MSP là m t k thu t PCR m i có đ nh y phát hi n đ n 0,1%, đ c s d ng đ đánh giá nhanh chóng tình tr ng methyl hóa c a h u h t các v trí CpG bên trong đ o CpG, do Herman và c ng s đ ara vƠo n m 1996 [22]. Trình t DNA đích tr c khi th c hi n ph n ng MSP ph i đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, khi m u DNA đ c bi n đ i bisulfide thì nh ng Cytosine không b methyl hóa trên đo n trình t s đ c bi n đ i thành Uracil (CU). Sau khi đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, m u DNA s đ c khu ch đ i v i hai c p m i methyl và không methyl đ c thi t k đ phân bi t gi a nh ng alen b methyl hóa và nh ng alen không b methyl hóa, c ng nh đ phân bi t v i nh ng DNA đƣ bi n đ i bisulfide v i nh ng DNA ch a bi n đ i bisulfide [18]. đ t đ c nh ng m c tiêu này thì trình t m i cho ph n ng MSP th ng đ c thi t k ch a nhi u Cytosine và có các c p CpG n m g n v trí 3’ c a các base [33].
PH N 2.
V T LI U VÀ PH NG
SV: Võ Th Ngh a 20
2.1 V T LI U
2.1.1 Khai thác c s d li u
2.1.1.1 Kh o sát in silico
có đ c nh ng thông tin đáng tin c y, nhóm nghiên c u chúng tôi đƣ ti n
hƠnh khai thác c s d li u trên PubMed b ng nh ng t khóa khác nhau nh :
Epigenetics, DNA methylation, GSTP1, Methyl-specific PCR, Breast cancer, Cervical cancer, Prostate cancer.
Nh ng bƠi báo đ c ch n l c đ th ng kê s li u đ c d a trên m c đ tin c y c a t p chí đ ng t i có mã tiêu chu n qu c t ISSN (International Standard Serial Number) và nh ng bài báo nghiên c u ung th vú, ung th c t cung vƠ ung th
tuy n ti n li t c a gen kh o sát GSTP1.
Trình t m i đ khu ch đ i gen GSTP1 đ c tham kh o tr c ti p trong các bài báo nghiên c u v m c đ methyl hóa trong ung th vú vƠ ung th c t cung c a nhóm nghiên c u tr c đơy c a phòng sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM [3].
2.1.1.2 Các công c và ch ng trình s d ng trong kh o sát in silico
PubMed: M t c s d li u trích d n và tóm t t cho v n h c y sinh h c t MEDLINE và khoa h c đ i s ng thêm t p chí. Liên k t đ c cung c p khi có phiên b n toƠn v n c a các bài vi t có s n thông qua PubMed Central (M t kho l u tr k thu t s c a y sinh h c toƠn v n vƠ đ i s ng v n h c khoa h c t p chí, bao g m c y h c lâm sàng và y t công c ng.) ho c các trang web khác. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/all/).
TFSearch (Transcription For Search): LƠ ch ng trình tr c tuy n đ c Yutaka
Akiyama ( i h c Kyoto) l p trình nh m giúp xác đ nh v trí nh n bi t c a các nhân t phiên mã trên vùng promoter c a gen.
SV: Võ Th Ngh a 21 Clustal: Là dãy các phiên b n ph n m n phân tích k t qu thí nghi m v c u trúc c a chu i DNA hay protein, b ng cách so sánh đ ng th i gi a t t c các chu i trình t ,
đ tìm ki m phát hi n ra nh ng đ c đi m đ ng nh t đ c đi m g n g i hay phơn ly gi a chúng.
Andhyb: Ki m tra v trí b t c p c a m i, m u dò vƠ kích th c s n ph m.
IDT (Integrated DNA Technologies): IDT analyzer
(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/): giúp xác đ nh các thông s quan tr ng c a m i nh kích th c, thành ph n GC, nhi t đ lai, kh n ng t o hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer,....
