3.1.4.1.Kết quả xác định đột biến gen EGFR
Bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, nghiên cứu đã xác định đƣợc 51 trƣờng hợp đột biến LREA (exon 19), 43 trƣờng hợp đột biến L858R (exon 21), 4 trƣờng hợp đột biến L861Q (exon 21), còn lại là các đột biến khác. Tỷ lệ chi tiết các loại đột biến gen EGFR đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Hình 3.19. Hình ảnh phát hiện đột biến L858R (exon 21) + T790M (exon
20) gen EGFR của cùng một bệnh nhân (mã số mẫu 48) bằng kỹ thuật Scorpion ARMS
Nhận xét: Kết quả hình 3.19 cho thấy xuất hiện đƣờng cong tín hiệu
tƣơng ứng với đột biến L858R và T790M chứng tỏ mẫu DNA ung thƣ của bệnh nhân này (có mã số mẫu 48) mang cả hai loại đột biến trên.
Mẫu nội chuẩn Đột biến L858R Đột biến T790M
Với một số mẫu DNA mà kỹ thuật giải trình tự gen cho kết quả còn nghi ngờ, kỹ thuật Scorpion ARMS giúp khẳng định đột biến, ví dụ nhƣ trong trƣờng hợp các mẫu có mã số 33, 141 và 08, đƣợc thể hiện qua hình 3.20 - 3.22. Tuy nhiên, cũng có trƣờng hợp kỹ thuật Scorpion ARMS không xác định đủ đột biến nhƣ kỹ thuật giải trình tự gen (trƣờng hợp mẫu có mã số 114, đƣợc thể hiện qua hình 3.23).
Hình 3.20. Hình ảnh kết quả đột biến L858R exon 21 gen EGFR
bằng kỹ thuật Scorpion ARMS (mã số mẫu 33)
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 33), khi xác định đột biến bằng kỹ
thuật giải trình tự gen, trên exon 21 của gen EGFR, tại vị trí nucleotid T ở codon 858, xuất hiện thêm một đỉnh tín hiệu tƣơng ứng với nucleotid G. Tuy
Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ nghi ngờ có đột biến L858R
Mẫu nội chuẩn
Mẫu bệnh nhân đột biến L858R
nhiên, đỉnh tín hiệu này thấp, dẫn đến nghi ngờ đây là đột biến L858R ở mẫu mô có nồng độ DNA ung thƣ thấp hoặc chỉ là tín hiệu nhiễu của hình ảnh giải trình tự gen. Khi phân tích mẫu DNA này bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, xuất hiện đƣờng cong tín hiệu của đột biến L858R bên cạnh đƣờng cong tín hiệu của mẫu nội chuẩn. Nhƣ vậy, có thể khẳng định đây là một mẫu DNA mang đột biến L858R exon 21 gen EGFR.
Hình 3.21. Hình ảnh kết quả khẳng định đột biến L861Q trên exon 21
của gen EGFR bằng kỹ thuật Scorpion ARMS (mã số mẫu 141)
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 141), khi xác định đột biến bằng kỹ thuật
giải trình tự gen, trên exon 21 gen EGFR, tại vị trí nucleotid T ở codon 861, xuất Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ
hiện thêm một đỉnh tín hiệu tƣơng ứng với nucleotid C. Tuy nhiên, đỉnh tín hiệu này thấp, dẫn đến nghi ngờ đây là đột biến L861Q ở mẫu mô có nồng độ DNA ung thƣ thấp hoặc chỉ là tín hiệu nhiễu của hình ảnh giải trình tự gen. Khi phân tích bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, xuất hiện đƣờng cong tín hiệu của đột biến L861R bên cạnh đƣờng cong tín hiệu của mẫu nội chuẩn. Nhƣ vậy có thể khẳng định đây là một mẫu DNA mang đột biến L861Q exon 21 gen EGFR.
Hình 3.22. Hình ảnh kết quảkhẳng định đột biến LREA trên exon 19 của
gen EGFR bằng kỹ thuật Scorpion ARMS (mã số mẫu 08)
Mẫu lành tính
Mẫu bệnh nhân ung thƣ nghi ngờ có đột biến xóa đoạn LREA
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 08), khi xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen, trên exon 19 của gen EGFR, từ vị trí codon 746 bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng các đỉnh tín hiệu bị nhiễu dạng chồng lắp, với chiều cao các đỉnh tín hiệu thấp, dẫn đến nghi ngờ xuất hiện đột biến xóa đoạn hoặc là hiện tƣợng nhiễu của tín hiệu nền. Khi phân tích mẫu DNA này bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, xuất hiện đƣờng cong tín hiệu của đột biến LREA bên cạnh đƣờng cong tín hiệu của mẫu nội chuẩn. Nhƣ vậy có thể khẳng định đây là một mẫu DNA mang đột biến xóa đoạn LREA exon 19 gen EGFR.
Hình 3.23. Hình ảnh xác định đột biến S768I và V769L exon 20 trên cùng bệnh nhân bằng kỹ thuật giải trình tự gen (trên) và Scorpion ARMS (dƣới)
(mã số mẫu 114)
Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ
AGC>ATC (S768I)
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 114), kỹ thuật giải trình tự gen đã xác định bệnh nhân mang đồng thời 2 đột biến điểm trên exon 20 là đột biến S768I và V769L. Khi xác định đột biến bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, do thiết kế mồi của kít EGFR chỉ có cặp mồi phát hiện đột biến S768I mà không có cặp mồi phát hiện đột biến V769L nên phản ứng real-time PCR chỉ có thể phát hiện đƣợc một đột biến S768I trên DNA bệnh nhân.
3.1.4.2.Kết quả xác định đột biến gen KRAS
Tƣơng tự nhƣ đột biến gen EGFR, bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, nghiên cứu cũng xác định đƣợc các đột biến tại exon 2 gen KRAS với số lƣợng nhiều hơn khi làm bằng kỹ thuật giải trình tự. Tỷ lệ chi tiết các loại đột biến gen KRAS đƣợc liệt kê trong bảng 3.6.
Với một số mẫu DNA mà kỹ thuật giải trình tự gen cho kết quả còn nghi ngờ, kỹ thuật Scorpion ARMS cũng giúp khẳng định đột biến, ví dụ nhƣ trong trƣờng hợp các mẫu có mã số 15, 132 và 181, đƣợc thể hiện qua hình 3.24 - 3.26.
Hình 3.24. Hình ảnh kết quả khẳng định đột biến G12D (codon 12) của
gen KRAS bằng kỹ thuật Scorpion ARMS (mã số mẫu 15)
Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ nghi ngờ có đột biến G12D
Codon 12 Codon 13 Codon 12 Codon 13
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 15), khi xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen, tại vị trí nucleotid 35 tƣơng ứng nucleotid G, codon 12 của gen KRAS xuất hiện thêm một đỉnh tín hiệu tƣơng ứng với nucleotid A. Tuy nhiên, đỉnh tín hiệu này rất thấp, dẫn đến nghi ngờ đây là đột biến G12D ở mẫu mô có nồng độ DNA ung thƣ thấp hoặc chỉ là tín hiệu nhiễu của hình ảnh giải trình tự gen. Khi phân tích mẫu DNA này bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, xuất hiện đƣờng cong tín hiệu của đột biến G12D bên cạnh đƣờng cong tín hiệu của mẫu nội chuẩn. Nhƣ vậy có thể khẳng định đây là một mẫu DNA mang đột biến G12D exon 2 gen KRAS
Hình 3.25. Hình ảnh kết quả khẳng định đột biến G12V (codon 12) gen
KRAS bằng kỹ thuật Scorpion ARMS (mã số mẫu 132)
Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ nghi ngờ có đột biến G12V
Codon 12 Codon 13 Codon 12 Codon 13 GGT>GTT (G12V)
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 132), khi xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen, tại vị trí nucleotid 35 tƣơng ứng với nucleotid G, codon 12 của gen KRAS, xuất hiện thêm một đỉnh tín hiệu tƣơng ứng với nucleotid T. Tuy nhiên, đỉnh tín hiệu này rất thấp, dẫn đến nghi ngờ đây là đột biến G12V ở mẫu mô có nồng độ DNA ung thƣ thấp hoặc chỉ là tín hiệu nhiễu của hình ảnh giải trình tự gen. Khi phân tích mẫu DNA này bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, xuất hiện đƣờng cong tín hiệu của đột biến G12V bên cạnh đƣờng cong tín hiệu của mẫu nội chuẩn. Nhƣ vậy, có thể khẳng định đây là một mẫu DNA mang đột biến G12V exon 2 gen KRAS.
Hình 3.26. Hình ảnh kết quả khẳng định đột biến G13D (codon 13) của
gen KRAS bằng kỹ thuật Scorpion ARMS (mã số mẫu 181)
Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ nghi ngờ có đột biến G13D
Codon 12 Codon 13 Codon 12 Codon 13
Nhận xét: Ở mẫu DNA này (mã số 181), khi xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen, tại codon 13 gen KRAS, tại vị trí nucleotid 38 là vị trí nucleotid G xuất hiện thêm một đỉnh tín hiệu tƣơng ứng với nucleotid A. Tuy nhiên, đỉnh tín hiệu này rất thấp, dẫn đến nghi ngờ đây là đột biến G13D ở mẫu mô có nồng độ DNA ung thƣ thấp hoặc chỉ là tín hiệu nhiễu khi thực hiện kỹ thuật. Khi phân tích mẫu DNA này bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, xuất hiện đƣờng cong tín hiệu của cặp mồi đột biến G13D bên cạnh đƣờng cong tín hiệu của cặp mồi trong mẫu chứng. Nhƣ vậy, có thể khẳng định đây là một mẫu DNA mang đột biến G13D exon 2 gen KRAS.