Khảo sát tình trạng Methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng Promoter của gen GSTP1trên một số loại ung thư

IDT: Integrated DNA technology JNK: C-Jun N-terminal kinase... TRAF2: TNF receptor- associated factor 2... ho c các trang web khác.

BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P TÀI:

KH O SÁT TÌNH TR NG METHYL HÓA

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH-SINH H C PHÂN T

L I C M N

có đ c bài báo cáo khóa lu n nƠy thì đơy lƠ k t qu c a m t th i gian dài tìm hi u

và th c hi n đ tài, ngoài nh ng n l c c a b n thân thì s giúp đ , h ng d n c a các

th y cô góp m t ph n r t l n đ em có th hoƠn thƠnh đ tài này

L i đ u tiên em xin chân thành c m n Cô_PGS.TS Lê Huy n Ái Thúy lƠ ng i đƣ

đ ng tên h ng d n em trong k khóa lu n tôt nghi p này, em xin chân thành c m n

cô đƣ h ng d n, góp Ủ đ em có th hoàn thành t t bài báo cáo

Em c ng xin chơn thƠnh c m n Th y_ThS Lao c Thu n là m t ng i th y, ng i

anh luôn t n tình quan tơm vƠ giúp đ em trong th i gian qua, trong quá trình s a bài báo cáo c ng nh trong quá trình th c nghi m

ng th i em c ng xin c m n các b n trong phòng thí nghi m Sinh H c Phân T

c ng nh t t c các b n, các em khóa 2011 trong nhóm nghiên c u khoa h c khoa

Công Ngh Sinh H c tr ng i H c M Thành Ph H Chí Minh đƣ giúp đ em

trong quá trình làm khóa lu n c ng nh chia s nh ng khó kh n trong su t quá trình

v a qua

Cu i cùng, con xin g i l i c m n đ n gia đình đƣ lƠ ch d a tinh th n, ti p thêm cho

con ngu n đ ng l c r t l n trong nh ng lúc khó kh n khi lƠm đ tài khóa lu n t t

nghi p này

Tuy nhiên, do h n ch v ki n th c c ng nh th i gian nên bài báo cáo khóa lu n t t

nghi p không tránh kh i nh ng thi u sót Vì v y, em r t mong nh n đ c s đóng góp

ý ki n quý báu c a quý Th y, Cô đ em có th hoàn thi n h n nh ng hi u bi t v chuyên đ này M t l n n a xin chân thành c m n m i ng i Kính chúc m i ng i

th t nhi u s c kh e, ni m vui, thành công trong cu c s ng và trong công vi c!

TP H CHệ MINH, ngƠy 22 tháng 5 n m 2014

M C L C

DANH M C HÌNH v

DANH M C B NG vii

DANH M C CH VI T T T ix

PH N 1 T NG QUAN V UNG TH 1.1 T NG QUAN V UNG TH 3

1.1.1 Tình hình ung th trên th gi i 4

1.1.2 Tình hình ung th Vi t Nam 5

1.2 T NG QUAN V D U CH NG SINH H C (Biomarkers) 7

1.3 EPIGENETICS 9

1.3.1 Khái ni m epigenetics 9

1.3.2 o CpG 10

1.3.3 Khái ni m methyl hóa DNA 11

1.3.4 C ch gơy ung th do s methyl hóa DNA 13

1.4 T NG QUAN V GEN GSTP1 15

1.4.1 GST (glutathione S-transferases) 15

1.4.2 Gen GSTP1 (Glutathione S Tranferase P1) 15

1.4.3 C ch ho t đ ng c a GSTP1 16

1.5 Các ph ng pháp phát hi n s methyl hóa DNA 19

1.5.1 Ph ng pháp bi n đ i BSP (Bisulfide sequencing PCR) 19

1.5.2 Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP) 19

PH N 2 V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 V T LI U 20

2.1.1 Khai thác c s d li u 20

2.1.2 Kh o sát in vitro 21

2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 23

2.2.1 Khai thác c s d li u 23

2.2.2 Kh o sát in silico 23

2.3 KH O SÁT IN VITRO 24

2.3.1 Tách chi t DNA 24

2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph 26

2.3.3 Bi n đ i bisulfide DNA 26

2.3.4 Ph n ng MSP 27

2.3.5 i n di trên gel agarose 29

PH N 3 K T QU VÀ TH O LU N 3.1 KHAI THÁC D LI U 30

3.1.1 Th ng kê s li u t n s Methyl hóa c a GSTP1 trên ung th vú 31

3.1.2 Th ng kê s li u t n s Methyl hóa c a GSTP1 trên ung th c t cung 34

3.1.3 Th ng kê s li u t n s Methyl hóa c a GSTP1 trên ung th tuy n ti nli t 36

3.2 K T QU KH O SÁT IN SILICO 40

3.2.1 Trình t và các nhân t phiên mã c a gen 40

3.2.2 ánh giá thông s v t lý m i 43

3.3 K T QU TH C NGHI M 49

3.3.1 K t qu tách chi t DNA 40

3.4 M C LIÊN QUAN TÍNH CH T METHYL HÓA T I VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 V I NHÓM TU I/ TU I C A CÁC B NH NHÂN UNG TH

VÚ

54

3.5 M C LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I GIAI O N B NH C A CÁC B NH NHÂN UNG TH VÚ 54 3.6 KH O SÁT M C LIÊN QUAN (T SU T CHÊNH - ODD RATIO - OR VÀ NGUY C T NG I - RELATIVE RISK - RR) GI A TệNH CH T METHYL HịA V I UNG TH VÚ 55

PH N 4 K T LU N VÀ NGH 4.1 K T LU N 54

4.2 NGH 58

TÀI LI U THAM KH O 59

PH L C 67

DANH M C HỊNH

Hình 1.1 T l m c b nh và t l t vong trên toàn th gi i n m 2012 4

Hình 1.2 T l m c b nh và t vong vì ung th c a Vi t Nam n m 2012 6

Hình 1.3 Methyl hóa DNA đ c nghiên c u r ng rƣi nh m t d u ch ng sinh h c 8

Hình 1.4 S methyl hóa c a cytosine t o thành 5-methylcytosine 10

Hình 1.5 S b sung nhóm -CH3 vào v trí 5’c a cytosine nh enzyme DNMTs 12

Hình 1.6 Mô hình s bi n đ i gen b i methyl hóa DNA t o kh i u 13

Hình 1.7 C ch gơy ung th c a DNA methylation 14

Hình 1.8 V trí gen GSTP1 trên NST s 11 16

Hình 1.9 Ch c n ng c a protein GSTP1 trong t bào 17

Hình 1.10 Mô hình mô t t ng tác c a GSTP1-JNK và GSTP1- TRAF2 trong con đ ng di u ch nh tín hi u JNK và TNF- 18

Hình 1.11 Bi u đ t n s methyl hóa c a GSTP1 qua các lo i m u ung th vú khác nhau 34

Hình 1.12 Bi u đ t n s methyl hóa c a GSTP1 qua các lo i m u ung th c t cung khác nhau 36

Hình 1.13 Bi u đ t n s methyl hóa c a GSTP1qua các lo i m u ung th tuy n ti n li t khác nhau 39

Hình 1.14 V trí gen GSTP1 trên nhi m s c th s 11[92] 40

Hình 1.15 Các đ o CpG trên vùng promoter gen GSTP1 41

Hình 1.16 S phân b c a m t s y u t phiên mã trên gen GSTP1 42

Hình 1.17 C u trúc gen GSTP1 43

Hình 1.18 V trí b t c p c a m i methyl lên gen GSTP1 46

Hình 1.19 K t qu Annhyb m i methyl GSTP1 trên vùng trình t kh o sát 46

Hình 1.20 K t qu đi n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F và G-M-R 50

Hình 1.21 K t qu đi n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F và G-M-R 51

Hình 1.22 K t qu gi i trình t s n ph m MSP c a gen GSTP1 52

DANH M C B NG

B ng 1.1 T ng k t tình tr ng ung th trên th gi i 2012 5

B ng 1.2 Trình t m i methyl s d ng cho MSP 28

B ng 1.3 Chu trình nhi t cho ph n ng MSP v i GSTP1 28

B ng 1.4 T n s Methyl hóa c a gen GSTP1 trên m u ung th vú 31

B ng 1.5 Th ng kê t n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a GSTP1 trên ung th vú 33

B ng 1.6 Th ng kê t n s Methyl hóa c a gen GSTP1 trên m u ung th c t cung 34

B ng 1.7 Th ng kê t n s methyl hóa trung bình có tr ng s c aGSTP1 trên ung th c t cung 35

B ng 1.8 Th ng kê t n s Methyl hóa c a gen GSTP1 trên m u ung th tuy n ti n li t 36 B ng 1.9 Th ng kê t n s methyl hóa trung bình có tr ng s c aGSTP1 trên ung th tuy n ti n li t 38

B ng 1.10 Trình t m i methyl tham kh o t nghiên c u tr c c a phòng thí nghi m sinh h c phân t 45

B ng 1.11 Thông s v t lý c a m imethyl k th a t i phòng thí nghi m sinh h c phân t đ i h c M TP.HCM 45

B ng 1.12 M i tham kh o t các bài báo th ng kê 47

B ng 1.13 Thông s đánh giá m i theo IDT 48

B ng 1.14 N ng đ và ch t l ng DNA tách chi t 49

B ng 1.15 T ng k t k t qu methyl hóa c a GSTP1 trên 10 m u ung th vú 53

B ng 1.16 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i ung th vú 57

IDT: Integrated DNA technology

JNK: C-Jun N-terminal kinase

TRAF2: TNF receptor- associated factor 2

PH N 1

T NG QUAN

T V N

Theo T ch c Y t Th gi i (WHO) ung th lƠ nguyên nhơn d n đ u trong các

nguyên nhân gây t vong trên toàn th gi i Theo th ng kê, có kho ng 8,2 tri u ng i

ch t vì ung th n m 2012 trên toàn th gi i và kho ng 60% các tr ng h p b nh m i

đ c phát hi n Hi n có r t nhi u nghiên c u ch ra r ng có nhi u nguyên nhân d n

đ n ung th , trong đó bao g m tình tr ng methyl hóa m t cách quá m c m t s gen liên quan đ n c ch kh i u [91]

Nh đƣ nói trên, methyl hóa là m t trong nh ng nguyên nhân d n đ n ung th

nói riêng và epigenetics nói chung Epigenetics là m t nhóm các thay đ i x y ra m c

đ di truy n lƠm thay đ i s bi u hi n gen nh ng không lƠm thay đ i c u trúc DNA

Epigenetics bao g m nhi u bi n đ i khác nhau, trong đó hi n t ng methyl hóa DNA

là m t trong nh ng bi n đ i epigenetics đ c quan tơm hƠng đ u Methyl hóa DNA là

m t lo i bi n đ i c ng hóa tr d n đ n s g n nhóm -CH3 vào v trí cacbon s 5 c a Cytosine trong c p nucleotide CpG nh s xúc tác c a enzyme DNA methyltransferase [4]

Hi n nay vai trò c a nh ng bi n đ i epigenetics trong ung th đƣ đ c th ng kê

m t cách rõ ràng [55, 10] Trong đó, methyl hóa DNA đ c hi u là làm im l ng trên

nh ng gen c ch kh i u trên nhi u lo i ung th khác nhau [55] T n s methyl hóa

đ c th ng kê trên nh ng giai đo n s m c a ung th đƣ thúc đ y vi c phát tri n các

d u ch ng sinh h c trong ch n đoán b nh [38, 39, 74, 75] Vì v y, ngày nay epigenetics đ c h ng đ n s d ng nh m t d u ch ng sinh h c (Biomarker) trong

tiên đoán vƠ đi u tr b nh

M c tiêu c a nh ng d u ch ng sinh h c lâm sàng là cung c p cho các bác s ch n đoán nh ng thông tin v s hi n di n có hay không có c a b nh C ng nh cung c p

nh ng thông tin v b nh nhân và nh ng nh h ng c a quy t đ nh đi u tr đ n b nh

nhân Nhi u c ch đi u ch nh epigenetics đƣ đ c phát hi n trong nh ng n m g n

đơy, tuy nhiên s phát tri n c a d u ch ng sinh h c epigenetics phát tri n nh t cho đ n

nay v n t p trung vào methyl hóa DNA v i hai lỦ do: Methyl hóa DNA t ng đ i n

đ nh và d dàng phát hi n cùng v i nh ng ti n b c a công ngh hi n nay và vì vai trò

c ng nh s th ng xuyên c a quá trình methyl hóa trong ung th [26, 27]

