Cây phát sinh loài của 92 chủng S.Typhi bao gồm 73 chủng S.Typhi từ
các nước châu Á và 19 chủng đối chứng được xây dựng từ các dữ liệu SNP thu được bằng phương pháp Golden gate SNP typing. Sử dụng chương trình phân tích RaxML (Randomized Axelerated Maximum Likelihood), phương pháp maximum-likelihood và mô hình GTR (general time-reversible). Cây phát sinh loài được vẽ bằng phần mềm Dendroscops V 2.3.
Dữ liệu MLPA được dùng để dựng cây phân loại bằng phần mềm Bionumeric V5.10.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ-
3.1 Kết quả xác nhận S.Typhi bằng các phản ứng sinh hóa và Kít Api 20E
Các chủng S.Typhi sử dụng trong nghiên cứu được phân lập từ những mẫu lâm sàng trong chương trình nghiên cứu bệnh thương hàn ở miền Nam Việt Nam từ năm 1993-2005 và chương trình nghiên cứu vaccine của IVI (International Vaccine Institute) ở8 nước Châu Á từ 2002-2004.
Hầu hết các chủng (197/217) đều thể hiện các đặc điểm sinh hóa cơ bản đặc
trưng của S.Typhi như lên men glucose nhưng không lên men lactose, không sinh
hơi trong môi trường KIA, không sinh indole, không sử dụng citrat và ure, di
động và sinh một ít H2S.
20 chủng cho kết quả không rõ ràng do khả năng sinh H2S yếu và một số
cho thử nghiệm đỏ methyl không rõ ràng. Các chủng này được kiểm tra lại bằng bộ kít Api 20E theo phương pháp đã trình bày (2.3.1.2). Kết quả xác nhận các chủng này đều là S.Typhi.
Sau khi được xác nhận bằng đặc điểm sinh hóa, các chủng S.Typhi được thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh với các bộ kít thử nghiệm kháng huyết
thanh cơ bản (2.3.1.3) để xác nhận kết quả sinh hóa. Kết quả cho thấy tất cả các chủng đều dương với PSO, O9, âm tính với O2 và 98% (212/217) dương với Vi. Chỉ có 5 chủng âm với Vi (2 chủng của Ấn Độ, 1 của Trung Quốc, 1 của Pakistan và 1 của Indonesia)
Kết quả phản ứng sinh hóa và ngưng kết kháng huyết thanh cơ bản của
S.Typhi:
KIA H2S Gas Di động Indol Ure Citrat Đỏ methyl PSO O9 O2 Vi Alk/axít + - + - - - + + + - + Tóm lại kết quả xác nhận chủng nhận được đều là S.Typhi.
3.2. Kết quả kháng sinh đồ và MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của các chủng S.Typhi phân lập ở Việt Nam và các nước Châu Á
Kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu đối với các kháng sinh ampicillin, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol, nalidixic acid,
ofloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, ceftriazone và azithromycin của S.Typhi
được xác định theo phương pháp đã trình bày (2.3.2).
3.2.1. Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng
S.Typhi phân lập ở Việt Nam
Trong 88 chủng phân lập tại Việt Nam từ năm 1993-2005 có đến 79/88 chủng (89%) kháng với nalidixic acid và 57/88 chủng (64%) đa kháng thuốc (bảng 3.1). 56/88 chủng (63%) vừa đa kháng thuốc vừa kháng đồng thời với nalidixic acid.
Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng Na của chủng S.Typhi phân lập tại Việt Nam
cao hơn hẳn so với các nước khác (bảng 3.1), mặc dù các nước này cũng được
xem là vùng lưu hành dịch phổ biến và có tỉ lệ mắc sốt thương hàn cao nhất thế
giới. Điều quan trọng là hầu hết các chủng đa kháng thuốc ở Việt Nam đều kháng
đồng thời với Na. Những chủng này không những làm hạn chế sự lựa chọn kháng
sinh trong điều trị mà sự kháng Na còn làm giảm nhạy với fluoroquinolone dẫn
đến thời gian điều trị kéo dài, tăng liều điều trị, tỉ lệ biến chứng và nguy cơ thất bại cao[8, 21, 49].
