a. Nguyên tắc
Sử dụng 5 cơ chất đặc trưng để xác định các đặc tính chuyển hoá cơ bản của vi khuẩn nhờ sự hiện diện của các chất chỉ thị.
b. Môi trường và hóa chất
Bảng 2.1: Môi trường và cơ chất thử nghiệm đặc tính sinh hoá.
Ống nghiệm Cơ chất Thử nghiệm
1 2 3 4 5 dd glucose phosphat thạch (40% urê) thạch Simmon Citrat thạch indol
thạch Kligler Iron Agar (KIA)
lên men/ oxihoá Urease
đồng hoá citrat
tạo indol, H2S, di động lên men, tạo H2S
Thuốc thử Dung dịch đỏ methyl, dung dịch Kovack
(p- dimethylaminobenzaldehyde, amyl alcohol và HCl)
c. Tiến hành
Một khóm trùng cần định danh được tạo huyền phù trong ống glucose phosphat, sau đó dùng que cấy để cấy chuyền huyền phù này vào 4 ống môi trường còn lại. Đối với môi trường thạch nghiêng urê và citrat thì cấy theo kiểu zig-zac, còn môi trường thạch đứng Indol thì dùng que cấy thẳng đâm sâu vào khoảng 2/3 ống thạch. Riêng ống KIA thì đâm sâu sau đó cấy zig-zac trên mặt thạch nghiêng. Cấy một giọt huyền phù vi khuẩn vào đĩa NA (Nutrient agar) để kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn. Ủ bộ môi trường đã cấy vi khuẩn và đĩa cấy thuần vào tủ ấm, nhiệt độ 37oC trong vòng 18-24 giờ. Các đặc tính sinh hoá của S.Typhi chỉ được xác định khi lứa cấy thuần trên đĩa NA.
Thử nghiệm KIA (Kliger’s iron agar): đây là môi trường thạch nghiêng
có chứa dextrose và lactose, và chất chỉ thị màu được dùng là phenol đỏ. Vi khuẩn được cấy thẳng xuống gần đáy ống thạch, cấy ria trên bề mặt thạch nghiêng, và ủ ở 370C trong 18 đến 24 giờ. Kết quả được thể hiện như sau:
· Vi khuẩn không lên men: vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch nghiêng nhờ phân hủy các thành phần protein trong môi trường thành các sản phẩm kiềm. Bề mặt và phần đáy thạch nghiêng vẫn có màu đỏ.
· Vi khuẩn lên men dextrose và không lên men lactose: trong vòng 12 giờ sau khi ủ, vi khuẩn lên men dextrose và tạo các sản phẩm có tính acid, làm môi trường và mặt thạch có màu vàng. Tuy nhiên, sau 12 giờ, dextrose sử dụng hết, vi khuẩn trên bề mặt thạch tiếp tục tăng trưởng bằng phân hủy các thành phần protein trong môi trường. Khoảng từ 18 đến 24 giờ sau, sản phẩm kiềm tạo ra làm môi trường trên bề mặt thạch lại trở nên đỏ.
· Vi khuẩn lên men cả dextrose và lactose: bề mặt thạch nghiêng và phần đáy môi trường có màu vàng.
· Môi trường KIA cũng chứa natri thiosulfate (Na2S2O3) và sắt sulfate (FeSO4) làm chất chỉ thị cho việc tạo H2S. Kết quả dương tính khi xung quanh môi trường xuất hiện tủa màu đen.
Thử nghiệm Urease: xác định khả năng phân giải urea của vi sinh vật do tác dụng của enzyme urease. Thạch urê sẽ chuyển từ vàng sang hồng nếu vi khuẩn thoái hoá nitrat :
(NH2)2CO + 2H2O + urease ® CO2 + H2O + 2NH3« (NH4)2CO3
Thử nghiệm citrate: nhằm xác định khả năng sử dụng citrate và muối
ammonium như nguồn carbon và nitơ duy nhất của vi khuẩn. Vi khuẩn biến dưỡng citrate dùng muối ammonium tạo ammonia và làm kiềm hóa môi trường. Chất chỉ thị sử dụng trong thử nghiệm này là bromthymol blue (trung tính: màu xanh lá cây, pH>7,6: màu xanh thẫm). Thạch có màu như sau :
+ Màu xanh dương (Bromthymol) nếu vi khuẩn sử dụng nitrat và tạo ra nhiều NH3+ làm pH của môi trường trở nên kiềm.
+ Không đổi màu nếu vi khuẩn không sử dụng citrat (pH <6).
Thử nghiệm indole: nhằm xác định khả năng thủy giải tryptophan nhờ
enzyme tryptophanase thành indole của vi sinh vật. Indole tạo thành được phát hiện bằng phản ứng với dung dịch Kovac (para-dimethylaminobenzaldehyde
trong cồn), màu của thuốc thử sẽ chuyển từ vàng sang đỏ nếu môi trường có xuất hiện Indol
Sự tạo khí, di động và hình thành H2S của vi khuẩn có thể được quan sát trong ống thạch indol và thạch KIA vì trong hai thạch này đều có chứa gốc sulphat.
Thử nghiệm đỏ methyl: đây là thử nghiệm định tính về khả năng một
vi khuẩn lên men glucose thành những sản phẩm có tính acid cao hay thành những sản phẩm ít tính acid như ethanol hay butanediol. Thử nghiệm này dùng đỏ methyl làm chất chỉ thị pH (có màu đỏ khi độ pH của môi trường thấp hơn 4,4).
Phản ứng sinh hóa đặc trưng của S.Typhi là lên men glucose nhưng
không lên men lactose, không sinh hơi trong môi trường KIA, không sinh indole, không sử dụng citrat và ure, di động và sinh một ít H2S.
Những chủng có đặc tính sinh hóa không rõ sẽ được kiểm tra lại bằng kít Api20E.