xác định đột biến gen egfr và gen kras quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HC Y H NI NGUYN MINH H XáC ĐịNH ĐộT BIếN GEN EGFR Và GEN KRAS QUYếT ĐịNH TíNH ĐáP ứNG THUốC TRONG ĐIềU TRị BệNH UNG THƯ PHổI KHÔNG TÕ BµO NHá LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y T TRNG I HC Y H NI XáC ĐịNH ĐộT BIếN GEN EGFR Và GEN KRAS QUYếT ĐịNH TíNH ĐáP ứNG THUốC TRONG ĐIềU TRị BệNH UNG THƯ PHổI KHÔNG Tế BàO NHỏ Chuyờn ngnh : HểA SINH Y HỌC Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TB.BS Trần Vân Khánh GS.Đỗ Đình Hồ BVÂN KHÁNH ĐỖ ĐÌNH HỒ HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lịng tri ơn sâu sắc tới GS.Đỗ Đình Hồ TS.BS.Trần Vân Khánh, ngƣời thầy, ngƣời hƣớng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập, trực tiếp hƣớng dẫn tơi thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.Tạ Thành Văn, Phó Hiệu trƣởng Trƣờng Đại học Y Hà Nội ngƣời tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến thầy cô, đồng nghiệp, ngƣời tạo điều kiện, giúp đỡ trình thực luận án: - Ban Giám Hiệu Phòng Đào tạo Sau Đại Học Trƣờng Đại học Y Hà Nội - PGS.TS Phạm Thiện Ngọc, Trƣởng Bộ mơn Hóa Sinh thầy Bộ mơn Hóa Sinh Trƣờng Đại học Y Hà Nội - TS.BS Phạm Tuyết Mai, Trƣởng Khoa Nội Bệnh Viện K Trung Ƣơng, toàn thể bác sỹ, điều dƣỡng Khoa - PGS.TS.Mai Trọng Khoa PGS.TS.Phạm Đình Hà, Giám Đốc Phó Giám Đốc Trung Tâm Y học hạt nhân Ung Bƣớu Bệnh Viện Bạch Mai toàn thể bác sỹ, điều dƣỡng Trung Tâm - Toàn thể đồng nghiệp, nghiên cứu viên Trung Tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội Xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến bệnh nhân gia đình họ giúp tơi có đƣợc số liệu luận án Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối cùng, xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dƣỡng tình u thƣơng bố mẹ tơi, bố mẹ chồng ủng hộ, động viên chồng, hai em gia đình, ngƣời bên tôi, chỗ dựa vững để tơi n tâm học tập hồn thành luận án Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Nguyễn Minh Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Minh Hà, nghiên cứu sinh khóa 30 Trƣờng Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh Y Học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn Cô Trần Vân Khánh Thầy Đỗ Đình Hồ Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác đƣợc công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, đƣợc xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 20 tháng12 năm 2014 Ngƣời viết cam đoan Nguyễn Minh Hà DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALK : Anaplastic lymphoma kinase AKT : Gen thuộc họ v-akt murine thymoma viral oncogene homolog ASCO : Hiệp hội ung thƣ học lâm sàng Hoa Kỳ (American Society of Clinical Oncology) ATP : Adenosine triphosphate BRAF : Gen thuộc họ v-Raf murine sarcoma viral oncogen, mã hóa cho protein serinee/threonine-protein kinase B-raf COSMIC : Danh mục đột biến sinh dƣỡng bệnh ung thƣ (Catalogue of Somatic Mutations In Cancer) CT : Chụp cắt lớp vi tính hóa (computerised tomography) Ct : Chu kỳ ngƣỡng (Cycle of threshold) CTCAE : Tiêu chuẩn Đánh giá độc tính tác dụng phụ hóa chất Viện Ung thƣ quốc gia Mỹ (National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events) DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribose nucleoside