháp cổ điển dựa trên kiểu hình

Trong các phương pháp phân biệt S.Typhi dựa trên kiểu hình như phage typing,

plasmid typing, MLEE (multilocus enzyme electrophoresis)… thì phage typing được xem là phương pháp có hiệu quả phân biệt tốt nhất

Phage typing [4-7, 10, 35, 88, 92]

Hình 1.5 Biểu đồ kháng kháng sinh của S.Typhi phân lập từ các nghiên cứu lâm

sàng ở miền Nam Việt Nam từ 1993-2005

Biểu đồ thể hiện % của các chủng đa kháng; % các chủng kháng nalidixic acid và số lượng chủng phân lập được mỗi năm [23]

Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một chủng vi khuẩn mà không thể ly giải chủng vi khuẩn khác trong cùng một loài [6, 7, 92] Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa trên tính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác nhau

Phương pháp Vi-phage typing cho S.Typhi cũng dựa trên nguyên tắc

trên, sử dụng các Vi-phage là các phage chỉ tấn công và gây ly giải vi khuẩn có kháng nguyên Vi Vi khuẩn được trải lên môi trường thạch đã kẽ ô ở mặt dưới

Mỗi ô được bơm vào một phage riêng biệt Các chủng S.Typhi sẽ được phân

biệt thành các kiểu Vi khác nhau dựa trên tính nhạy khác nhau của chúng với

hỗn hợp phage này Ví dụ S.Typhi kiểu Vi A có đặc tính nhạy với toàn bộ phage trong hỗn hợp Hiện nay có tổng cộng 33 kiểu Vi của chủng S.Typhi

Vi-được công nhận trên toàn thế giới [7]

Phage typing là phương pháp đầu tiên nhằm phân biệt S.Typhi trong các

nghiên cứu về dịch tễ thương hàn và cho hiệu quả khá tốt Tuy nhiên phương pháp này vẫn nặng về kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm chuẩn như International Reference Laboratory for Enteric Phage Typing (London) Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế do độ đa dạng của hỗn hợp phage không cao, đặc biệt khi chủng phân lập trong một

vùng địa phương Ngoài ra nhiều chủng S.Typhi không thể xác định được kiểu

Vi do chúng kháng với hoạt động của các Vi-phage hoặc phản ứng chéo với nhiều loại Vi-phage khác nhau

Plasmid typing là phương pháp phân biệt S.Typhi dựa trên khác biệt về

kiểu hình cắt giới hạn của plasmid Phương pháp này không có hiệu quả do

không phải chủng S.Typhi nào cũng mang plasmid và plasmid lại là một nhân

tố có thể di chuyển được

MLEE (multilocus enzyme electrophoresis) là phương pháp phân tích

cấu trúc di truyền dựa vào sự khác biệt điện di của 24 enzyme bảo tồn trong tế

bào chất của vi khuẩn S.Typhi (tương ứng với 24 locus) Khác biệt về điện di

của mỗi enzyme được xem là các alen tại locus gen tương ứng Sự kết hợp khác nhau của các alen tại nhiều locus tạo thành một kiểu di truyền đa locus

(multilocus genotypes) Phương pháp này có hiệu quả phân biệt rất thấp, khi áp

dụng phân tích 24 locus gen của 334 chủng S.Typhi phân lập khắp nơi trên thế

giới chỉ thu được hai kiểu di truyền [87]

1.7.2 Các phương pháp phân tử dựa vào DNA

Những hạn chế của các phương pháp cổ điển đã thúc đẩy sự ra đời của các phương pháp phân tử Có rất nhiều phương pháp khác nhau đã được phát

triển để phân biệt S.Typhi dựa vào trình tự DNA của chúng

Phương pháp phân biệt dựa vào trình tự gắn chèn IS200 ở S.Typhi

Trình tự gắn chèn IS200 là một nhân tố di truyền có thể di chuyển được,

mô tả lần đầu tiên vào năm 1983 bởi Lam và Roth [56] Ở E.coli không có trình

tự này Trình tự IS200 được tìm thấy trên các locus bảo tồn ở nhiễm sắc thể của

nhiều týp huyết thanh của Salmonella Trong nghiên cứu của mình, Gibert đã

xác định số lượng nhân tố IS200 trên 15 chủng S.Typhi dao động từ 10-25 Do

số lượng bản sao nhiều và khác biệt đáng kể nên IS200 được xem là chỉ thị thích hợp để phân biệt các kiểu di truyền ở S.Typhi [13, 36, 56]