Các chủng S.Typhi tại Việt Nam được phân lập trong 13 năm (1993-2005)
nhưng 89% số chủng kháng với nalidixic acid, điều đó cho thấy có sự lan rộng và duy trì của quần thể S.Typhi kháng nalidixic acid. Nguyên nhân có thể do áp lực chọn lọc mạnh từ việc sử dụng fluoroquinolone trong điều trị các chủng S.Typhi
đa kháng thuốc tại Việt Nam [83].
Tóm lại tại miền Nam Việt Nam đang có sự mở rộng và duy trì của quần thể
S.Typhi kháng nalidixic acid và chủng S.Typhi đa kháng thuốc thường đi kèm với kháng nalidixic acid.
Bảng 3.1: Tỉ lệ S.Typhi kháng nalidixic acid và đa kháng thuốc ở Việt Nam và một số nước Châu Á.
Việt Nam Ấn Độ Bangladesh Pakistan Trung Quốc Indonesia Lào Nepal Tổng
Số chủng 88 29 17 18 16 14 21 14 217
Kháng Na 79 20 7 8 1 0 1 3 119
% Kháng Na 89 69 41 44 6 0 5 21 % MDR 64 10 41 44 0 0 33 0
Biểu đồ đa kháng thuốc và kháng Na của S.Typhi ở Việt Nam và một số
nước Châu Á 79 20 7 8 1 0 1 3 57 3 7 8 0 0 7 0
Việt Nam Ấn Độ Bangladesh Pakistan Trung Quốc Indonesia Lào Nepal
Nước S ố ch ủ n g Kháng Na MDR
3.2.2. Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng
S.Typhi phân lập ở một số nước Châu Á
Trong các nước Châu Á thì chủng S.Typhi phân lập từ Ấn Độ có tỉ lệ kháng Na cao nhất 69% (20/29 chủng), tiếp theo là Pakistan 44% (8/18 chủng), Bangladesh 41% (7/17 chủng), Nepal 21% (3/14 chủng), Trung Quốc 6% (1/16 chủng), Lào 5% (1/21 chủng) và cuối cùng là Indonesia không có chủng nào kháng Nalidixic acid (bảng 3.1).
Tỉ lệ đa kháng thuốc của chủng S.Typhi phân lập từ các nước dao động từ
0-44% trong đó cao nhất là Pakistan 44% (8/18 chủng). Trong nghiên cứu này,
S.Typhi đa kháng thuốc không được tìm thấy ở chủng phân lập từ Trung Quốc, Nepal và Indonesia (hình 3.1).
Tuy tỉ lệ thống kê chỉ dựa trên một số ít chủng nhưng qua đó chúng tôi
nhận thấy tỉ lệ kháng Na của S.Typhi khá cao, phổ biến nhất là Việt Nam và các quốc gia láng giềng ở Nam Á như Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Nepal. Điều đó
nói lên S.Typhi kháng Na không chỉ là vấn đề riêng của vùng địa lý nào mà là vấn Hình 3.1: Biểu đồđa kháng và kháng Na của S.Typhi ở Việt Nam và một số
nước Châu Á (N=số chủng)
đề chung của các nước đang phát triển trong vùng có dịch. Nhiều nước trong sốđó là điểm đến hấp dẫn của khách du lịch, điều này làm tăng nguy cơ lây lan S.Typhi. Khách du lịch trở về từ các vùng có dịch có thể trở thành những người mang
S.Typhi mãn tính và có khả năng làm lây lan vi khuẩn ra cộng đồng.