triphosphate EGFR : Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor ) FDA : Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) FISH : Lai chỗ phát huỳnh quang (fluorescence in situ hybridization) HGFR : Thụ thể yếu tố phát triển tế bào gan (Hepatocyte Growth Factor Receptor) HR : Tỷ số nguy (Hazard Ratio) GAP : Guanosine activated protein (protein hoạt hóa GTPase) GDP : Guanosine diphosphate GEFs : Yếu tố chuyển đổi nucleotide guanine (Guanine nucleotide Exchange Factors) GTP : Guanosine triphosphate IASLC : Hiệp hội quốc tế nghiên cứu Ung thƣ phổi (International Associaton for the Study of Lung Cancer) kDa : kiloDalton KRAS : Gen thuộc họ v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogen LPĐTTĐ : Liệu pháp điều trị trúng đích MAPK : Mitogen-activated protein kinase MEK : Protein thuộc nhóm serinee/threonine-selective protein kinases MIBI : Methoxy-Isobutyl-Isonitrite MRI : Chụp cộng hƣởng từ (magnetic resonance imaging) mRNA : RNA thông tin (messenger RNA) MSCT : Chụp cắt lớp điện toán đa lát cắt (Multi-slides Computed Tomography) mTOR : Mammalian target of rapamycin OD : Mật độ quang (Optical Density) OS : Thời gian sống thêm toàn thể (Overall Survival) ORR : Tỷ lệ đáp ứng (overall response rate) PCR : Phản ứng khuếch đại chuỗi (polymerase chain reaction ) PI3K : Phosphatidyl inositol 3-kinase RFLP : Sự đa hình chiều dài phân đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism) PET-CT : Chụp cắt lớp phát xạ positron (Positron Emission Tomography) PFS : Thời gian sống thêm bệnh không tiến triển (Progression-Free Survival) Scorpion ARMS : Scorpion Amplification Refractory Mutation System SMAP : Smart Amplification Process SNP : Biến đổi đa hình thái đơn nucleotid (Single Nucleotide Polymophism) SPECT : Chụp cắt lớp điện toán xạ đơn photon (Single-photon Emission Computed Tomography) TKI : Chất ức chế hoạt tính tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor) UTP : Ung thƣ phổi UTPKTBN : Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ VEGF :Yếu tố phát triển nội mô mạch máu (Vascular Endothelial Growth Factor) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƢ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ 1.1.1 Cơ chế phân tử bệnh 1.1.2 Lâm sàng 1.1.3 Các giai đoạn ung thƣ phổi 1.1.4 Cận lâm sàng 1.1.5 Điều trị 13 1.1.6 Tiên lƣợng 14 1.2 VAI TRÕ CỦA CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU EGFR TRONG CƠ CHẾ BỆNH VÀ ĐIỀU TRỊ UTPKTBN 15 1.2.1 Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô 15 1.2.2 Đột biến gen EGFR 17 1.2.3 Các biến đổi cấp độ phân tử đƣờng tín hiệu EGFR 19 1.2.4 Hiệu điều trị chất ức chế tyrosine kinase EGFR 23 1.2.5 Tình hình nghiên cứu đột biến gen EGFR, gen KRAS hiệu EGFR TKIs điều trị UTPKTBN Việt Nam 29 1.3 PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN EGFR VÀ KRAS 31 1.3.1 Kỹ thuật PCR-RFLP 31 1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen 33 1.3.3 Kỹ thuật Scorpion ARMS 34 1.3.4 Kỹ thuật Smart Amplification Process 36 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 38 2.1.1 Xác định đột biến gen EGFR gen KRAS 38 2.1.2 Đánh giá hiệu điều trị 39 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.2.2 Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu 40 