Như đã trình bày ở trên, có rất nhiều phương pháp khác nhau được phát triển để phân biệt các chủng S.Typhi. Các phương pháp này ở một mức độ nào đó đều cung cấp một số thông tin về sự đa dạng kiểu hình hay kiểu gen ở các chủng S.Typhi. Tuy nhiên, ngoài SNP typing thì các phương pháp còn lại đều
có hiệu quả phân biệt không cao, thiếu sự lặp lại và không cung cấp những thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các dòng S.Typhi khác nhau.
Mặc dù phương pháp SNP typing được đánh giá cao hiện nay nhưng các kỹ thuật sử dụng để phát hiện SNP đều phức tạp, đòi hỏi thiết bị hiện đại, đắt tiền. Những điều này hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử ở các nước trong vùng dịch tễ thương hàn khó đáp ứng được. Do đó SNP typing chưa thể được áp dụng để nghiên cứu S.Typhi ở những nơi này.
Để tìm hiểu dịch tễ học phân tử cũng như cấu trúc di truyền của quần thể
S.Typhi ở các nước đang phát triển cần phải có một phương pháp đơn giản hơn
nhưng hiệu quả phân biệt cao và lặp lại. MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification) được xem là phương pháp đáp ứng các yêu cầu trên. Phương pháp này được phát triển dựa vào các kết quả trong nghiên cứu của Roumagnac và của Kathryn.
MLPA là một phương pháp dựa vào PCR giúp phát hiện đồng thời các khác biệt trên trình tự DNA hay RNA. Phương pháp này lần đầu tiên được sử dụng để phát hiện những bất thường trên DNA như các đoạn gắn chèn, bị mất gây ra các bệnh di truyền nghiêm trọng ở người như chứng rối loạn thần kinh ngoại vi Charcot-Marie-Tooth do sự thay đổi số lượng bản sao của gen pmp22 ; bệnh ung thư vú do mất hoặc thêm một hoặc nhiều exon ở gen ức chế ung thư vú brca ; bệnh ung thư ruột do mất exon ở gen msh2 hoặc mlh1; bệnh Down do đột biến 3 nhiễm sắc thể 21 [39-41, 93, 95, 97]. Ở mức độ prokaryote MLPA
cũng đã được áp dụng để phát hiện đồng thời các đột biến kháng thuốc và các đột biến đặc trưng cho từng kiểu di truyền khác nhau ở Mycobacterium tuberculosis [12].
Như đã trình bày ở trên, trong nghiên cứu giải trình tự bộ gen của 19 chủng S.Typhi, Kathryn và cộng sự đã xác định được các đoạn bị mất và các đoạn gắn chèn đặc trưng cho các haplotype ở S.Typhi [52]. Chẳng hạn,
haplotype H58 có kiểu đoạn gắn chèn-bị mất là K,B,C,E/K,B,C,E,N/K,B,C,E,H; haplotype H52 có kiểu đoạn gắn chèn-bị mất là K,B,C,S…(hình 1.7). Do đó chúng tôi đã phát triển phương pháp MLPA nhằm xác định các haplotype ở S.Typhi thông qua phát hiện các đoạn gắn chèn- bị mất này. Không những vậy, MLPA còn được thiết kế để phát hiện các đột biến gây kháng nalidixic acid của S.Typhi ở gen gyrA (cả ở codon 83 và codon 87) và đột biến ở gen parC. MLPA vì vậy không những giúp xác định cấu trúc di truyền trong quần thể S.Typhi mà còn kết hợp với xác định kiểu hình kháng kháng sinh, mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quần thể vi khuẩn này.
Hình 1.7 Cây phân loại các haplotype dựa vào trình tự gắn chèn và bị mất được cung cấp bởi Kathryn.
Các màu ởcác các nhánh tượng trưng cho các dòng khác nhau của các haplotype ởS.Typhi. Các chữcái (A,B,…S) là tên các đoạn bị mất-đoạn gắn chèn tương ứng với từng haplotype. Chiều dài của mỗi nhánh được tính dựa vào các phân tích dữ liệu SNP (các SNP này được