Khác với những quốc gia Đông Nam Á khác, Indonesia là nước mà S.Typhi vẫn nhạy với các kháng sinh thế hệ đầu trong điều trị sốt thương hàn, tỉ lệ kháng
chloramphenicol năm 2001 là 1.04% và chloramphenicol vẫn là kháng sinh ưu tiên
trong điều trị sốt thương hàn ở đây [64]. Điều đó giải thích vì sao các chủng phân lập ở Indonesia trong nghiên cứu này đều là những chủng nhạy.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, những nơi fluoroquinolone được sử dụng thay thế chloramphenicol trong điều trị thương hàn có tỉ lệ S.Typhi đa kháng thuốc giảm và tỉ lệkháng Na gia tăng [94]. Điều này có thểdo khi fluoroquinolone được sử dụng trong điều trị sốt thương hàn sẽ làm giảm áp lực chọn lọc có lợi của chloramphenicol lên vi khuẩn hoặc các chủng S.Typhi mang plasmid kháng với chloramphenicol không cạnh tranh được với các chủng không có plasmid. Tuy nhiên tại một số nơi như Việt Nam, Pakistan, plasmid trở nên cố định trong quần thể S.Typhi nên các chủng đa kháng thuốc vẫn được duy trì [26]. Trong nghiên cứu này 7/8 chủng MDR của Pakistan và 5/7 chủng MDR của Bangladesh kháng
đồng thời với Na. Có thể nói, cùng với Việt Nam những vùng này vi khuẩn
S.Typhi đa kháng thường đi kèm kháng nalidixic acid.
Nhìn chung, tỉ lệ chủng S.Typhi kháng nalidixic acid khá cao ở các quốc gia láng giềng Nam Á nhưng ở một số nước khác tỉ lệ này lại thấp. Mặc dù hiện nay S.Typhi đa kháng kết hợp kháng nalidixic acid đang bùng phát tại nhiều nơi
trên thế giới nhưng tại một số vùng vi khuẩn này vẫn còn nhạy với các kháng sinh thế hệ đầu trong điều trị thương hàn. S.Typhi đa kháng thuốc không phải lúc nào cũng đi kèm với kháng nalidixic acid.
3.2.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với OFX
(ofloxacin) và CIP (ciprofloxacin) của các chủng S.Typhi phân lập từ Việt Nam và các nước Châu Á
Kết quả xác định MIC của S.Typhi đối với OFX và CIP được trình bày trong mối tương quan với sự kháng hay nhạy Na, nhằm đánh giá sự gia tăng MIC
với OFX và CIP đối với các chủng S.Typhi kháng Na.
MIC với OFX của 98 chủng S.Typhi nhạy với Na dao động từ 0.032-0.19
µg/ml. Ngược lại, 119 chủng kháng với Na có MIC với OFX dao động từ 0.125-12 µg/ml. MIC của 217 chủng S.Typhi với CIP cũng cho kết quả tương tự. 98 chủng nhạy với Na có MIC với CIP từ 0.006-0.125 µg/ml còn 119 chủng kháng Na có MIC với CIP từ 0.064-6 µg/ml (Bảng 3.2).
Kết quả này thể hiện sự khác biệt rõ ràng về MIC với OFX và CIP giữa nhóm chủng nhạy và nhóm chủng kháng Na. Ngoài ra kết quả cho thấy có sự gia
tăng MIC đối với OFX và CIP của các chủng kháng Na, mặc dù giá trị MIC này vẫn nằm trong giới hạn nhạy theo hướng dẫn của CLSI (≤2 µg/ml đối với ofloxacin và ≤1µg/ml đối với ciprofloxacin).
Bảng 3.2: MIC với OFX và CIP của nhóm chủng nhạy và kháng Na MIC với OFX MIC với CIP 98 chủng nhạy Nalidixic acid 0.032-0.19 0.006-0.125 119 chủng kháng Nalidixic acid 0.125-12 0.064-6
Nhiều nghiên cứu cho thấy các trường hợp nhiễm S.Typhi kháng Na thường
đáp ứng điều trị kém với fluoroquinolone [77, 84, 100, 103], mặc dù hầu hết các chủng này đều nhạy với các kháng sinh thuộc họ fluoroquinolone nếu kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán đĩa hoặc E-test theo hướng dẫn của CLSI [45]. Do
đó, kết quả nghiên cứu này một lần nữa xác nhận tầm quan trọng của việc sử dụng sự kháng Na như một chỉ thị cho các trường hợp giảm nhạy với fluoroquinolone ở
S.Typhi [50, 70]. Sự kháng Na có thể thực hiện dễ dàng bằng phương pháp khuếch
tán đĩa hoặc E-test. Điều này giúp các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng ở những
nhạy với fluoroquinolone bằng cách kiểm tra sự kháng Na theo phương pháp
khuếch tán đĩa thông thường.