2.3.PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ THỐNG KÊ 47 2.4 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 48 2.4.1 Dụng cụ 48 2.4.2 Hóa chất 48 2.5 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 50 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN EGFR VÀ GEN KRAS 51 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu mô ung thƣ 51 3.1.2 Kết khuếch đại exon 18-21 gen EGFR exon gen KRAS 54 3.1.3 Kết xác định đột biến kỹ thuật giải trình tự gen 55 3.1.4 Kết xác định đột biến kỹ thuật Scorpion ARMS 66 3.1.5 Kết xác định tỷ lệ đột biến gen 74 3.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ 82 3.2.1 Đặc điểm bệnh nhân 82 3.2.2 Hiệu điều trị 83 3.2.3 Tác dụng phụ erlotinib 87 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 88 4.1 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN EGFR VÀ GEN KRAS 88 4.1.1 Kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR KRAS 88 4.1.2 Tỷ lệ đột biến gen EGFR 100 4.1.3 Tỷ lệ đột biến gen KRAS 109 4.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ ĐÍCH BƢỚC BẰNG ERLOTINIB TRÊN BỆNH NHÂN UTPKTBN CĨ ĐỘT BIẾN GEN EGFR 111 4.2.1 Đáp ứng điều trị 112 4.2.2 Thời gian sống thêm 120 4.2.3 Tác dụng phụ erlotinib 122 KẾT LUẬN 125 KIẾN NGHỊ 126 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR TRÊN GEL AGAROSE Chuẩn bị gel agarose 1,5% - Cân 1,5g agarose hòa tan 10ml boric acid EDTA (TBE) (sử dụng lò vi sóng) Sau agarose tan hết, để nguội 55- 60°C, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lƣợng giếng cần cho điện di mà cài lƣợc làm giếng từ 4- 6- 8- 12 - Pha dung dịch TBE 10X : Tris 0,89M; acid boric 0,89M; EDTA 0,02M Tiến hành kỹ thuật điện di - Chuẩn bị dung dịch điện di Thành phần Dung dịch Marker Ống chuẩn Ống bệnh nhân 10μl Sản phẩm PCR - 9μl Dung dịch đệm 10X - 1μl 10μl 10μl Tổng số - Đƣa gel agarose vào máy điện di, cho TBE đến ngập gel - Dùng pipet đầu côn nhỏ hút lần lƣợt dung dịch ống đƣa vào giếng (10μl/giếng) - Đƣa gel vào máy điện di 80-100V (Mupid-Nhật Bản), khởi động cƣờng độ 90V điện di 30 phút - Sau điện di, gel đƣợc ngâm vào Ethidium bromide 20 phút, rửa qua nƣớc cất đƣa vào soi dƣới đèn UV, chụp ảnh, lƣu ảnh vào máy vi tính in giấy PHỤ LỤC QUY TRÌNH TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR TRÊN GEL AGAROSE Sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) 1.Chuẩn bị dung dịch rửa màng (Membrane Wash Solution) (chỉ thực bắt đầu sử dụng hộp sản phẩm mới) : Thêm ethanol 95% vào lọ dung dịch rửa màng Lƣợng ethanol cho thêm vào phụ thuộc vào thể tích lọ dung dịch rửa màng (đƣợc quy định sẵn kit) 2.Cắt phần gel agarose có chứa sản phẩm PCR mong muốn (hiển thị dƣới đèn chiếu UV) Ƣớc lƣợng trọng lƣợng miếng gel Cho miếng gel vào ống có dung tích 1,5mL, thêm vào 10 µL dung dịch bám màng (Membrane Binding Solution) cho 10 mg trọng lƣợng miếng gel 4.Nhẹ nhàng trộn hỗn hợp ống ủ ống 50 – 65oC 10 phút quan sát thấy miếng gel tan hoàn toàn Ly tâm ống để toàn DNA tập trung xuống đáy ống 5.