Tuy nhiên trong một nghiên cứu dịch tễ sử dụng trình tự IS200 để phân biệt các kiểu di truyền ở S.Typhi chỉ tìm được 11-15 nhân tố IS200 trên nhiễm sắc thể S.Typhi Dựa vào các trình tự này có thể xác định được một số kiểu di truyền ở S.Typhi nhưng hiệu quả phân biệt không cao [65]

Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphic DNA)

RAPD (tính đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các đoạn oligonucleotide ngắn, mạch đơn, bắt cặp ngẫu nhiên vào DNA và làm mồi cho sự tổng hợp các đoạn DNA bằng PCR Kích thước các đoạn khuếch đại tùy thuộc vào khoảng cách giữa các vị trí gắn của oligonucleotide Kỹ thuật này không đòi hỏi phải biết trước trình tự DNA và toàn bộ nhiễm sắc thể có thể dùng để so sánh [76]

Phương pháp này đã được áp dụng để phân loại S.Typhi và cho hiệu quả phân biệt khá cao Trong một nghiên cứu ở 63 chủng S.Typhi thu được 21 kiểu

đa hình các đoạn khuếch đại [90] Tuy nhiên phương pháp này có hiệu quả tin cậy không cao và thiếu lặp lại do sự không thống nhất giữa các phòng thí

nghiệm Việc sử dụng mồi, các loại men polymerase khác nhau; qui trình chuẩn

bị DNA khác nhau hay thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau đều có thể ảnh hưởng đến kết quả [92]

Phương pháp PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis)- Điện di trường xung

PFGE- điện di trường xung được xem là phương pháp phân tử hiệu quả trong nghiên cứu về dịch tễ học Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong phân tích so sánh DNA nhiễm sắc thể ở nhiều vi khuẩn gây bệnh trong

điều tra dịch tễ như methicillin-resistant Staphylococcus aureus,

Mycobacterium fortuitum, Pseudomonas cepacia [99] PFGE có hiệu quả

phân biệt cao hơn các phương pháp có sử dụng mẫu dò như ribotyping hay RFLP [98] Do đó phương pháp này được xem là một tiêu chuẩn vàng trong các phương pháp phân biệt bằng sinh học phân tử [92]

Trong một nghiên cứu trên 158 chủng S.Typhi phân lập từ các đợt dịch

và các ca riêng rẻ bằng PFGE cho thấy các chủng phân lập riêng rẻ có độ đa dạng về kiểu điện di trường xung cao hơn các chủng phân lập từ các đợt dịch

Trong 18 chủng S.Typhi phân lập riêng rẻ thu được đến 13 kiểu điện di trường

xung Mẫu phân lập từ các đợt dịch chỉ thu được rất ít kiểu điện di trường xung

Kết quả này cho thấy PFGE là phương pháp phù hợp để phân biệt S.Typhi

trong nghiên cứu về dịch tễ [99]

Điểm hạn chế của phương pháp này là thời gian thực hiện kéo dài 2-3 ngày, đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng đáp ứng được [92] Phương pháp điện di trường xung chỉ giới hạn ở nghiên cứu dịch tễ chứ không thể cung cấp thông tin về cấu trúc di truyền của quần thể vi khuẩn này

Phương pháp MLST (multilocus sequence typing )

MLST (multilocus sequence typing) là phương pháp được phát triển gần đây nhằm xác định cấu trúc di truyền của quần thể vi khuẩn gây bệnh Phương pháp này dựa trên việc so sánh độ đa dạng trình tự của nhiều gen “giữ nhà” (house-keeping genes) giữa các chủng với nhau Gen “giữ nhà” là những gen quan trọng, không thể thiếu cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Phương

pháp MLST đã được áp dụng thành công ở nhiều vi khuẩn đường ruột khác

như E.coli, Shigella, Campylobacter… và được xem là phương pháp có tính

phân biệt cao [31, 66, 89]

Một tập hợp 7 gen “giữ nhà” được chọn nằm rải rác trên nhiễm sắc thể

của S.Typhi CT18 bao gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD

(histidinol dehydrogenase), purE (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase), sucA (alpha ketoglutaratedehydrogenase) và thrA