GSTP1 là gen mã hóa cho protein GSTP1, protein GSTP1 tham gia vào nhi u quá trình quá trình khác nhau c a c th bao g m ho t đ ng chuy n hóa xenobiotic

gi i đ c t , mã hóa cho protein c ch kh i u, các quá trình b o v t bào kh i nh ng

s n ph m liên k t c a DNA v i các ch t gơy ung th , đáp ng l i v i quá trình stress

c ng nh tham gia vƠo quá trình apotossis [21] Bên c nh đó, GSTP1 c ng lƠ m t

trong nh ng gen th ng b methyl hóa trên nhi u lo i ung th v i t n s methyl hóa

t ng đ i cao, bao g m: ung th vú, ung th c t cung, ung th tuy n ti n li t [50,

59, 62, 64, 70]

Chính vì th vi c “Kh o sát tình tr ng methyl hóa t i các đ o CpG

thu c vùng promoter c a gen GSTP1 trên m t s lo i ung th ”là r t c n

thi t trong quá trình tìm ra d u ch ng sinh h c GSTP1 cho m t s lo i ung th trong

t ng lai, đó c ng chính là lý do mà chúng tôi th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p

này

1.1 T NG QUAN V UNG TH

Theo T ch c Y t Th gi i (WHO): Ung th lƠ m t thu t ng chung cho m t

nhóm l n các b nh có th nh h ng đ n b t k ph n nào c a c th M t đ c tr ng

c a ung th lƠ s t ng lên nhanh chóng c a các t bào m t cách b t bình th ng Các

t bào phân chia và phát tri n không ki m soát đ c, hình thành các kh i u ác tính và

xâm nh p vào các b ph n g n ho c xa c th thông qua h th ng b ch huy t ho c

máu c a c th , hi n t ng nƠy đ c g i lƠ di c n [90] Ung th phát sinh t m t t bƠo đ n l Vi c chuy n đ i t m t t bƠo bình th ng thành t bào kh i u là m t quá

trình g m nhi u giai đo n, th ng là m t s ti n tri n t m t t n th ng ti n ung th

đ n các kh i u ác tính Nh ng thay đ i này là k t qu c a s t ng tác gi a các y u t

di truy n c a ng i và các tác nhân bên ngoài, bao g m: tác nhân v t lý, ch ng h n

nh b c x t ngo i và b c x ion hóa; tác nhân hóa h c, ch ng h n nh ami ng, các

thành ph n c a khói thu c lá, aflatoxin (ch t gây ô nhi m th c ph m) và th ch tín (m t ch t gây ô nhi m n c u ng) và các tác nhân sinh h c, ch ng h n nh nhi m

trùng virus, vi khu n ho c ký sinh trùng [90]

1.1.1 Tình hình ung th trên th gi i

Theo s li u th ng kê c a WHO, n m 2012 trên toƠn th gi i có kho ng 14,1

tri u tr ng h p ung th m i đ c phát hi n, 8,2 tri u ng i t vong và 23,6 tri u

ng i s ng v i ung th Trong đó có kho ng 60% các tr ng h p b nh m i phát hi n

x y ra các n c châu Phi, châu Á, Trung và Nam M C ng theo d đoán c a WHO,

trên th gi i s có kho ng 1,5 tri u ng i t vong vì ung th vƠo n m 2015 [91]

Hình 1.1 T l m c b nh vƠ t l t vong trên toƠn th gi i n m 2012 [91]

Trên toàn qu c, ch có m t s b nh vi n nhƠ n c hƠng đ u có th ti n hành vi c ch a

tr ung th m t cách hi u qu , bao g m: B nh vi n Ung th Qu c gia và b nh vi n

B ch Mai Hà N i, b nh vi n Ung B u Tp.HCM, b nh vi n Ung B u Gia nh và

b nh vi n Ch R y Tp.HCM Chính vì th Vi t Nam hi n ch đáp ng đ c 20-30%

nhu c u đ c đi u tr c a b nh nhân ung th i u này d n đ n th c tr ng các b nh

vi n đi u tr ung th t i Vi t Nam luôn luôn trong tình tr ng quá t i [87]

Ngoài ra, ph n l n các b nh nhơn ung th Vi t Nam (kho ng 70%) ch đ n

b nh vi n đi u tr khi đƣ quá mu n, khi n cho c h i ch a kh i b nh r t th p Theo

th ng kê, t l ch a kh i b nh ung th Vi t Nam là 35% [87]

Hình 1.2 T l m c b nh vƠ t vong vì ung th c a Vi t Nam n m 2012 [91]

1.2 T NG QUAN V D U CH NG SINH H C (BIOMARKERS)

Theo Vi n Y T qu c gia Hoa K (NIH-US National Institutes of Health),d u

ch ng sinh h c ung th (Cancer Biomarker) lƠ m t phơn t sinh h c cho th y d u hi u

v s hi n di n c a ung th Phơn t sinh h c nƠy có th đ c ti t ra b i kh i u hay

m t đáp ng đ c bi t c a c th đ i v i s hi n di n c a ung th M t phơn t sinh

h c có th đ c tìm th y trong các mô, trong máu, ho c trong các d ch khác c a c

th D u ch ng sinh h c có th lƠ m t d u hi u c a m t quá trình bình th ng hay b t

63, 71,77] Hi n d u ch ng sinh h c có th đ c phơn lo i nh sau: d u ch ng sinh

h c d báo, phát hi n, ch n đoán vƠ tiên l ng ung th ; d u ch ng sinh h c ung th

d a trên c s phơn t sinh h c nh DNA, RNA, miRNA, protein, d u ch ng sinh h c cacbonhydrate; các d u ch ng sinh h c lƠ vius, vi khu n vƠ các d u ch ng sinh

nhơn ung th l i không có s gia t ng các d u ch ng sinh h c ung th [7] Do nh ng

lý do trên mà hi n nay ch có m t s d u ch ng sinh h c ung th đ c dùng r ng rƣi

trên lâm sàng.Trong nh ng t bƠo ung th , các gen vƠ nh ng s n ph m protein c a gen

có th b thay đ i b i đ t bi n ho c thông qua nh ng bi n đ i epigenetics trên nhi m

s c th d n đ n s thay đ i s bi u hi n c a gen Nh ng bi n đ i epigenetics có th

x y ra tr c ti p thông qua methyl hóa DNA c a gen ho c gián ti p b i methyl hóa,

acetyl hóa, phosphoryl hóa histone [59] Trong đó s methyl hóa DNA lƠ m t trong

nh ng bi n đ i bi u sinh quan tr ng Trong nh ng n m g n đơy thì methyl hóa DNA

càng tr nên rõ rƠng h n trong các s ki n bi n đ i epigenetics gơy ung th vƠ các

bi n đ i di truy n b t th ng [31].Chính vì th mƠ d u ch ng sinh h c ung th lƠ s methyl hóa DNA đang r t đ c quan tơm