Đặt cột lọc (SV Minicolumn) vào ống thu thấp (Collection Tube) Chuyển tồn hỗn hợp gel hịa tan vào cột lọc ủ phút nhiệt độ phòng 6.Ly tâm phức hợp cột lọc-ống thu thập tốc độ 14 000 vòng/ phút phút 7.Gỡ cột lọc ra, đổ bỏ phần dung dịch ống thu thập Sau đặt cột lọc lại ống thu thập 8.Thêm vào cột lọc 700 µL dung dịch rửa màng ly tâm tốc độ 14 000 vòng/ phút phút Lặp lại bƣớc Thêm vào cột lọc 500 µL dung dịch rửa màng ly tâm tốc độ 14 000 vòng/ phút phút 10.Chuyển cột lọc sang ống 1,5 mL Thêm vào cột 50 µL Nuclease-Free Water Ủ nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm tốc độ 14 000 vòng/ phút phút 11.Bỏ cột lọc,dung dịch ống chứa DNA đích đƣợc tinh Tiếp tục thực kỹ thuật trữ ống -20oC PHỤ LỤC QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN 1.Quy trình PCR khuếch đại gen EGFR KRAS sử dụng BigDye kit Thực theo bước sau: 1.Cho vào ống dung tích 200 µL thành phần sau : Thành phần Thể tích (µL) Sản phẩm sau PCR đƣợc tinh 0,5 Big Dye Buffer 5X 1,5 Big Dye 2,5X 1,0 Nƣớc siêu 6,0 Mồi đơn (5pmol/µL) 1,0 Tổng thể tích 10 (thực ống cho mẫu: ống cho mồi xuôi, ống cho mồi ngƣợc) 2.Cài đặt chu trình nhiệt : 96oC phút 96oC 10 giây 50oC giây x 25 chu kỳ 60oC phút 3.Sau kết thúc phản ứng khuếch đại, giữ lạnh ống 4oC tiến hành bƣớc tinh 2.Quy trình tinh sản phẩm sau PCR sử dụng BigDye kit Thực theo bƣớc sau: Thêm 5µL EDTA 0,125M vào ống 200 µL có chứa sẵn sản phẩm PCR Thêm 60 µL cồn 100o, trộn đều, để 15 phút nhiệt độ phòng Ly tâm ống với tốc độ 15 000 vòng/phút 15 phút Đổ bỏ phần dung dịch, giữ lại phần cặn lắng đáy ống Thêm vào ống 250 µL ethanol 70%, trộn Ly tâm ống với tốc độ 15 000 vòng/phút 10 phút Đổ bỏ phần dung dịch, giữ lại phần cặn lắng đáy ống Để mảnh sản phẩm PCR khô tự nhiên nhiệt độ phòng Lập tức sử dụng kết tủa sản phẩm PCR để thực bƣớc đọc trình tự gen 3.Quy trình giải trình tự xác định đột biến gen EGFR KRAS Ngay sau lấy mảnh DNA khô vừa tinh cồn sau phản ứng PCR khuếch đại BigDye kit, thực bước sau: 1.Cho vào giếng 20 µL dung dịch Hi-Di (formamide) hịa tan sản phẩm PCR 2.Ủ 95oC 3-5 phút (trong block nhiệt) để gắn Hi-Di vào sợi đơn DNA 3.Lấy mẫu khỏi block nhiệt để -20oC phút 4.Trộn hỗn hợp 5.Đặt giếng chứa mẫu vào máy đọc trình tự khởi động chƣơng trình chạy 6.Phân tích trình tự gen hệ thống ABI Prism 310 (Applied Biosystems) 7.So sách kết giải trình tự gen với trình tự gen chuẩn tƣơng ứng GenBank 4.Mã quy ƣớc cho ký hiệu trình tự nucleotid phản ứng giải trình tự gen Mã quy ƣớc A T C G R Y W S Trình tự nucleotid Adenine Thymine Cytosine Guanine A G C T A T G C Mã quy ƣớc M K H B V D N Trình tự nucleotid A C G T A T C G C T G A C G A T A T C G Bảng mã quy ƣớc đƣợc trích từ: Nomenclature for Incompletely Specified Bases in Nucleic Acid Sequences (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB), Recommendations 1984, World Wide Web version Prepared by G P Moss, Department of Chemistry, Queen Mary University of London, UK, available at http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/misc/naseq.html) PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT SCORPIONS ARMS 1.Quy trình đánh giá nồng độ DNA tối ƣu với cặp mồi gen nội chuẩn GADPH sử dụng kỹ thuật Scorpions ARMS: Sử dụng gen nội chuẩn nhằm kiểm tra chất lƣợng DNA sau tách chiết đồng thời đánh giá nồng độ DNA cho phản ứng, từ chọn nồng độ DNA cho vào phản ứng thích hợp - Pha lỗng DNA chuẩn với nồng độ 20ng, 100ng, 500ng - Chuẩn bị phản ứng realtime PCR: Chuẩn bị khay lạnh (thể tích µL) TT Thành phần EGFR KRAS Thể tích Thể tích Thể tích Thể tích Master mix đối chứng 19,5 19,5 19,8 19,8 Taq DNA polymerase 0,5 