Như vậy, các chủng S.Typhi kháng với Na thường gia tăng MIC với CIP và OFX. Ngoài ra, sự kháng nalidixic acid là một chỉ thị hợp lý và cần thiết để xác
định với các trường hợp giảm nhạy với flouroquinolone ởS.Typhi .
3.2.4. Đánh giá giới hạn kháng-nhạy (breakpoint) với ciprofloxacin và
ofloxacin theo hướng dẫn của CLSI hiện nay:
Theo CLSI, giới hạn nhạy với CIP hiện nay là (≤1µg/ml) và với OFX là (≤2
µg/ml) [45]. Theo giới hạn này thì hầu hết các chủng S.Typhi phân lập đều nhạy với CIP và OFX. Tuy nhiên, trên thực tế bệnh nhân thường đáp ứng điều trị kém với CIP và OFX nếu bị nhiễm chủng S.Typhi kháng Na. Do đó giới hạn kháng- nhạy với CIP và OFX của S.Typhi do CLSI đưa ra có thể làm ảnh hưởng đến sự đánh giá tính kháng-nhạy và dẫn đến quyết định sử dụng thuốc sai [1].
Ngoài ra giới hạn kháng-nhạy này còn làm các phòng thí nghiệm vi sinh không phát hiện các trường hợp giảm nhạy với fluoroquinolone [74]. Nếu tiếp tục
điều trị bằng fluoroquinolone không đúng liều, S.Typhi có thể kháng hoàn toàn họ
kháng sinh này trong tương lai. Nhiều nghiên cứu cho thấy đã đến lúc cần đánh giá
lại giới hạn kháng-nhạy với CIP và OFX để phát hiện các trường hợp giảm nhạy với fluoroquinolone, cụ thể ≥0.25 µg/ml với ofloxacin và ≥0.125 µg/ml với ciprofloxacin [1, 27, 48, 96]. Kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp với đề
xuất trên.
Hình 3.2 và 3.3 theo thứ tự thể hiện mối tương quan về MIC giữa OFX, CIP với Na của 217 chủng S.Typhi. Kết quả cho thấy trong 217 chủng chỉ có 5 chủng nằm trong giới hạn trung gian với OFX (2 µg/ml ≤MIC OFX≤8 µg/ml), 1
chủng kháng OFX (MIC OFX≥8 µg/ml), 211 chủng còn lại đều nhạy với OFX (MIC OFX≤2µg/ml). Với ciprofloxacin, trong 217 chủng chỉ có 1 chủng nằm trong giới hạn trung gian với CIP (1 µg/ml ≤MIC CIP≤4 µg/ml), 1 chủng kháng CIP (MIC CIP ≥4 µg/ml) còn lại 215 chủng đều nhạy với CIP (MIC CIP ≤1 µg/ml) theo hướng dẫn của CLSI.
Trên hình 3.2 và 3.3 cũng cho thấy hầu hết các chủng kháng Na đều có MIC với CIP và OFX cao hơn hẳn so với các chủng nhạy. Các chủng này được xem là giảm nhạy với ciprofloxacin và ofloxacin. Như vậy, nếu theo hướng dẫn của CLSI thì hầu hết các chủng S.Typhi trong nghiên cứu này đều nhạy với CIP và OFX và không phát hiện được các trường hợp giảm nhạy với các kháng sinh này. Do vậy đề xuất thay đổi giới hạn kháng-nhạy với OFX ≥0.25 µg/ml và CIP ≥0.125 µg/ml để phát hiện các trường hợp giảm nhạy với flouroquinolone là phù hợp với tình hình thực tế. Việc phát hiện các trường hợp giảm nhạy với flouroquinolone
này giúp đánh giá nguy cơ thất bại khi điều trị với họ kháng sinh này để có quyết
ủa 217 chủng S.Typhi.