Hình 1.3 Methyl hóa DNA đ c nghiên c u r ng rƣi nh m t d u ch ng sinh h c [16]

Hình 1.3 là bi u đ th ng kê v m c đ s d ng c a các bi n đ i epigenetics

trong vai trò là m t d u ch ng sinh h c và d u ch ng sinh h c trong ung th Qua bi u

đ ta có th nh n th y rõ vai trò đ c bi t quan tr ng c a s methyl hóa DNA trong

vi c làm m t d u ch ng sinh h c nói chung và d u ch ng sinh h c trong ung th nói

riêng v i s l ng các bài báo nghiên c u r t nhi u và chi m t l cao v t tr i so v i

nh ng d u ch ng sinh h c là epigenetics khác nh methyl hóa histone, acetyl hóa

histone, MicroRNAs hay RNA không mã hóa

D u ch ng sinh h c methyl hóa DNA có th đ c s d ng cho phát hi n c

nh ng tr ng h p ung th giai đo n đ u c ng nh nh ng tr ng h p ung th di c n

ho c tái phát Ví d nh s methyl hóa DNA trên vùng promoter c a gen p16 trong

huy t thanh có s t ng quan v i tình tr ng tái phát c a ung th đ i tr c tràng [33] S

phát tri n c a ph ng pháp đi u tr ch ng l i nh ng thay đ i epigenetics trong t bào ung th , cùng v i các xét nghi m tiên l ng và ch n đoán d a trên các m u DNA b methyl hóa đ c h a h n lƠ con đ ng m i cho vi c c i ti n trong ch m sóc b nh nhơn trong t ng lai [14, 15, 20, 54, 60, 61, 66]

1.3 EPIGENETICS

1.3.1 Khái ni m epigenetics

Epigenetics đ c đ nh ngh a lƠ nhóm các thay đ i x y ra m c đ di truy n, lƠm thay đ i s bi u hi n c a gen nh ng không lƠm thay đ i trình t DNA, có th làm thay đ i c u trúc c a DNA [23, 44, 85]

Nh ng bi n đ i epigenetics r t đa d ng vƠ đ c chia thành 3 lo i chính sau: S

methyl hóa DNA (DNA methylation), s a đ i sau d ch mã c a protein histone translational modification of histone proteins) và microRNAs [30] Vai trò c a nh ng

(post-bi n đ i epigenetics này nh m quy đ nh s bi u hi n bình th ng c a gen b ng vi c

ki m soát s đóng m c a nh ng gen nh t đ nh giúp c th t ng tr ng và phát tri n bình th ng c ng nh duy trì nhi m s c th tr ng thái bình th ng [20, 30, 78]

Chính vì th , nh ng thay đ i bi u sinh s d n đ n s b t n c a nhi m s c th và b t

n trong đi u khi n quá trình phiên mã c a các gen c ch kh i u d n đ n nh ng bi u

hi n b t th ng c a gen mà ta có th th y trong nhi u b nh ác tính ng i [21, 84,

86]

Nghiên c u v epigenetics hi n nay không còn là m t l nh v c quá m i, các

nghiên c u v epigenetics đƣ xu t hi n t nh ng n m 1980 vƠ hi n đang còn thu hút

nhi u s chú Ủ h n n a c a các nhà khoa h c trên th gi i [79] G n đơy nh ng thay

đ i epigenetics đ c coi là m t trong nh ng công c đ y h a h n nh m ti n đ n s

d ng epigenetics nh lƠ các d u ch ng sinh h c ng d ng trong vi c ch n đoán vƠ

phát hi n s m ung th [7]

Trong di truy n h c, đ o CpG hay CG là khu v c trên gen có ch a CG v i m t

đ cao, C trong CpG có th b methyl hóa đ t o thành 5-Methylcytosine Các c p

dinucleotide CpG phân b không đ ng đ u trong b gen, chúng tr i dài trên trình t

gen và xen k v i các vùng không b methyl hóa, nh ng đ o nƠy có kích th c kho ng

0,5-3,0 kb, trung bình xu t hi n trên kho ng m i 100kb trên b gen ng i [31, 17]

đ ng v t có vú, các đ o CpG hi n di n đa s trong ph n promoter c a gen [17 ,39 ,84]

Khi gen tr ng thái bình th ng thì t i nh ng đ o CpG trên vùng promoter c a gen

không b methyl hóa, ch nh ng phân nhóm riêng bi t t vùng promoter đ n vùng exon đ u tiên c a gen b methyl hóa Nh ng v trí CpG nƠy đóng vai trò lƠ nh ng đi m

nh n bi t c a các nhân t phiên mã, nh m đ m b o s phiên mƣ bình th ng c a gen Tuy nhiên, các đ o này b methy hóa v i t n s cao hi n di n trong các t bào ung th

[31, 17]