(aspartokinase+homoserine dehydrogenase) Các gen này được giải trình tự

(tổng cộng 3336 bp) và được dùng để phân biệt 26 chủng S.Typhi phân lập

khắp nơi trên thế giới từ năm 1918 đến 2000) Tuy nhiên kết quả chỉ tìm thấy

có 3 vị trí đa hình ở 26 chủng này và 4 loại trình tự [54]

Mặc dù hiệu quả phân biệt không cao nhưng phương pháp MLST cũng

đã xác định được các kiểu di truyền phổ biến Đây cũng là lần đầu tiên S.Typhi

được phân biệt bằng công cụ giải trình tự gen [54] Mở đầu cho các nghiên cứu

trên quần thể S.Typhi ở mức độ giải trình tự gen bằng các kỹ thuật giải trình tự

hiện đại

SNP typing (Single Nucleotide Polymorphism typing)

Sự phát triển của các kỹ thuật giải trình tự DNA tự động đã giúp phát

triển những phương pháp hiệu quả hơn để phân biệt các chủng S.Typhi, giúp

tìm hiểu dịch tễ học phân tử cũng như cấu trúc di truyền của quần thể này Một trong những phương pháp được nhắc đến nhiều nhất hiện nay là SNP typing

Đây là phương pháp phân biệt các chủng S.Typhi dựa trên các vị trí đa hình

nằm rải rác trên bộ gen của chúng

Trong nghiên cứu SNP typing bằng công cụ dHPLC (denaturing high performance liquid chromatography), Roumagnac và cộng sự đã tìm được 88

SNP từ 199 đoạn gen (khoảng 88.739 bp) của 105 chủng S.Typhi phân lập từ khắp nơi trên thế giới Sau khi phân tích dữ liệu SNP này, S.Typhi được phân

thành 59 haplotype di truyền khác nhau (hình 1.6) [83]

Trên 199 đoạn gen của tập hợp chủng thu nhận trên toàn cầu chỉ tìm

được 88 vị trí đa hình cho thấy mức độ đa dạng trình tự rất thấp ở S.Typhi Do

đó cần có những nghiên cứu sâu hơn ở mức độ toàn bộ gen để hiểu rõ hơn nữa

các biến đổi trên toàn bộ bộ gen trong quần thể S.Typhi [52] Năm 2008, với sự

phát triển của các phương pháp giải trình tự tự động (454, solexa sequencing),

Kathryn và cộng sự đã chọn 17 chủng S.Typhi từ các haplotype khác nhau dựa

trên nghiên cứu của Roumagnac để giải trình tự bộ gen bằng 454 và solexa sequencing So sánh trình tự bộ gen của 17 chủng này cộng với 2 chủng đã giải trình tự bộ gen trước đó là CT18 và Ty2 đã xác định được 1787 SNP Phân tích

dữ liệu SNP cho thấy kết quả xác định haplotype phù hợp với nghiên cứu của Roumagnac tuy nhiên độ chính xác và phân biệt cao hơn [52] Những dữ liệu SNP này rất quan trọng và là tiền đề cho những nghiên cứu dựa vào SNP

typing ở S.Typhi sau này

Ngoài ra việc giải trình tự bộ gen các chủng S.Typhi đã cung cấp những

chỉ thị di truyền quan trọng là các đoạn bị mất và gắn chèn (in-dels) nằm rải rác

trên nhiễm sắc thể của S.Typhi Các đoạn gắn chèn-bị mất này đặc trưng cho các haplotype di truyền ở S.Typhi Kết quả nghiên cứu của Roumagnac và

Kathryn là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu này

1.8 Phát triển phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe

amplification) trong phân biệt các chủng S.Typhi

1.8.1 Giới thiệu phương pháp MLPA

Như đã trình bày ở trên, có rất nhiều phương pháp khác nhau được phát

triển để phân biệt các chủng S.Typhi Các phương pháp này ở một mức độ nào

đó đều cung cấp một số thông tin về sự đa dạng kiểu hình hay kiểu gen ở các

chủng S.Typhi Tuy nhiên, ngoài SNP typing thì các phương pháp còn lại đều

có hiệu quả phân biệt không cao, thiếu sự lặp lại và không cung cấp những

thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các dòng S.Typhi khác nhau