Giới hạn kháng Na Giới hạn nhạy Na Giới hạn trung gian với Na
Các số ghi trên biểu đồ là số chủng có giá trị MIC với OFX theo chiều ngang và Na theo chiều dọc.
Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa MIC ciprofloxacin và MIC nalidixic acid của 217 chủng S.Typhi.
Giới hạn kháng Na Giới hạn nhạy Na
Các số ghi trên biểu đồ là số chủng có giá trị MIC với ciprofloxacin theo chiều ngang và nalidixic acid theo chiều dọc
Giới hạn kháng OFX
Giới hạn kháng-nhạy đề xuất (≥0.25 µg/ml)nhằm xác định chủng giảm nhạy với OFX
Giới hạn trung gian với OFX
Giới hạn kháng với CIP theo CLSI
Giới hạn kháng-nhạy đề xuất ( ≥0.125 µg/ml) nhằm xác định chủng giảm nhạy với Giới hạn trung gian với Na Giới hạn trung gian với CIP theo CLSI
Tóm lại, đã đến lúc cần đánh giá lại giới hạn kháng-nhạy với OFX và CIP của S.Typhi nhằm phát hiện các trường hợp giảm nhạy với các kháng sinh này để có phác đồđiều trị hợp lý.
3.3. Kết quả SNP typing bằng Golden gate assay
DNA của 73 chủng S.Typhi bao gồm 45 chủng Việt Nam, 5 chủng Bangladesh, 5 chủng Trung Quốc, 5 chủng Ấn Độ, 3 chủng Indonesia, 5 chủng Lào và 5 chủng Pakistan được gửi đến viện Sanger (Anh) để làm SNP typing bằng
phương pháp Golden gate assay.
Haplotype của các chủng S.Typhi được xác định bằng cách so sánh độ tương đồng của dữ liệu SNP thu được từ phương pháp Golden gate assay với dữ
liệu SNP của 19 chủng chứng là các chủng đã được giải trình tự toàn bộ gen và
xác định kiểu haplotype [43]. Kết quả xác định haplotype của 73 chủng này được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xác định haplotype của các chủng S.Typhi bằng Golden gate assay
Kiểu Haplotype Số chủng Nước
H1 5 Việt Nam, Lào H42 2 Bangladesh, Pakistan
H50 5 Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Pakistan H52 5 Trung Quốc, Lào
H58 54 Việt Nam, Lào, Bangladesh, Ấn Độ, Pakistan
H59 2 Indonesia
Để tìm hiểu sự đa dạng di truyền của các chủng S.Typhi phân lập từ các nước Châu Á, dữ liệu SNP thu nhận từ kết quả Golden gate assay được phân tích và dựng cây phát sinh loài với sựgiúp đỡ của viện Sanger (Anh).
Hình 3.4: Cây phát sinh loài của các chủng S.Typhi phân lập tại Việt Nam và một sốnước Châu Á.
92 chủng đại diện cho 7 nước Châu Á bao gồm 5 chủng Bangladesh, 5 chủng Trung Quốc, 3 chủng Ấn
Độ, 3 chủng Indonesia, 5 chủng Lào, 5 chủng Pakistan, 45 chủng Việt Nam và 19 chủng chứng đã được giải trình tự toàn bộ gen. Mỗi nốt (node) là một chủng, chiều dài các nhánh được tính dựa vào số SNP. Các
Về cơ bản các chủng S.Typhi phân lập ở7 nước Châu Á được chia thành 7 nhóm chính (N1-N7) (hình 3.4). Trong đó nhóm 6 (haplotype H58) chiếm số lượng chủng nhiều nhất (62/92 chủng). Hầu hết các chủng của Việt Nam (42/45 chủng) thuộc vào một nhóm duy nhất (nhóm 6). Haplotype H58 cũng được phát hiện ở Lào, Bangladesh, Ấn Độ và Pakistan.
3.4. Kết quả phân loại các chủng S.Typhi bằng phương pháp MLPA
MLPA được sử dụng để xác định kiểu haplotype của 217 chủng S.Typhi dựa vào sự khác biệt kiểu các đoạn gắn chèn-bị mất (in-dels) trên nhiễm sắc thể