Hình 1.4 S methyl hóa c a cytosine t o thành 5-methylcytosine

1.3.3 Khái ni m methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA là m t hi n t ng c a epigenetics x y ra trong quá trình phát

tri n bình th ng c a t bào Nó là m t lo i bi n đ i liên k t c ng hóa tr trong đó m t

nhóm methyl (-CH3) đ c thêm vào v trí C5 c a Cytosine trong c p dinucleotide CpG

nh xúc tác c a enzyme S-adenosylmethionine (SAM) [4, 5, 19, 37, 39, 51] Quá trình

g n nhóm methyl này x y ra sau quá trình sao chép c a DNA [24] Trên nh ng t bào

bình th ng có kho ng 3-6% cytosine là b methyl hóa, m c đ methyl hóa thay đ i

m t cách đáng k trong quá trình phát tri n c a con ng i và s phát tri n c a b nh

trên nh ng t bào khác nhau S methyl hóa c a các dinucleotide CpG không ph i là

m t s phân b ng u nhiên trên b gen ng i, chúng th ng x y ra trên các đ o CpG

thu c vùng promoter c a gen [36] Bình th ng có kho ng 50% các đ o CpG b

methyl hóa, nh ng đ o CpG b methyl hóa nƠy th ng n m trên vùng promoter c a

các gen gi nhà (housekeeping gene) S methyl hóa quá m c x y ra trên các gen này

d n đ n c ch ho t đ ng c a chúng [24, 32]

Enzyme S-adenosylmethionine (SAM) có vai trò quan tr ng trong c ch methyl

hóa t i các đ o CpG SAM là m t h các enzyme có tên là DNA Methyltranferase

(DNMTs) Có b n lo i DNA methyltransferases (DNMTs), bao g m NDMT1, DNMT3A, DNMT3B và DNMT3L H enzyme DNMTs đóng vai trò trong ki m soát

m c đ methyl hóa c a b gen Trong đó NDMT1 là enzyme ho t đ ng chính đ ng

v t h u nh v i vai trò duy trì, đ m b o s sao chép thành công c a mô hình methyl

hóa DNA DNMT3A và DNMT3B th c hi n de novo methyl hóa t c là ho t đ ng đ

t o ra các v trí methyl hóa m i Chúng ch u trách nhi m trong vi c thi t l p mô hình

methyl hóa DNA trong quá trình hình thành giao t và phôi s m [3, 46, 52]

Hình 1.5 S b sung nhóm -CH3vƠo v trí 5’c a cytosine nh enzyme DNMTs [4]

Các enzyme DNMTs là nh ng ắ ng c viên” quan tr ng trong vi c đánh giá s phơn b vƠ nh ng thay đ i c a hi n t ng de novo methyl hóa khác th ng d n đ n s hình thƠnh vƠ phát tri n c a ung th S bi u hi n quá m c ho c thay đ i c u trúc c a các DNMTs trong các t bƠo bình th ng có th gơy ra các hi n t ng methyl hóa

khác th ng c a DNA mƠ đi n hình lƠ s t ng hay gi m m c đ methyl hóa c a gen

Trong đó, hi n t ng methyl hóa v t m c t i các đ o CpG thu c vùng promoter

th ng x y ra các nhóm gen c ch kh i u, nhóm gen gơy ung th vƠ nhóm gen

tham gia vƠo chu trình đi u hòa t bƠo xu t hi n s m trong quá trình phát sinh c a ung

th [66]

Hình 1.6 Mô hình s bi n đ i gen b i methyl hóa DNA t o kh i u [54]

Ung th lƠ k t qu c a nhi u c ch khác nhau trong c th , trong đó bao g m c

nh ng bi n đ i bi u sinh mƠ đ c bi t là hi n t ng methyl hóa trên DNA S methyl

hóa DNA t i các đ o CpG đóng m t vai trò quan tr ng trong vi c đi u ti t bi u hi n

gen, mô hình b t th ng trong methyl hóa DNA th ng d n đ n nhi u b nh khác nhau

[15, 32, 45, 77, 80]

Khi s methyl hóa quá m c x y ra trên vùng promoter c a các gen c ch kh i u

s d n đ n nh ng ho t đ ng b t n c a gen b ng nhi u c ch khác nhau [11, 12]

Bi u hi n c a gen b c ch theo hai c ch riêng bi t, c ch tr c ti p vƠ c ch gián

ti p i v i c ch tr c ti p, khi m t gen b methyl hóa quá m c thì quá trình sao

chép c a gen s b ng n ch n vƠ quá trình phiên mƣ c ng b kìm hãm c ch c ch

gián ti p, c ch nƠy liên quan đ n 2 lo i protein methylation-binding protein (MBD)

Protein MBD th hi n s t ng đ ng v i vùng domain c a MBD trên gen, trong khi

đó các vùng domain c a các nhân t đƠn áp quá trình phiên mƣ (transcription

re-pression domains (TRDs) đ c bi t đ n g n li n v i MeCP2, MBD1 và MBD2 [51]

Trên vùng domain c a MBD, MBD1 đ c g n vào DNA không b methyl hóa,

lúc này MBD2 s không g n đ c vào v trí nƠy, đ c tính c a protein MBD2 là làm

du i th ng glycine vƠ arginine trong vùng domain MBD lƠm ng n ch n s ti p c n c a

các y u t phiên mã (Transcription Facter) t i vùng promoter d n đ n làm ng ng quá

trình phiên mã [28, 53] Y u t HDAC ( ) c ng đ c g n

vào vùng DNA methyl hóa làm c ch quá trình phiên mã, s g n c a HDAC vào

vùng DNA methyl hóa lƠm thay đ i c u trúc DNA ng n ch n s ti p c n c a các y u

t phiên mã Nh ng gen tr ng thái không b methyl hóa quá m c, các đ o CpG trên

vùng promoter tr ng thái ho t đ ng bình th ng, y u t phiên mã (Transcription

Facter-TF) s đ nh v t i vùng kh i đ ng phiên mã c a gen [51]

Hình 1.7 C ch gơy ung th c a DNA methylation [61]

Chú thích:

(A) Gen nhi u đ o CpG trong vùng promoter

(B) Trong mô tuy n ti n li t kh e m nh, các y u t phiên mƣ nh AP-1 và Sp-1 liên

k t v i promoter và kích thích phiên mã

(C) Trong b nh ung th tuy n ti n li t, đ o CpG b methyl hóa

Nh v y, h qu c a methyl hóa DNA trên nh ng gen c ch kh i u là làm gi m

s bi u hi n gen vì v y đ c g i là làm im l ng gen Hi n t ng im l ng này là do s

kích ho t ho t đ ng c a quá trình gi m ái l c hay làm xóa b hoàn toàn kh n ng g n

k t c a các y u t phiên mã (Trancripstion factor) vào vùng DNA b methyl hóa ho c

t ng tác tr c ti p v i DNMTs, histone deacetylases, methyltransferases hay các ch t

nh m làm gi m quá trình oxy hóa Bên c nh đó, GST còn đ c tìm th y tham gia vào

nhi u c ch trong t bƠo nh : quá trình truy n tín hi u và apoptosis, ch không ch

gi i h n trong vai trò gi i đ c xenobiotic nh đ c bi t đ n tr c đơy [3, 71, 72]