0,5 0,2 0,2 DNA khuôn: 3.1 Đối chứng dƣơng : DNA dƣơng tính kit 3.2 Đối chứng âm: Nƣớc Tổng thể tích 5,0 5,0 5,0 25 25 5,0 25 25 - Trộn thành phần sau spin nhẹ cho toàn dịch xuống đáy ống; - Đặt mẫu vào máy realtime PCR đƣợc cài đặt sẵn chƣơng trình chạy; - Cài đặt chƣơng trình cho máy realtime PCR:  Bật máy realtime PCR, đèn đầu đọc realtime 15 phút trƣớc chạy chƣơng trình Bật máy tính chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chƣơng trình realtime PCR lên Phải kiểm tra chắn máy realtime PCR máy tính kết nối với (xem hƣớng dẫn sử dụng máy realtime PCR)  Chọn chức chờ ―Heat lid‖ đạt 1050C chƣơng trình luân nhiệt bắt đầu  Cài đặt vị trí mẫu ―Plate setup‖ phần mềm với vị trí mẫu đặt máy realtime PCR  Với mẫu: Chọn loại mẫu ―Unknown‖ Đặt tên số tƣơng ứng với ký hiệu mẫu  Với chứng dƣơng âm: Đặt tên ―Chứng dƣơng‖, ―Chứng Âm‖ tƣơng ứng  Chọn màu ―FAM‖ ―HEX‖ cho mẫu, chứng dƣơng chứng âm  Cài đặt chƣơng trình ―Protocol‖ cho máy realtime PCR hoạt động: chu kỳ: 950C-4phút; 40 chu kỳ: 950C-30 giây, 600C-1 phút (chọn đọc kết bƣớc này), giữ mẫu 150C - Cách phân tích kết kiểm tra chứng nội chuẩn:  Sau kết thúc trình realtime PCR, chuyển sang chế độ ―Analysis‖ để phân tích kết  Phân tích chứng dƣơng âm: Chọn màu FAM để phân tích kết quả, chứng dƣơng (PC) phải cho tín hiệu rõ dàng có giá trị Ct đạt 26,26 – 30,95 Chứng âm phải chắn không bị ngoại nhiễm tức khơng cho tín hiệu  Phân tích mẫu: Chọn màu FAM để phân tích kết quả: o Mẫu cho tín hiệu Ct từ 26.26-30.95: mẫu đạt yêu cầu để thực phản ứng với mồi đột biến o Mẫu cho tín hiệu Ct từ 30.69-37.00: Mẫu cho tín hiệu yếu có thể làm cho đột biến phát Trƣờng hợp phải tăng thêm lƣợng DNA khuôn cách cho gấp đôi lƣợng DNA cho tín hiệu giảm chu kỳ o Mẫu cho tín hiệu Ct từ 37.00-40.00 : Kết cho tín hiệu q yếu chứng tỏ có vài DNA đƣợc khuếch đại Không thể phát đƣợc đột biến DNA đƣợc khuếch đại khơng phải hầu hết DNA mang đột biến Trƣờng hợp phải tách chiết DNA lại o Mẫu cho tín hiệu Ct < 23.00 : trƣờng hợp phải tiến hành pha lỗng DNA đƣa kết tín hiệu 26.69-30.95 cách pha lỗng ½ lƣợng DNA cho tín hiệu tăng lên chu kỳ 2.Quy trình chạy chứng dƣơng chứng âm với mồi đột biến: - Chuẩn bị Master mix cho phản ứng (7 mồi đột biến gen EGFR): Thực khay lạnh (Thể tích µL) Control 19,5 T790M 19,5 Xóa đoạn exon 19 19,5 L858R 19,5 L861Q 19,5 G719X 19,5 S768I 19,5 Thêm đoạn exon 20 19,5 Taq DNA pol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 DNA khuôn (đã chuẩn nồng độ) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tổng thê tích 25 25 25 25 25 25 25 25 - Chuẩn bị Master mix cho phản ứng ( mồi đột biến gen KRAS): Thực khay lạnh (Thể tích µL) Control 19,8 G12D 19,8 G12V 19,8 G12A 19,8 G12R 19,8 G12C 19,8 G12S 19,8 G13D Taq DNA 19,8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 DNA khuôn 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tổng thê tích 25 25 25 25 25 25 25 25 polymerase - DNA khuôn lần lƣợt là:  Chứng dƣơng (PC): DNA xác định có đột biến chạy với cặp mồi đột biến cho kết dƣơng tính đƣợc pha nồng độ thích hợp  Chứng âm ( NC) : nƣớc PCR không chứa DNA chạy với cặp mồi đột biến cho kết âm tính - Trộn thành phần sau ly tâm nhẹ cho tồn dịch xuống đáy ống - Đặt mẫu vào máy realtime PCR đƣợc cài đặt sẵn chƣơng trình chạy - Cài đặt chƣơng trình cho