Mặc dù phương pháp SNP typing được đánh giá cao hiện nay nhưng các

kỹ thuật sử dụng để phát hiện SNP đều phức tạp, đòi hỏi thiết bị hiện đại, đắt tiền Những điều này hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử ở các nước trong vùng dịch tễ thương hàn khó đáp ứng được Do đó SNP typing chưa

thể được áp dụng để nghiên cứu S.Typhi ở những nơi này

Để tìm hiểu dịch tễ học phân tử cũng như cấu trúc di truyền của quần thể

S.Typhi ở các nước đang phát triển cần phải có một phương pháp đơn giản hơn

nhưng hiệu quả phân biệt cao và lặp lại MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification) được xem là phương pháp đáp ứng các yêu cầu trên Phương pháp này được phát triển dựa vào các kết quả trong nghiên cứu của Roumagnac và của Kathryn

MLPA là một phương pháp dựa vào PCR giúp phát hiện đồng thời các khác biệt trên trình tự DNA hay RNA Phương pháp này lần đầu tiên được sử dụng để phát hiện những bất thường trên DNA như các đoạn gắn chèn, bị mất gây ra các bệnh di truyền nghiêm trọng ở người như chứng rối loạn thần kinh

ngoại vi Charcot-Marie-Tooth do sự thay đổi số lượng bản sao của gen pmp22 ;

bệnh ung thư vú do mất hoặc thêm một hoặc nhiều exon ở gen ức chế ung thư

vú brca ; bệnh ung thư ruột do mất exon ở gen msh2 hoặc mlh1; bệnh Down do

đột biến 3 nhiễm sắc thể 21 [39-41, 93, 95, 97] Ở mức độ prokaryote MLPA

cũng đã được áp dụng để phát hiện đồng thời các đột biến kháng thuốc và các

đột biến đặc trưng cho từng kiểu di truyền khác nhau ở Mycobacterium

tuberculosis [12]

Như đã trình bày ở trên, trong nghiên cứu giải trình tự bộ gen của 19

chủng S.Typhi, Kathryn và cộng sự đã xác định được các đoạn bị mất và các đoạn gắn chèn đặc trưng cho các haplotype ở S.Typhi [52] Chẳng hạn,

haplotype H58 có kiểu đoạn gắn chèn-bị mất là K,B,C,E/K,B,C,E,N/K,B,C,E,H; haplotype H52 có kiểu đoạn gắn chèn-bị mất

là K,B,C,S…(hình 1.7) Do đó chúng tôi đã phát triển phương pháp MLPA

nhằm xác định các haplotype ở S.Typhi thông qua phát hiện các đoạn gắn

chèn-bị mất này Không những vậy, MLPA còn được thiết kế để phát hiện các đột

biến gây kháng nalidixic acid của S.Typhi ở gen gyrA (cả ở codon 83 và codon 87) và đột biến ở gen parC MLPA vì vậy không những giúp xác định cấu trúc

di truyền trong quần thể S.Typhi mà còn kết hợp với xác định kiểu hình kháng

kháng sinh, mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quần thể vi khuẩn này

Hình 1.7 Cây phân loại các haplotype dựa vào trình tự gắn chèn và bị mất được cung cấp bởi Kathryn

Các màu ở các các nhánh tượng trưng cho các dòng khác nhau của các haplotype ở S.Typhi

Các chữ cái (A,B,…S) là tên các đoạn bị mất-đoạn gắn chèn tương ứng với từng haplotype Chiều dài của mỗi nhánh được tính dựa vào các phân tích dữ liệu SNP (các SNP này được

xác định thông qua giải trình tự bộ gen của 19 chủng S.Typhi) [52].