1.4.2 Gen GSTP1 (Glutathione S Tranferase P1)

Tham kh o t ngu n: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/GSTP1, gen GSTP1 g m 7 exon và 8 intron dài kho ng 3 kb , n m trên cánh dài c a nhi m s c th s 11 v trí 13 Trong s t t c nh ng enzyme GST thì GSTP1 là m t đ ng v GST có liên quan đ n

nhi u lo i ung th nh t bao g m ung th vú, ung th tuy n ti n li t, đ i tr c tràng,

não, ph i và lá lách [40, 58, 79, 81]

Protein GSTP1 đ c mã hóa tr c ti p t gen GSTP1 đóng m t vai trò quan tr ng

trên t bƠo bình th ng và t bƠo ung th Protein GSTP1 ho t đ ng v i nhi u ch c

n ng khác nhau bao g m tham gia vào quá trình ho t đ ng chuy n hóa xenobiotic gi i

đ c t , mã hóa protein c ch kh i u, các quá trình b o v t bào đ i v i nh ng s n

ph m liên k t c a DNA v i hóa ch t gơy ung th (Adducts DNA), đáp ng l i v i quá

trình stress, truy n tín hi u và quá trình apoptossis [35, 54, 83]

Hình 1.8 V trí gen GSTP1 trên NST s 11 [88]

áng chú Ủ lƠ protein GSTP1 tham gia vƠo vi c xúc tác cho s g n c a

glutathione tripeptide (ch t ch ng oxy hóa) v i m t lo t ch t l c đi n t bao g m c

genotoxin, ch t gơy ung th vƠ các ch t hóa tr li u t đó giúp các t bào tránh kh i

nh ng tác nhân là các g c oxy hóa này [6] Khi có s methyl hóa quá m c t i các đ o

CpG trên vùng promoter c a gen thì s bi u hi n c a gen s b c ch

1.4.3 C ch ho t đ ng c a GSTP1

Nh đƣ trình bƠy trên GSTP1 đóng m t vai trò quan tr ng trong nhi u ho t

đ ng c a c th v i nhi u ch c n ng khác nhau, trong đó GSTP1 n i b t v i vi c tham

gia vào ph n ng stress và quá trình apoptosis c ng nh trong s t ng sinh c a t bào

[21]

Hình 1.9 Ch c n ng c a protein GSTP1 trong t bƠo [48]

Ho t đ ng c a protein GSTP1 bao g m tham gia xúc tác cho s k t h p c a

glutathione (GSH) - m t ch t ch ng oxy hóa trong t bƠo đ ng v t, n m và vi khu n

v i nh ng g c oxy hóa nh các ph c h p ái l c đi n t , các ch t gơy ung th vƠ m t

s ch t ngo i sinh khác t đó ng n ch n s ti p xúc c a các g c oxy hóa này đ i v i

các t bƠo trong c th Ngoài ho t đ ng xúc tác cho s g n c a glutathionine (GSH)

v i các g c oxy hóa, protein GSTP1 còn đ c bi t đ n v i vai trò là m t phi enzyme

V i vai trò là m t phi enzyme, ho t đ ng c a protein GSTP1 là g n v i C-Jun

N-terminal kinase (JNK) thu c h protein kinase và TRAF2 (TNF receptor- associated factor 2) đ hình thành ph c h p GSTP1/JNK [25, 35, 43, 48] Ph c h p này s kích

ho t vƠ đáp ng v i các kích thích hay stress c a t bào ch ng h n nh đáp ng v i

các y u t tia c c tím hay nhi t đ , t đó làm kích ho t quá trình apoptosis Bên c nh

đó, ph c h p c a protein GSTP1/JNK còn kích ho t y u t phiên mã AP-1 đ kích

ho t quá trình phiên mã bi u hi n ch c n ng c a gen Nh v y v i vai trò c a m t phi

enzyme, GSTP1 đóng vai trò quan tr ng trong d n truy n tín hi u t bào, k t qu c a

ho t đ ng này nh m quy đ nh m t con đ ng ki m soát s t ng sinh vƠ s ch t c a t

bào b ng con đ ng apoptosis [33, 40, 42,68]

Vi c methyl hóa quá m c x y ra trên vùng promoter c a GSTP1 s lƠm ng n c n

s g n c a các y u t phiên mã lên vùng promoter c a gen, đ ng th i enzyme RNA

polymerase II không còn kh n ng t ng tác v i vùng promoter K t qu là làm c ch

quá trình phiên mã gây gi m sút ho t đ ng và m t ki m soát các con đ ng ch c n ng

c a gen Do đó lƠm gián đo n ho c d ng c ch s a ch a DNA, lúc này nh ng t n

th ng DNA s tích l y d n trong khi t bào v n đi vƠo quá trình sao chép vƠ phơn

bào b t k các đ t bi n hay sai h ng DNA gây ra nhi u quá trình b t l i cho c th mà

nghiêm tr ng nh t là d n đ n ung th [32, 33, 36, 49]

Hình 1.10 Mô hình mô t t ng tác c a GSTP1-JNK và GSTP1- TRAF2 trong con

đ ng di u ch nh tín hi u JNK vƠ TNF- [83]

1.5 CÁC PH NG PHÁP PHÁT HI N S METHYL HÓA DNA

1.5.1 Ph ng pháp bi n đ i BSP (Bisulfide sequencing PCR)

BSP là m t ph n ng PCR di n ra qua hai b c: b c đ u tiên là s bi n đ i

sodium bisulfide DNA.Ti p sau đó lƠ th c hi n ph n ng PCR khu ch đ i trình t DNA đƣ đ c bi n đ i b i các m i đ c hi u S n ph m PCR có th đ c s d ng theo

ba h ng sau: gi i trình t sau khi t o dòng, gi i trình t tr c ti p ho c k t h p v i các

enzyme c t gi i h n nh y v i hi n t ng methyl hóa đ ki m tra s methyl hóa c a

các v trí CpG đ c bi t [73]

