Golden gate SNP typing là kỹ thuật phân tích SNP tự động hóa cao, chính xác, có thể phát hiện đồng thời nhiều vị trí đa hình trên một bề mặt array có gắn các hạt bead (bead array) [34, 91]. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc sử dụng các đoạn oligonucleotide nhận biết đặc hiệu vị trí từng SNP. Các đoạn oligonucleotide này được gắn lên các hạt bead, sau đó các hạt bead này được phân phối ngẫu nhiên vào từng giếng nhỏ của Array (Sentrix Array Matrix). Cách thiết kế này giúp phát hiện đến 1536 vị trí đa hình trên một mẫu DNA và có thể thực hiện cùng lúc 96 mẫu, cung cấp thông tin lên đến 150.000 kiểu di truyền cùng lúc [34, 91].
Qui trình thực hiện Golden gate assay gồm 9 bước: Đầu tiên DNA được hoạt hóa, sau đó được lai với các oligonucleotide và các hạt từ. 3 mồi (oligos) được thiết kế cho một vị trí SNP tại một locus, trong đó 2 mồi đặc trưng cho các alen của vị trí SNP (Allele-Specific Oligos hay ASOs). Mồi thứ 3 gắn dưới vị trí SNP vài bp là một mồi đặc hiệu cho locus (Locus-specific Oligo hay
LSO). Tất cả 3 trình tự mồi đều có vùng tương đồng trên bộ gen và vị trí mồi
toàn thế cho PCR. Trình tự mồi đặc hiệu locus (LSO) còn có một trình tự mục tiêu duy nhất (address) nhắm đến một loại bead cụ thể. Những mồi dư ra và không lai được với DNA bộ gen được loại bỏ qua những bước rửa nghiêm ngặt. Sau đó các mồi ASO thích hợp được kéo dài và sản phẩm kéo dài được lai với mồi LSO giúp kết hợp thông tin của mỗi SNP với trình tự mục tiêu trên LSO. Sản phẩm có chiều dài đầy đủ này được sử dụng làm mồi cho PCR với các mồi toàn thế P1, P2, P3. Trong đó P1 và P2 được đánh dấu với cy3 và cy5. Các đoạn DNA mạch đơn đánh dấu với thuốc nhuộm được lai với các loại bead mang trình tự bổ sung với chúng nhờ mang những đoạn trình tự mục tiêu duy nhất. Các sản phẩm dược phân tách trên một bề mặt rắn, sau khi lai, một máy quét được sử dụng để phân tích tín hiệu huỳnh quang trên Sentrix Array Matrix, tín hiệu sau đó được phân tích sử dụng phần mềm giúp xác định các SNP [112].
ASO1 ASO2
LSO 1: DNA được hoạt hóa (50ng/µl)
2: DNA được lai với các mồi và gắn với các hạt từ. Các mồi không lai với DNA được khoanh tròn
3: Rửa loại bỏ các mồi dư và
không bắt cặp. Kéo dài mồi đặc hiệu alen sau đó thực hiện phản ứng lai
4,5: Sản phẩm kéo dài và lai trên
được làm khuôn cho PCR bằng các mỗi đánh dấu huỳnh quang. Sản phẩm PCR được biến tính thành mạch đơn
6: Lai với Sentrix Array Matrix
7,8,9: Rửa và làm khô Array, đọc
tín hiệu huỳnh quang, phân tích và báo cáo kết quả tự động bằng
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU-
2.1 Đối tượng nghiên cứu
217 chủng S.Typhi sử dụng trong nghiên cứu được phân lập từ những mẫu lâm sàng trong chương trình nghiên cứu bệnh thương hàn ở miền Nam Việt Nam từ năm 1993-2005 và chương trình nghiên cứu vaccine của IVI (International Vaccine Institute) ở 8 nước Châu Á từ 2002-2004.
Trong đó 73 chủng S.Typhi từ Việt Nam và các nước Châu Á được chọn ngẫu nhiên để làm SNP typing bằng phương pháp Golden gate Assay tại viện Sanger (Anh). 19 chủng chứng bao gồm 16 chủng được cung cấp bởi viện Sanger, 2 chủng Việt Nam là CT18, AG3 và 1 chủng của Indonesia (J185SM) được sử dụng làm các haplotype đối chứng.
Toàn bộ 217 chủng trong nghiên cứu đều được xác định kiểu di truyền bằng MLPA, bao gồm 73 chủng đã gửi đi viện Sanger để làm SNP typing. Ngoài ra 10 chủng S.Paratyphi phân lập từ 2004-2006 tại Ấn Độ cũng được dùng làm nhóm chứng cho phương pháp MLPA.