1.8.2 Nguyên tắc của MLPA

Nguyên tắc của phương pháp MLPA là sử dụng các các mẫu dò để nhận biết các trình tự mục tiêu Mỗi mẫu dò này là hai đoạn oligonucleotide có thể nối lại với nhau khi chúng gắn hoàn toàn vào trình tự đích Tất cả các mẫu dò đều có trình tự giống nhau ở đầu 5’và đầu 3’ để sau khi nối lại chúng có thể được khuếch đại đồng thời trong một phản ứng PCR duy nhất sử dụng chỉ một cặp mồi Với MLPA không phải DNA mục tiêu được khuếch đại mà các mẫu

dò nhận biết trình tự đích được khuếch đại Chỉ những mẫu dò nào gắn được vào trình tự đích mới được nối lại và sau đó được khuếch đại bằng PCR Mỗi mẫu dò được gắn với một trình tự stuffer có chiều dài khác nhau giúp cho các sản phẩm khuếch đại sẽ có một chiều dài duy nhất và đặc trưng cho trình tự đích Sau khi điện di, các sản phẩm khuếch đại được phân tích và các đoạn DNA mất đi hoặc được thêm vào sẽ dễ dàng xác định được

Mỗi mẫu dò oligonucleotide

có mang một trình tự stuffer

có chiều dài khác nhau

Hai phần của mỗi mẫu dò lai với các trình tự mục tiêu nằm gần nhau

Hai phần của mẫu dò lai thành công với trình tự đích được nối lại với nhau bằng men ligase

Sản phẩm khuếch đại của mỗi mẫu dò có một chiều dài duy nhất (130-480 bp) và được

1.8.3 Ưu điểm của kỹ thuật MLPA

So với các phương pháp SNP typing thì phương pháp MLPA rất nhanh,

rẻ, tính lặp lại rất cao, độ phân biệt tốt, rõ ràng và rất dễ dàng thực hiện Thiết

bị thực hiện phản ứng MLPA có ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân

tử là một máy chạy PCR và một thiết bị điện di mao quản hoặc điện di thông thường Phương pháp MLPA có thể phân biệt được đến 45 trình tự đích cùng lúc trong một phản ứng duy nhất [47, 86]

Để chắc chắn có thể phát hiện các haplotype bằng MLPA chúng tôi đã

so sánh phương pháp này với phương pháp Golden gate SNP typing Đây là một phương pháp SNP typing hiện đại và hiệu quả, được thực hiện với sự hợp tác của Viện Sanger ở Anh

1.9 Golden gate SNP typing

Golden gate SNP typing là kỹ thuật phân tích SNP tự động hóa cao, chính xác, có thể phát hiện đồng thời nhiều vị trí đa hình trên một bề mặt array

có gắn các hạt bead (bead array) [34, 91] Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc sử dụng các đoạn oligonucleotide nhận biết đặc hiệu vị trí từng SNP Các đoạn oligonucleotide này được gắn lên các hạt bead, sau đó các hạt bead này được phân phối ngẫu nhiên vào từng giếng nhỏ của Array (Sentrix Array Matrix) Cách thiết kế này giúp phát hiện đến 1536 vị trí đa hình trên một mẫu DNA và có thể thực hiện cùng lúc 96 mẫu, cung cấp thông tin lên đến 150.000 kiểu di truyền cùng lúc [34, 91].

Qui trình thực hiện Golden gate assay gồm 9 bước: Đầu tiên DNA được hoạt hóa, sau đó được lai với các oligonucleotide và các hạt từ 3 mồi (oligos) được thiết kế cho một vị trí SNP tại một locus, trong đó 2 mồi đặc trưng cho

các alen của vị trí SNP (Allele-Specific Oligos hay ASOs) Mồi thứ 3 gắn dưới

vị trí SNP vài bp là một mồi đặc hiệu cho locus (Locus-specific Oligo hay

LSO) Tất cả 3 trình tự mồi đều có vùng tương đồng trên bộ gen và vị trí mồi

toàn thế cho PCR Trình tự mồi đặc hiệu locus (LSO) còn có một trình tự mục tiêu duy nhất (address) nhắm đến một loại bead cụ thể Những mồi dư ra và không lai được với DNA bộ gen được loại bỏ qua những bước rửa nghiêm ngặt Sau đó các mồi ASO thích hợp được kéo dài và sản phẩm kéo dài được lai với mồi LSO giúp kết hợp thông tin của mỗi SNP với trình tự mục tiêu trên LSO Sản phẩm có chiều dài đầy đủ này được sử dụng làm mồi cho PCR với các mồi toàn thế P1, P2, P3 Trong đó P1 và P2 được đánh dấu với cy3 và cy5 Các đoạn DNA mạch đơn đánh dấu với thuốc nhuộm được lai với các loại bead mang trình tự bổ sung với chúng nhờ mang những đoạn trình tự mục tiêu duy nhất Các sản phẩm dược phân tách trên một bề mặt rắn, sau khi lai, một máy quét được sử dụng để phân tích tín hiệu huỳnh quang trên Sentrix Array Matrix, tín hiệu sau đó được phân tích sử dụng phần mềm giúp xác định các

