Đoạn DNA cần đƣợc giải trình tự đƣợc sử dụng nhƣ trình tự mẫu cho phản ứng giải trình tự bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid đƣợc sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thƣờng gắn trên đoạn DNA đang đƣợc tổng hợp. Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA đƣợc tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thƣớc khác nhau. Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA đƣợc xác định bằng cách chạy một phản ứng hỗn hợp nhƣng từng loại dideoxynucleotid đƣợc đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.
Sản phẩm sau phản ứng giải trình tự sẽ đƣợc đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động sử dụng bảng gel polyacrylamide. Máy gồm 2 phần: phần dùng điện di gel, phần phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di đƣợc các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu đƣợc mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cƣờng độ sáng. Sau đó, trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ đƣợc đối chiếu với trình tự gen tham chiếu trên ngân hàng gen thế giới (GenBank) và đƣợc phân tích để xác định vùng hoặc điểm đột biến.
Do các đột biến gen EGFR trên exon 18 ÷ 21 và đột biến gen KRAS rất đa dạng, kỹ thuật giải trình tự gen đƣợc xem là tốt nhất để khảo sát các đột biến này.
(A) Hình ảnh đột biến xóa đoạn gen (B) Hình ảnh đột biến điểm
Hình 1.8. Phát hiện đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật giải trình tự gen
(kết quả xét nghiệm gen của các bệnh nhân trong nghiên cứu – thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein Trường Đại Học Y Hà Nội)