Phân tách sản phẩm MLPA bằng điện di gel agarose
Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của điện trường, DNA tích điện âm ở pH trung tính sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Gel agarose có cấu tạo nền như tổ ong có thể phân tách các trình tự DNA theo cấu trúc, điện tích và kích thước của chúng. Ethidium bromide là chất phát huỳnh quang có khả năng gắn đặc hiệu lên các vạch DNA, nhờ đó có thể phát hiện vạch DNA dưới đèn UV.
Hóa chất và dụng cụ:
· Dung dịch đệm Tris-borat/EDTA 10X (TBE): 108g Tris base, 55g acid boric, 40ml EDTA 0.5M.
· Dung dịnh đệm mang mẫu (6X) gồm 0,25% phẩm màu cam, 30% glycerol trong nước.
· 10mg/ml Ethidium bromide trong nước (2,7-diamino-10-ethyl-9- phenylphenanthridinium bromide).
· Thang DNA lamda 100 bp chuẩn (Invitrogen). Vạch thấp nhất là 100 bp, cao nhất là 2072 bp, từ vạch 100 bp đến vạch 1500 bp mỗi vạch cách nhau 100 bp.
Hình 2.5 : Thang 100bp của Invitrogen
· Agarose (Merk, Đức).
· Bộ điện di gel agarose (Biorad, Mỹ) gồm bồn điện di và máy biến điện.
· Máy phát hiện DNA bằng tia UV (Vilber Lourmat) và hệ thống chụp hình, phân tích kết quả bằng hệ thống Gel Doc (Biorad, Mỹ), các vạch được phân tích bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Mỹ).
Tiến hành :
· Tạo bảng gel 3%: Cân 3g agarose hoà trong 100ml dung dịch đệm TBE, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội khoảng 50oC. Lắc đều dung dịch và đổ gel vào khay có gắn lược tạo giếng. Gel định hình sau khoảng 30-60 phút.
· Điện di: 10µl sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được trộn với 2 µl dung dịch đệm mang mẫu có nồng độ 6X (loading buffer). Tất cả hỗn hợp được cho vào các giếng của bảng gel 3% và chạy điện di cùng với 6 µl thang DNA 100 bp (50ng/ml). Quá trình điện di được thực hiện trong 3 giờ 30 phút, ở điện thế 90 Volt. Gel agarose sau khi điện di được nhuộm với Ethidium bromide trong 30 phút với hàm lượng 0.5mg/ml dung dịch đệm. Ethidium bromide cần được bảo quản trong tối, ở nhiệt độ phòng.
· Chú ý: Các thao tác thực hiện với Ethidium bromide phải rất cẩn thận vì đây là một tác nhân gây ung thư.
· Phát hiện và kiểm tra kích thước sản phẩm DNA bằng máy đo UV ở bước sóng 590nm trong vùng ánh sáng đỏ cam. Chụp hình bằng hệ thống được gắn trực tiếp với máy đo UV.
Phân tách sản phẩm MLPA bằng hệ thống điện di mao quản ABI 3130XL với phần mềm phân tích Genemapper V4.0
Nguyên tắc:
Các đoạn DNA đánh dấu huỳnh quang sẽ được phát hiện với hệ thống điện di mao quản ABI 3130XL và phân tích bằng phần mềm Genemapper. Sản phẩm MLPA được điện di cùng một thang chuẩn được đánh dấu với màu khác với màu của sản phẩm MLPA. Thang được sử dụng là thang Liz-500 (GeneScan, Applied Biosystems, Mỹ) là một hỗn hợp 16 đoạn DNA có kích thước từ 35-500 bp, mỗi đoạn DNA sẽ cho một peak khi điện di. Khi sản phẩm được điện di cùng thang chuẩn kích thước của từng đoạn sẽ được so sánh với thang chuẩn từ đó giúp xác định chính xác kích thước của từng đoạn DNA với khác biệt nhỏ đến 1bp.
Hóa chất và dụng cụ:
· Hệ thống điện di mao quản ABI 3130XL (Applied Biosystem, Mỹ) và phần mềm phân tích Genemapper V4.0 (Applied Biosystems, Mỹ).
· Hi-di formamide (Applied Biosystem, Mỹ).
· Thang chuẩn GeneScan-500LIZ (Applied Biosystem, Mỹ). Hình 2.6 : Hệ thống điện di mao quản ABI 3130XL.
Tiến Hành:
0.5 µl sản phẩm MLPA + 9.25 µl Hi-di Formamide + 0.25 µl thang chuẩn GeneScan-500LIZ. Hỗn hợp được ủ 3 phút ở 95 oC ngay sau đó làm lạnh trên đá vài phút trước khi phân tích bằng hệ thống điện di ống mao quản ABI 3130XL và phân tích bằng phần mềm Genemapper V4.0.