Những hạn chế của các phương pháp cổ điển đã thúc đẩy sự ra đời của các phương pháp phân tử. Có rất nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để phân biệt S.Typhi dựa vào trình tự DNA của chúng.
Phương pháp phân biệt dựa vào trình tự gắn chèn IS200 ở S.Typhi
Trình tự gắn chèn IS200 là một nhân tố di truyền có thể di chuyển được, mô tả lần đầu tiên vào năm 1983 bởi Lam và Roth [56]. Ở E.coli không có trình tự này. Trình tự IS200 được tìm thấy trên các locus bảo tồn ở nhiễm sắc thể của nhiều týp huyết thanh của Salmonella. Trong nghiên cứu của mình, Gibert đã xác định số lượng nhân tố IS200 trên 15 chủng S.Typhi dao động từ 10-25. Do số lượng bản sao nhiều và khác biệt đáng kể nên IS200 được xem là chỉ thị thích hợp để phân biệt các kiểu di truyền ở S.Typhi. [13, 36, 56].
Tuy nhiên trong một nghiên cứu dịch tễ sử dụng trình tự IS200 để phân biệt các kiểu di truyền ở S.Typhi chỉ tìm được 11-15 nhân tố IS200 trên nhiễm sắc thể S.Typhi. Dựa vào các trình tự này có thể xác định được một số kiểu di truyền ở S.Typhi nhưng hiệu quả phân biệt không cao [65].
Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphic DNA)
RAPD (tính đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các đoạn oligonucleotide ngắn, mạch đơn, bắt cặp ngẫu nhiên vào DNA và làm mồi cho sự tổng hợp các đoạn DNA bằng PCR. Kích thước các đoạn khuếch đại tùy thuộc vào khoảng cách giữa các vị trí gắn của oligonucleotide. Kỹ thuật này không đòi hỏi phải biết trước trình tự DNA và toàn bộ nhiễm sắc thể có thể dùng để so sánh [76].
Phương pháp này đã được áp dụng để phân loại S.Typhi và cho hiệu quả phân biệt khá cao. Trong một nghiên cứu ở 63 chủng S.Typhi thu được 21 kiểu đa hình các đoạn khuếch đại [90]. Tuy nhiên phương pháp này có hiệu quả tin cậy không cao và thiếu lặp lại do sự không thống nhất giữa các phòng thí
nghiệm. Việc sử dụng mồi, các loại men polymerase khác nhau; qui trình chuẩn bị DNA khác nhau hay thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau đều có thể ảnh hưởng đến kết quả [92].
Phương pháp PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis)- Điện di trường xung
PFGE- điện di trường xung được xem là phương pháp phân tử hiệu quả trong nghiên cứu về dịch tễ học. Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong phân tích so sánh DNA nhiễm sắc thể ở nhiều vi khuẩn gây bệnh trong điều tra dịch tễ như methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum, Pseudomonas cepacia...[99]. PFGE có hiệu quả
phân biệt cao hơn các phương pháp có sử dụng mẫu dò như ribotyping hay RFLP [98]. Do đó phương pháp này được xem là một tiêu chuẩn vàng trong các phương pháp phân biệt bằng sinh học phân tử [92].
Trong một nghiên cứu trên 158 chủng S.Typhi phân lập từ các đợt dịch và các ca riêng rẻ bằng PFGE cho thấy các chủng phân lập riêng rẻ có độ đa dạng về kiểu điện di trường xung cao hơn các chủng phân lập từ các đợt dịch. Trong 18 chủng S.Typhi phân lập riêng rẻ thu được đến 13 kiểu điện di trường xung. Mẫu phân lập từ các đợt dịch chỉ thu được rất ít kiểu điện di trường xung. Kết quả này cho thấy PFGE là phương pháp phù hợp để phân biệt S.Typhi
trong nghiên cứu về dịch tễ [99].
Điểm hạn chế của phương pháp này là thời gian thực hiện kéo dài 2-3 ngày, đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng đáp ứng được [92]. Phương pháp điện di trường xung chỉ giới hạn ở nghiên cứu dịch tễ chứ không thể cung cấp thông tin về cấu trúc di truyền của quần thể vi khuẩn này.