1.5.2 Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP)

MSP là m t k thu t PCR m i có đ nh y phát hi n đ n 0,1%, đ c s d ng đ đánh giá nhanh chóng tình tr ng methyl hóa c a h u h t các v trí CpG bên trong đ o

CpG, do Herman và c ng s đ a ra vƠo n m 1996 [22] Trình t DNA đích tr c khi

th c hi n ph n ng MSP ph i đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, khi m u DNA đ c

bi n đ i bisulfide thì nh ng Cytosine không b methyl hóa trên đo n trình t s đ c

bi n đ i thành Uracil (CU) Sau khi đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, m u DNA

s đ c khu ch đ i v i hai c p m i methyl và không methyl đ c thi t k đ phân bi t

gi a nh ng alen b methyl hóa và nh ng alen không b methyl hóa, c ng nh đ phân

bi t v i nh ng DNA đƣ bi n đ i bisulfide v i nh ng DNA ch a bi n đ i bisulfide

[18] đ t đ c nh ng m c tiêu này thì trình t m i cho ph n ng MSP th ng đ c

thi t k ch a nhi u Cytosine và có các c p CpG n m g n v trí 3’ c a các base [33]

PH N 2

PHÁP NGHIÊN C U

Nh ng bƠi báo đ c ch n l c đ th ng kê s li u đ c d a trên m c đ tin c y

c a t p chí đ ng t i có mã tiêu chu n qu c t ISSN (International Standard Serial

Number) và nh ng bài báo nghiên c u ung th vú, ung th c t cung vƠ ung th

tuy n ti n li t c a gen kh o sát GSTP1

Trình t m i đ khu ch đ i gen GSTP1 đ c tham kh o tr c ti p trong các bài

báo nghiên c u v m c đ methyl hóa trong ung th vú vƠ ung th c t cung c a

nhóm nghiên c u tr c đơy c a phòng sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM

[3]

2.1.1.2 Các công c và ch ng trình s d ng trong kh o sát in silico

PubMed: M t c s d li u trích d n và tóm t t cho v n h c y sinh h c t

MEDLINE và khoa h c đ i s ng thêm t p chí Liên k t đ c cung c p khi có phiên

b n toƠn v n c a các bài vi t có s n thông qua PubMed Central (M t kho l u tr k

thu t s c a y sinh h c toƠn v n vƠ đ i s ng v n h c khoa h c t p chí, bao g m c y

h c lâm sàng và y t công c ng.) ho c các trang web khác (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/all/)

TFSearch (Transcription For Search): LƠ ch ng trình tr c tuy n đ c Yutaka Akiyama ( i h c Kyoto) l p trình nh m giúp xác đ nh v trí nh n bi t c a các nhân t

phiên mã trên vùng promoter c a gen

Clustal: Là dãy các phiên b n ph n m n phân tích k t qu thí nghi m v c u trúc

c a chu i DNA hay protein, b ng cách so sánh đ ng th i gi a t t c các chu i trình t ,

đ tìm ki m phát hi n ra nh ng đ c đi m đ ng nh t đ c đi m g n g i hay phơn ly gi a

chúng

Andhyb: Ki m tra v trí b t c p c a m i, m u dò vƠ kích th c s n ph m

IDT (Integrated DNA Technologies): IDT analyzer

(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/): giúp xác đ nh các thông s

quan tr ng c a m i nh kích th c, thành ph n GC, nhi t đ lai, kh n ng t o hairpin

loop, primer-dimer, hetero-dimer,

Proteinase K Fermentas

Máy ly tâm l nh Hettich

D ng c và hóa ch t cho ph n ng MSP

N c c t 2 l n

D ng c và hóa ch t đo quang ph

Máy đo quang ph : Bio Rad

N c c t 2 l n

D ng c và hóa ch t đi n di

Máy đi n di BioRad

Gel agarose BioRad

Ethidium Bromide BioRad

Loading dye BioRad

2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U

2.2.1 Khai thác c s d li u

Ti n hành khai thác d li u trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), s d ng công c Pubmed v i các t khóa epigenetics, DNA methylation, breast cancer, cervical cancer, Prostate cancer nh m thu th p thông tin, d li u bao g m nh ng thông tin t ng quan v t n s methyl hóa c a ung th vú, ung th c t cung, ung th tuy n

ti n li t, epigenetics, methyl hóa DNA, thu th p trình t c a gen GSTP1 thông qua mã

s accession number NC_000011.10 c a nhi m s c th 11

2.2.2 Kh o sát in silico

2.2.2.1 Th ng kê t n s methyl hóa

Th ng kê trung bình có tr ng s : Trung bình có tr ng s là giá tr trung bình có

ph n ánh t m quan tr ng c a các ph n t (hay giá tr quan sát) trong t p h p đó M i

m t giá tr quan sát s đ c g n m t tr ng s nh m lo i b các y u t có th nh

h ng đ n k t qu th ng kê nh ph ng pháp ti n hành th c nghi m khác nhau,

ngu n g c m u b nh nhân khác nhau, s l ng m u khác nhau hay th i gian khác

nhau

Sau khi đƣ thu th p các s li u v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 trên hai lo i ung th lƠ ung th vú, ung th c t cung vƠ ung th tuy n ti n li t chúng tôi ti n hành

th ng kê trung bình có tr ng s và v bi u đ v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 qua

các lo i m u khác nhau (bao g m m u mô đúc parafin, m u huy t thanh, m u máu và

m u n c ti u)

2.2.2.2 Thu nh n trình t gen, xác đ nh c u trúc gen và đ o CpG

Trong ti n trình kh o sát in silico, b c đ u tiên chúng tôi ti n hành thu nh n

trình t gen GSTP1 t ngân hàng gen b ng mã s truy c p là NC_000011.10 k t h p

v i ch ng trình Ensemble đ l y đúng trình t vùng promoter c a gen GSTP1

Sau đó chúng tôi ti n hƠnh xác đ nh các vùng ch c n ng quan tr ng c a gen nh :

promoter, 5’UTR, exon 1, v trí g n c a các nhân t phiên mã b ng ch ng trình

TFsearch, xác đ nh các đ o CpG b ng Methprimer

2.2.2.3 ánh giá m i

i v i đo n m i cho ph n ng MS-PCR chúng tôi đƣ tham kh o t m t s bài

báo th c nghi m trên ngân hàng d li u NCBI c ng nh k th a m i methyl và unmethyl đƣ đ c thi t k và th nghi m cho MSP trên gen GSTP1 t nhóm nghiên

c u t i phòng thí nghi m sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM nh ng n m

tr c [3] Sau đó chúng tôi ti n hành kh o sát đánh giá các thông s v t lý trên IDT

nh m xác đ nh m t s thông s quan tr ng nh : kích th c m i, % GC, nhi t đ lai,

kh n ng t o các c u trúc hairpin loop, heterodimer Kh n ng b t c p b sung, v trí

phenol/chloroform Do đ c thù c a ngu n m u đ c b o qu n trong paraffin nên

chúng tôi đƣ s d ng xylene đ x lỦ paraffin tr c khi ti n hành tách chi t DNA Trong đó, mƠng t bào và mƠng nhơn đ c bi n tính b ng ch t t y m nh (SDS) k t

h p s c nhi t Sau đó protein s đ c bi n tính b ng phenol/chloroform và b lo i b

DNA b gen s đ c t a v i ethanol l nh

2.3.1.2 Các b c ti n hành

B c 1: Ti n hành c t nh m u b nh ph m cho vào ng eppendorf lo i 1,5 ml, thêm

1ml xylene, vortex 1 phút, ly tơm 13000 vòng/phút trong 2 phút Sau ly tơm đ b

ph n d ch n i (l p l i 3 l n)

B c 2: Thêm 1ml Ethanol 100 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2

phút, sau ly tơm đ b ph n d ch n i, s l n l p l i ph thu c vào s l n x lý v i

xylene

B c 3: Làm khô m u: làm khô t nhiên ho c dùng máy s y trong 30 phút

B c 4: Thêm 700 µl dung d ch lysis buffer, 55oC t 2-4 ngày

B c 5: Cho 700 µl dung d ch phenol/chloroform (t l 1:1) Ly tâm 1000 vòng/trong

3 phút Sau ly tâm dung d ch trong eppendorf tách thành 3 l p, trong đó DNA n m

l p trên cùng Hút l y l p d ch DNA v i th tích kho ng 500-600 µl L p l i b c này

C trong 1 gi Sau đó ly tơm l nh 10

phút 4oC sau khi ly tâm DNA t a l i đáy eppendorf, đ b phân d ch thu đ c

DNA k t t a

B c 8: thêm 500 µl ethanol 70%, ly tâm l nh 13000 vòng/phút trong 5 phút 4o

C

b ph n dch thu đ c DNA

B c 9: DNA sau khi thu s đ c làm khô t nhiên ho c s y khô

B c 10: Thêm 30-50 µl n c

2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph

2.3.2.1 Nguyên t c

HƠm l ng DNA có th xác đ nh đ c nh s h p thu m nh ánh sáng b c

sóng 260 nm Giá tr m t đ quang OD260nm (Optical Density 260 nm) c a các m u

DNA cho phép xác đ nh n ng đ DNA trong dung d ch (v i A260nm= 1OD = 50 µg/ml DNA s i đôi) tinh s ch c a DNA đ c đánh giá qua t l A260/A280 Có th xem DNA thu nh n đƣ tinh s ch khi giá tr nƠy dao đ ng t 1,8 ậ 2,0 [1]

2.3.2.2 Các b c ti n hành

DNA sau khi tách chi t đ c pha loãng 6 l n b ng n c c t vô trùng Sau đó

chuy n t t c dung dch vƠo cuvette vƠ đo n ng đ DNA b c sóng 260 nm tinh

s ch c a dung dch đ c xác đ nh b ng OD260/OD280

2.3.3 Bi n đ i bisulfide DNA

S d ng b kít Epitect Kit (Qiagen, Cat.No59104) đ th c hi n bi n đ i

bisulfide m u DNA tách chi t

B c 1: Chu n b ch t bi n đ i EZ1 (CT conversion reagent): tr n đ u 900 µl dung

d ch n c c t 2 l n vƠ 300 µl dung d ch EZ2 (M-Dilution bufer), 50 µl dung d ch EZ3

(M-Dissolving buffer) vƠo ng EZ1, tr n đ u trong 10 phút

B c 2: B sung 130 µl dung d ch EZ1 và 20 µl dung d ch DNA vƠo eppendorf 250

µl, tr n đ u

B c 3: X lỦ dung d ch DNA theo chu trình nhi t:

 98oC/10 phút

 64oC/60 phút

 64oC/60 phút

 64oC/30 phút

B c 4: Sau đó, b sung 600 µl EZ4 (M-binding buffer) vƠ dung d ch DNA đ c x

lỦ nhi t vƠo c t Zymo-spinTMIC (C1), đ o ng eppendort th t đ u Sau đó, ly tâm

13000 vòng/phút trong 30 giây, nhi t đ phòng

B c 5: B sung 100 µl EZ5 (M-washing buffer) vƠo c t C1, ly tơm 13000vòng/phút trong 3giơy, nhi t đ phòng

B c 6: B sung 200 µl EZ6 (M-desulphonation) vƠo c t C1, đ nhi t đ phòng 15-20

phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 giây

B c 7: B sung 200 µl EZ5 vƠo c t C1, ly tơm 13000 vòng/phút trong 30 giơy nhi t

đ phòng ( th c hi n 2 l n)

B c 8: t c t vƠo ependorf 1,5 ml, thêm 10 µl EZ7 (M-elution buffer), ly tâm 3000

vòng/phút trong 30 giơy, nhi t đ phòng Thu dung d ch DNA đ c bi n đ i bisulfite, b o qu n -20oC

2.3.4 Ph n ng MSP

Nguyên t c: MSP th c ch t là ph n ng PCR bình th ng i m khác bi t chú ý đơy lƠ ph n ng này s d ng m ch khuôn DNA đƣ đ c s lý sodium bisulfide

chuy n t t c các cytosine không b methyl hóa thành uracil Ph n ng MSP s d ng hai b m i methyl và unmethyl trong hai ph n ng riêng bi t đƣ đ c kh o sát đánh