SNP [112]

ASO1 ASO2

LSO

1: DNA được hoạt hóa (50ng/µl)

2: DNA được lai với các mồi và

gắn với các hạt từ Các mồi không

lai với DNA được khoanh tròn

3: Rửa loại bỏ các mồi dư và

không bắt cặp Kéo dài mồi đặc

hiệu alen sau đó thực hiện phản

ứng lai

4,5: Sản phẩm kéo dài và lai trên

được làm khuôn cho PCR bằng

các mỗi đánh dấu huỳnh quang

Sản phẩm PCR được biến tính

thành mạch đơn

6: Lai với Sentrix Array Matrix

7,8,9: Rửa và làm khô Array, đọc

tín hiệu huỳnh quang, phân tích và

báo cáo kết quả tự động bằng

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

217 chủng S.Typhi sử dụng trong nghiên cứu được phân lập từ những mẫu

lâm sàng trong chương trình nghiên cứu bệnh thương hàn ở miền Nam Việt Nam từ năm 1993-2005 và chương trình nghiên cứu vaccine của IVI (International Vaccine Institute) ở 8 nước Châu Á từ 2002-2004

Trong đó 73 chủng S.Typhi từ Việt Nam và các nước Châu Á được chọn

ngẫu nhiên để làm SNP typing bằng phương pháp Golden gate Assay tại viện Sanger (Anh) 19 chủng chứng bao gồm 16 chủng được cung cấp bởi viện Sanger, 2 chủng Việt Nam là CT18, AG3 và 1 chủng của Indonesia (J185SM) được sử dụng làm các haplotype đối chứng

Toàn bộ 217 chủng trong nghiên cứu đều được xác định kiểu di truyền bằng MLPA, bao gồm 73 chủng đã gửi đi viện Sanger để làm SNP typing

Ngoài ra 10 chủng S.Paratyphi phân lập từ 2004-2006 tại Ấn Độ cũng được

dùng làm nhóm chứng cho phương pháp MLPA

Tách chiết DNA bằng Wizard (Promega) Kít

73 chủng được làm SNP typing bằng

Golden gate Assay ở Viện Sanger (Anh)

217 chủng được xác định kiểu di truyền

b Môi trường và hóa chất

Bảng 2.1: Môi trường và cơ chất thử nghiệm đặc tính sinh hoá

thạch Kligler Iron Agar (KIA)

lên men/ oxihoá Urease

đồng hoá citrat tạo indol, H2S, di động lên men, tạo H2S

Thuốc thử Dung dịch đỏ methyl, dung dịch Kovack

(p- dimethylaminobenzaldehyde, amyl alcohol và HCl)

c Tiến hành

Một khóm trùng cần định danh được tạo huyền phù trong ống glucose phosphat, sau đó dùng que cấy để cấy chuyền huyền phù này vào 4 ống môi trường còn lại Đối với môi trường thạch nghiêng urê và citrat thì cấy theo kiểu zig-zac, còn môi trường thạch đứng Indol thì dùng que cấy thẳng đâm sâu vào khoảng 2/3 ống thạch Riêng ống KIA thì đâm sâu sau đó cấy zig-zac trên mặt thạch nghiêng Cấy một giọt huyền phù vi khuẩn vào đĩa NA (Nutrient agar) để kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn Ủ bộ môi trường đã cấy vi khuẩn và đĩa cấy thuần vào tủ ấm, nhiệt độ 37oC trong vòng 18-24 giờ Các đặc tính sinh hoá

của S.Typhi chỉ được xác định khi lứa cấy thuần trên đĩa NA

Thử nghiệm KIA (Kliger’s iron agar): đây là môi trường thạch nghiêng

có chứa dextrose và lactose, và chất chỉ thị màu được dùng là phenol đỏ Vi khuẩn được cấy thẳng xuống gần đáy ống thạch, cấy ria trên bề mặt thạch nghiêng, và ủ ở 370C trong 18 đến 24 giờ Kết quả được thể hiện như sau:

· Vi khuẩn không lên men: vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch nghiêng nhờ

phân hủy các thành phần protein trong môi trường thành các sản phẩm kiềm Bề mặt và phần đáy thạch nghiêng vẫn có màu đỏ

· Vi khuẩn lên men dextrose và không lên men lactose: trong vòng 12 giờ sau khi ủ, vi khuẩn lên men dextrose và tạo các sản phẩm có tính acid, làm môi trường và mặt thạch có màu vàng Tuy nhiên, sau 12 giờ, dextrose sử dụng hết, vi khuẩn trên bề mặt thạch tiếp tục tăng trưởng bằng phân hủy các thành phần protein trong môi trường Khoảng từ 18 đến 24 giờ sau, sản phẩm kiềm tạo ra làm môi trường trên bề mặt thạch lại trở nên đỏ

· Vi khuẩn lên men cả dextrose và lactose: bề mặt thạch nghiêng và phần

đáy môi trường có màu vàng

· Môi trường KIA cũng chứa natri thiosulfate (Na2S2O3) và sắt sulfate (FeSO4) làm chất chỉ thị cho việc tạo H2S Kết quả dương tính khi xung quanh môi trường xuất hiện tủa màu đen

Thử nghiệm Urease: xác định khả năng phân giải urea của vi sinh vật

do tác dụng của enzyme urease Thạch urê sẽ chuyển từ vàng sang hồng nếu vi khuẩn thoái hoá nitrat :

(NH2)2CO + 2H2O + urease ® CO2 + H2O + 2NH3 « (NH4)2CO3

Thử nghiệm citrate: nhằm xác định khả năng sử dụng citrate và muối

ammonium như nguồn carbon và nitơ duy nhất của vi khuẩn Vi khuẩn biến dưỡng citrate dùng muối ammonium tạo ammonia và làm kiềm hóa môi trường Chất chỉ thị sử dụng trong thử nghiệm này là bromthymol blue (trung tính: màu xanh lá cây, pH>7,6: màu xanh thẫm) Thạch có màu như sau :

+ Màu xanh dương (Bromthymol) nếu vi khuẩn sử dụng nitrat và tạo ra nhiều

NH3+ làm pH của môi trường trở nên kiềm

+ Không đổi màu nếu vi khuẩn không sử dụng citrat (pH <6)

Thử nghiệm indole: nhằm xác định khả năng thủy giải tryptophan nhờ

enzyme tryptophanase thành indole của vi sinh vật Indole tạo thành được phát hiện bằng phản ứng với dung dịch Kovac (para-dimethylaminobenzaldehyde

trong cồn), màu của thuốc thử sẽ chuyển từ vàng sang đỏ nếu môi trường có xuất hiện Indol

Sự tạo khí, di động và hình thành H2S của vi khuẩn có thể được quan sát trong

ống thạch indol và thạch KIA vì trong hai thạch này đều có chứa gốc sulphat

Thử nghiệm đỏ methyl: đây là thử nghiệm định tính về khả năng một

vi khuẩn lên men glucose thành những sản phẩm có tính acid cao hay thành những sản phẩm ít tính acid như ethanol hay butanediol Thử nghiệm này dùng

đỏ methyl làm chất chỉ thị pH (có màu đỏ khi độ pH của môi trường thấp hơn 4,4)

Phản ứng sinh hóa đặc trưng của S.Typhi là lên men glucose nhưng

không lên men lactose, không sinh hơi trong môi trường KIA, không sinh indole, không sử dụng citrat và ure, di động và sinh một ít H2S

Những chủng có đặc tính sinh hóa không rõ sẽ được kiểm tra lại bằng kít Api20E

2.3.1.2 Định danh sinh hóa bằng Kít Api 20E (Biomerieux, Paris, Pháp)

Bộ kít API 20E là hệ thống định danh được chuẩn hóa đối với nhóm

Enterobacteriaceae sử dụng 20 phản ứng sinh hóa kết hợp thử nghiệm oxidase

và phân tích kết quả dựa trên phần mềm vi tính Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất và kết quả thu nhận được sẽ được tra với cơ sở dữ liệu để định danh vi khuẩn

Hình 2.1 : Thử nghiệm sinh hóa cơ bản trong định danh S.Typhi

A: Các ống thử nghiệm sinh hóa khi chưa có vi khuẩn

B: Các kết quả sinh hóa cơ bản của S.Typhi