Phương pháp MLST (multilocus sequence typing )
MLST (multilocus sequence typing) là phương pháp được phát triển gần đây nhằm xác định cấu trúc di truyền của quần thể vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp này dựa trên việc so sánh độ đa dạng trình tự của nhiều gen “giữ nhà” (house-keeping genes) giữa các chủng với nhau. Gen “giữ nhà” là những gen quan trọng, không thể thiếu cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Phương
pháp MLST đã được áp dụng thành công ở nhiều vi khuẩn đường ruột khác như E.coli, Shigella, Campylobacter… và được xem là phương pháp có tính phân biệt cao [31, 66, 89].
Một tập hợp 7 gen “giữ nhà” được chọn nằm rải rác trên nhiễm sắc thể của S.Typhi CT18 bao gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD
(histidinol dehydrogenase), purE (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase), sucA (alpha ketoglutaratedehydrogenase) và thrA
(aspartokinase+homoserine dehydrogenase). Các gen này được giải trình tự (tổng cộng 3336 bp) và được dùng để phân biệt 26 chủng S.Typhi phân lập
khắp nơi trên thế giới từ năm 1918 đến 2000). Tuy nhiên kết quả chỉ tìm thấy có 3 vị trí đa hình ở 26 chủng này và 4 loại trình tự [54].
Mặc dù hiệu quả phân biệt không cao nhưng phương pháp MLST cũng đã xác định được các kiểu di truyền phổ biến. Đây cũng là lần đầu tiên S.Typhi được phân biệt bằng công cụ giải trình tự gen [54]. Mở đầu cho các nghiên cứu trên quần thể S.Typhi ở mức độ giải trình tự gen bằng các kỹ thuật giải trình tự hiện đại.
SNP typing (Single Nucleotide Polymorphism typing)
Sự phát triển của các kỹ thuật giải trình tự DNA tự động đã giúp phát triển những phương pháp hiệu quả hơn để phân biệt các chủng S.Typhi, giúp
tìm hiểu dịch tễ học phân tử cũng như cấu trúc di truyền của quần thể này. Một trong những phương pháp được nhắc đến nhiều nhất hiện nay là SNP typing. Đây là phương pháp phân biệt các chủng S.Typhi dựa trên các vị trí đa hình nằm rải rác trên bộ gen của chúng.
Trong nghiên cứu SNP typing bằng công cụ dHPLC (denaturing high performance liquid chromatography), Roumagnac và cộng sự đã tìm được 88 SNP từ 199 đoạn gen (khoảng 88.739 bp) của 105 chủng S.Typhi phân lập từ
khắp nơi trên thế giới. Sau khi phân tích dữ liệu SNP này, S.Typhi được phân thành 59 haplotype di truyền khác nhau (hình 1.6) [83].
.
Trên 199 đoạn gen của tập hợp chủng thu nhận trên toàn cầu chỉ tìm được 88 vị trí đa hình cho thấy mức độ đa dạng trình tự rất thấp ở S.Typhi. Do đó cần có những nghiên cứu sâu hơn ở mức độ toàn bộ gen để hiểu rõ hơn nữa các biến đổi trên toàn bộ bộ gen trong quần thể S.Typhi [52]. Năm 2008, với sự phát triển của các phương pháp giải trình tự tự động (454, solexa sequencing), Kathryn và cộng sự đã chọn 17 chủng S.Typhi từ các haplotype khác nhau dựa trên nghiên cứu của Roumagnac để giải trình tự bộ gen bằng 454 và solexa sequencing. So sánh trình tự bộ gen của 17 chủng này cộng với 2 chủng đã giải trình tự bộ gen trước đó là CT18 và Ty2 đã xác định được 1787 SNP. Phân tích dữ liệu SNP cho thấy kết quả xác định haplotype phù hợp với nghiên cứu của Roumagnac tuy nhiên độ chính xác và phân biệt cao hơn [52]. Những dữ liệu SNP này rất quan trọng và là tiền đề cho những nghiên cứu dựa vào SNP typing ở S.Typhi sau này.
Ngoài ra việc giải trình tự bộ gen các chủng S.Typhi đã cung cấp những chỉ thị di truyền quan trọng là các đoạn bị mất và gắn chèn (in-dels) nằm rải rác
trên nhiễm sắc thể của S.Typhi. Các đoạn gắn chèn-bị mất này đặc trưng cho các haplotype di truyền ở S.Typhi. Kết quả nghiên cứu của Roumagnac và
Kathryn là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu này.