1.3.1. Kỹ thuật PCR-RFLP
Kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên cơ sở kỹ thuật PCR cổ điển. Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi
ngƣợc có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục đƣợc dùng để làm các phân tử DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đƣợc xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.
Hình 1.7. Phát hiện đột biến exon 21 gen EGFR bằng kỹ thuật RFLP [117]
Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR đặc hiệu sẽ đƣợc tinh sạch và xử lý với enzym cắt giới hạn đã đƣợc lựa chọn nhằm tạo ra những phân đoạn DNA nhỏ hơn. Sau khi đƣợc điện di trên gel agarose, số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA này sẽ giúp phát hiện các trƣờng hợp đột biến. Phƣơng pháp phát hiện đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên nguyên lý : exon 21 của gen EGFR kiểu dại có vùng trình tự đặc hiệu cho enzym MscI, đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trí cắt của enzym do đó sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzym MscI [117]. Với thiết kế kỹ thuật tƣơng tự nhƣ khi tìm đột biến gen EGFR, sản phẩm khuếch đại codon 12 gen KRAS sẽ
đƣợc xử lý với enzym NlaI và codon 13 với HaeIII [118]. Sau khi phân cắt, các sản phẩm sẽ đƣợc phân tích kết quả trên thạch agarose. Đây là phƣơng pháp truyền thống, kinh tế nhƣng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao.