Pháp).
Bộ kít API 20E là hệ thống định danh được chuẩn hóa đối với nhóm
Enterobacteriaceae sử dụng 20 phản ứng sinh hóa kết hợp thử nghiệm oxidase
và phân tích kết quả dựa trên phần mềm vi tính. Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất và kết quả thu nhận được sẽ được tra với cơ sở dữ liệu để định danh vi khuẩn.
Hình 2.1 : Thử nghiệm sinh hóa cơ bản trong định danh S.Typhi A: Các ống thử nghiệm sinh hóa khi chưa có vi khuẩn
Hình 2.2: Kết quả que thử API 20E cho S.Typhi
Các thử nghiệm bao gồm: ONPG (b-galactosidase), ADH (khử CO2 của arginine bằng arginine dihydrolase), LDC (khử CO2 của lysine bằng lysine decarboxylase), ODC (khử CO2 của ornithine bằng ornithine decarboxylase), CIT (sử dụng citrat như
nguồn C duy nhất), H2S (hydrogen sulfide), URE (urease), TDA (tryptophan deaminase), IND: (tryptophanase, Indole phát hiện bằng thuốc thử Kovac), VP (thử
nghiệm Voges-Proskauer), GEL (gelatinase ), GLU (lên men glucose), MAN (mannose), INO (inositol), SOR (lên men sorbitol), RHA (lên men rhamnose), SAC (lên men sucrose), MEL (lên men melibiose), AMY (lên men amygdalin), ARA (lên men arabinose) và OX (cytochrome oxidase).
Bằng thử nghiệm API20E này S.Typhi được phát hiện khi cho phản ứng LDC và H2S dương tính. Sử dụng được glucose (GLU), manitol (MAN), sorbitol (SOR), melibiose (MEL) và oxidase âm tính.
2.3.1.3. Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên– kháng thể
a. Nguyên tắc
Dựa vào sự tạo thành các lực nối tĩnh điện hoặc các nối đồng trị giữa các kháng thể đã biết và kháng nguyên trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA Oxid -ase
Vì mục tiêu định danh vi khuẩn S.Typhi nên chúng tôi chỉ sử dụng các hóa chất thử nghiệm kháng huyết thanh cơ bản PSO (Polyvalent O), O9, O2 và Vi (Virulence).
· PSO là kháng huyết thanh được sử dụng để phát hiện các nhóm vi khuẩn có mang kháng nguyên O thuộc giống Salmonella từ nhóm A
đến nhóm G
· O9 tạo ngưng kết đặc hiệu với kháng nguyên thân của nhóm
Salmonella enterica.
· O2 là kháng huyết thanh đặc hiệu cho kháng nguyên O S.Paratyphi A, được sử dụng như một thử nghiệm âm tính trong phản ứng xác định
S.Typhi
· Vi: là kháng huyết thanh đặc hiệu tạo ngưng kết với kháng nguyên Vi. Các thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên kháng thể cần được thực hiện đúng thứ tự định danh từ giống rồi đến loài để tránh các hiện tượng ngưng kết chéo.
b. Hóa chất và dụng cụ
· Bộ hóa chất kháng huyết thanh gồm 4 lọ: PSO, O9, O2 và Vi (Murex, Anh) (xem hình 2.3).
· Nước muối sinh lý.
· Phiến kính, que cấy, đèn bun-sen.
c. Tiến hành
Hoà tan một khóm trùng trong một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính sạch, kiểm tra loại trừ phản ứng tự ngưng kết. Nhỏ 10µl kháng huyết thanh vào. Dùng que hoà đều, quan sát kết quả sau một phút. Phản ứng ngưng kết dương tính khi có sự tạo thành các hạt tủa, phản ứng âm tính khi dung dịch đồng nhất không xuất hiện các hạt tủa. Thông thường, các thí nghiệm ngưng kết đều phải thực hiện đồng thời một huyền phù vi khuẩn để đối chứng.
2.3.2. Xác định kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu MIC
(Minimum inhibitory concentration) [45, 106]
a. Nguyên tắc
Kháng sinh đồ được xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa: Đặt các đĩa kháng sinh chứa những hàm lượng đã biết lên bề mặt của một đĩa agar (ở đây sử dụng môi trường Muller-Hinton) chứa môi trường không chọn lọc đã được trải vi khuẩn cần xác định. Kháng sinh sẽ khuếch tán ra môi trường tạo nên vòng ức chế sự phát triển của vi khuẩn xung quanh đĩa, đường kính tương ứng với tính nhạy của vi khuẩn với kháng sinh đó. Các vòng ức chế vi khuẩn được đo đường kính và so sánh với tiêu chuẩn cho phép xác định được chủng vi khuẩn nhạy, trung gian hay kháng với kháng sinh sử dụng.
Nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn được xác định bằng E-test. Kháng sinh được thiết kế thành dãy với nồng độ tăng dần tùy loại kháng sinh (hình 2.4). Kết quả được xác định dựa vào hướng dẫn của AB Biodisk. Phương pháp này giúp xác định chính xác nồng độ MIC.
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm kháng sinh phải là môi trường không chứa các yếu tố ức chế hoạt động kháng sinh, có pH trung tính (7,2-7,4), nồng độ cation hoá trị II (Ca2+, Mg2+ ) không được quá cao vì những ion này có thể kết hợp với thuốc kháng sinh hoặc vi khuẩn làm sai lệch kết quả.
b. Môi trường và dụng cụ
- Môi trường
Chúng tôi sử dụng môi trường thạch MH trong thí nghiệm thử độ nhạy cảm kháng sinh của S.Typhi. Độ dày của thạch phải đúng 4mm. Thành phần môi trường gồm cao thịt bò (300 g/l), casein hydrolysate (17,5 g/l), tinh bột (1.5g/l), agar (17,0 g/l), pH 7.4± 0.2 [18].
- Kháng sinh
Các đĩa kháng sinh (Oxoid) và que kháng sinh Etest (AB Biodisk, Solna,
Thụy Điển) được sử dụng cho các kháng sinh: Ampicillin, Trimethoprim -
sulfamethoxazole, Chloramphenicol, Nalidixic acid, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Gatifloxacin, Ceftriazone va Azithromycin.
Tất cả các loại kháng sinh đều không được tiếp xúc với không khí, khi thao tác phải thực hiện ở nhiệt độ phòng và bảo quản ở < 40
C.
- Dụng cụ và thiết bị
Lọ nước cất vô trùng 2ml; tăm bông, que cấy, đèn bun-sen; tủ ấm 37o C (Jencons, Anh).
c. Tiến hành
Tạo huyền phù vi trùng trong 2 ml dung dịch nước cất sao cho mật độ vi trùng khoảng 0,5 McFarland. Sử dụng tăm bông để trải đều canh vi khuẩn lên bề mặt thạch MH theo phương pháp phết ba chiều.
Đối với thử nghiệm kháng sinh đồ: Đặt đĩa kháng sinh lên đĩa môi trường MH đã được trải vi khuẩn, ủ đĩa ở 37oC. Sau 12-16 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn.
Đối với thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Đặt thanh E-test với từng loại kháng sinh lên đĩa đã được cấy trải. Ủ đĩa ở 37oC và đọc kết quả sau 12-16 giờ.
Kết quả nhạy, trung gian và kháng kháng sinh được đọc theo Viện Các Tiêu Chuẩn Trong Phòng Thí Nghiệm và Lâm Sàng (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) (bảng 2.2).
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn về một số kháng sinh của họ vi khuẩn
Tên kháng sinh Lượng kháng sinh Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Giá trị MIC (µg/ml)
Kháng Trung gian Nhạy Kháng Nhạy Ampicillin 10 µg ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 ≥ 32 ≤ 8 Trimethoprim - sulfamethoxazole 23,75 µg ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 ≥ 8/152 ≤ 2 / 38 Chloramphenicol 30 µg ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 ≥ 32 ≤ 8 Nalidixic acid 30 µg ≤ 14 14 - 18 ≥ 19 ≥ 32 ≤ 8 Tetracycline 30 µg ≤ 14 15 - 18 ≥ 19 ≥ 16 ≤ 4 Gentamicin 10 µg ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 ≥ 8 ≤ 4 Ofloxacin 5 µg ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 ≥ 8 ≤ 2 Ciprofloxacin 5 µg ≤ 15 16 - 20 ≥ 21 ≥ 4 ≤ 1 Gatifloxacin 5 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ≥ 8 ≤ 2 Ceftriazone 30 µg ≤ 13 14 - 20 ≥ 21 ≥ 64 ≤ 8 Ceftazidime 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ≥ 32 ≤ 8