máy realtime PCR:  Bật máy realtime PCR, đèn đầu đọc realtime 15 phút trƣớc chạy chƣơng trình Bật máy tính chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chƣơng trình realtime PCR lên Phải kiểm tra chắn máy realtime PCR máy tính kết nối với (xem HDSD máy realtime PCR)  Chọn chức chờ ―Heat lid‖ đạt 1050C chƣơng trình luân nhiệt bắt đầu  Cài đặt vị trí mẫu ―Plate setup‖ phần mềm với vị trí mẫu đặt máy realtime PCR  Với mẫu: Chọn loại mẫu ―Unknown‖ Đặt tên số tƣơng ứng với ký hiệu mẫu  Với chứng dƣơng âm: Đặt tên ―Chứng dƣơng‖, ―Chứng Âm‖ tƣơng ứng  Chọn màu ―FAM‖ ―HEX‖ cho mẫu, chứng dƣơng chứng âm  Cài đặt chƣơng trình ―Protocol‖ cho máy realtime PCR hoạt động: chu kỳ: 950C-4phút; 40 chu kỳ: 950C-30 giây, 600C-1 phút (chọn đọc kết bƣớc này), giữ mẫu 150C - Các mồi đột biến đƣợc sử dụng để xác định đột biến gen EGFR gen KRAS: Gen EGFR Gen KRAS STT Mồi đột biến Mồi đột biến Deletions Reaction Mix 19 G12A Reaction Mix 12 L858R Reaction Mix 21 G12D Reaction Mix 12 L861Q Reaction Mix 21 G12V Reaction Mix 12 G719X Reaction Mix 18 G12R Reaction Mix 12 S768I Reaction Mix 20 G12C Reaction Mix 12 Insertion Reaction Mix 20 G12S Reaction Mix 12 T790M Reaction mix 20 G13D Reaction mix 13 Exon STT Exon - Cách phân tích kết real-time với mồi đột biến:  Sau kết thúc trình realtime PCR, chuyển sang chế độ ―Analysis‖ để phân tích kết  Phân tích chứng dƣơng âm: Chọn màu FAM để phân tích kết quả, chứng dƣơng (PC) với mồi đột biến phải cho tín hiệu rõ dàng có giá trị Ct đạt 26,26 – 30,95 Chứng âm phải chắn không bị ngoại nhiễm tức cho tín hiệu khơng vƣợt qua tín hiệu  Phân tích mẫu: Chọn màu FAM để phân tích kết quả: o Mẫu chạy với mồi đột biến cho kết đƣờng biểu diễn tín hiệu âm tính (khơng vƣợt qua tín hiệu nền) Mẫu khơng có đột biến với mồi tƣơng ứng o Mẫu chạy với mồi đột biến cho kết đƣờng biểu diễn tín hiệu dƣơng tính (vƣợt qua tín hiệu nền), tiến hành tính tốn giá trị ΔCt theo cơng thức: Ct đột biến – Ct chứng = ΔCt So sánh giá trị ΔCt với giá trị ngƣỡng ―Cutoff‖ (Bảng 2.3) Nếu mẫu có giá trị ΔCt thấp giá trị ―cutoff‖ mẫu đƣợc coi (+) với đột biến đó, cịn mẫu có giá trị ΔCt cao giá trị ―cutoff‖ mẫu đƣợc coi (-) với đột biến ngồi giới hạn phát kit Giá trị cutoff gen EGFR gen KRAS Gen EGFR Gen KRAS Đột biến Giá trị cutoff ∆Ct Đột biến Giá trị cutoff ∆Ct T790M 6,38 G12A 6,5 Xóa đoạn exon 19 9,06 G12D 8,0 L858R 8,58 G12R 8,0 L861Q 9,26 G12C 7,0 G719X 9,32 G12S 9,0 S768I 9,26 G12V 6,5 Thêm đoạn exon 20 7,91 G13D 9,0 PHỤ LỤC 10 BẢNG TÓM TẮT CÁC PHÂN ĐỘ MỘT SỐ TÁC DỤNG PHỤ CỦA HÓA CHẤT Độc tính Độ Độ Độ Độ Độ Trên hệ tạo huyết: Bạch cầu ≥4 – 3,9 – 2,9 – 1,9 10lần/24h cần ni dƣỡng ngồi đƣờng tiêu hóa ≥10 lần/ngày, ỉa máu đại thể cần ni dƣỡng ngồi đƣờng tiêu hóa Thủng chảy máu Bệnh huyết Sốc phản vệ thanh, co thắt phế quản, u cầu ni dƣỡng ngồi hệ tiêu hóa Trên gan: Billirubin BT BT < 1,5 lần BT 1,5-3 lần BT > lần BT AST, ALT BT < 2,5 lần BT 2,6-5 lần BT 5,1-20 lần BT > 20 lần BT Trên thận : Creatinine Ure BT < 1,5 lần BT BT 7,6-10,9 < 7,5 1,5-3 lần BT 11-18 3,1-6 lần BT >18 > lần BT Nổi ban đỏ gây ngứa, vùng tổn thƣơng ≥50% diện tích da thể Rụng hoàn toàn - Viêm loét, nhiễm trùng da Trên da: Ban da khơng Rụng tóc khơng Viêm móng khơng (BT: bình thƣờng) Nổi ban đỏ, Nổi ban đỏ gây không ngứa ngứa, vùng tổn thƣơng