2.1.2. Kh o sát In vitro
2.1.2.1 V t li u
V t li u là 10 m u mô đúc paraffin b nh ph m ung th vú đ c cung c p b i b môn gi i ph u b nh thu c i h c Y D c TP.HCM. 2.1.2.2 D ng c và hóa ch t D ng c và hóa ch t tách chi t Phenol Merck Chloroform Merck SDS 10 % Bio Rad NaCl 5 M Tris HCl 1 M (pH=8)
EDTA 0.5 M (pH=8) Bio Rad
NH4OAc 5 M
Ethanol 100 % Vi t Á Ethanol 70 % Vi t Á
SV: Võ Th Ngh a 22 Proteinase K Fermentas
Máy ly tâm l nh Hettich
D ng c và hóa ch t cho ph n ng MSP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Máy PCR Bio Rad Master mix Bio Rad
M i IDT
N c c t 2 l n
D ng c và hóa ch t đo quang ph
Máy đo quang ph : Bio Rad
N c c t 2 l n
D ng c và hóa ch t đi n di
Máy đi n di BioRad Gel agarose BioRad
TE 1X BioRad
Ethidium Bromide BioRad Loading dye BioRad
SV: Võ Th Ngh a 23
2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Khai thác c s d li u
Ti n hành khai thác d li u trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), s d ng công c Pubmed v i các t khóa epigenetics, DNA methylation, breast cancer, cervical cancer, Prostate cancer nh m thu th p thông tin, d li u bao g m nh ng thông tin t ng quan v t n s methyl hóa c a ung th vú, ung th c t cung, ung th tuy n ti n li t, epigenetics, methyl hóa DNA, thu th p trình t c a gen GSTP1 thông qua mã s accession number NC_000011.10 c a nhi m s c th 11.
2.2.2 Kh o sát in silico
2.2.2.1 Th ng kê t n s methyl hóa
Th ng kê trung bình có tr ng s : Trung bình có tr ng s là giá tr trung bình có ph n ánh t m quan tr ng c a các ph n t (hay giá tr quan sát) trong t p h p đó. M i m t giá tr quan sát s đ c g n m t tr ng s nh m lo i b các y u t có th nh
h ng đ n k t qu th ng kê nh ph ng pháp ti n hành th c nghi m khác nhau, ngu n g c m u b nh nhân khác nhau, s l ng m u khác nhau hay th i gian khác nhau.
Sau khi đƣ thu th p các s li u v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 trên hai lo i
ung th lƠ ung th vú,ung th c t cung vƠ ung th tuy n ti n li t chúng tôi ti n hành th ng kê trung bình có tr ng s và v bi u đ v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 qua các lo i m u khác nhau (bao g m m u mô đúc parafin, m u huy t thanh, m u máu và m u n c ti u).
SV: Võ Th Ngh a 24 2.2.2.2 Thu nh n trình t gen, xác đ nh c u trúc gen và đ o CpG
Trong ti n trình kh o sát in silico, b c đ u tiên chúng tôi ti n hành thu nh n trình t gen GSTP1 t ngân hàng gen b ng mã s truy c p là NC_000011.10 k t h p v i ch ng trình Ensemble đ l y đúng trình t vùng promoter c a gen GSTP1.
Sau đó chúng tôi ti n hƠnh xác đ nh các vùng ch c n ng quan tr ng c a gen nh :
promoter, 5’UTR, exon 1, v trí g n c a các nhân t phiên mã b ng ch ng trình
TFsearch, xác đ nh các đ o CpG b ng Methprimer. 2.2.2.3 ánh giá m i
i v i đo n m i cho ph n ng MS-PCR chúng tôi đƣ tham kh o t m t s bài báo th c nghi m trên ngân hàng d li u NCBI c ng nh k th a m i methyl và
unmethyl đƣ đ c thi t k và th nghi m cho MSP trên gen GSTP1 t nhóm nghiên c u t i phòng thí nghi m sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM nh ng n m tr c [3]. Sau đó chúng tôi ti n hành kh o sát đánh giá các thông s v t lý trên IDT nh m xác đnh m t s thông s quan tr ng nh : kích th c m i, % GC, nhi t đ lai, kh n ng t o các c u trúc hairpin loop, heterodimer. Kh n ng b t c p b sung, v trí b t c p vƠ kích th c s n ph m t o thành c a m i đ c ki m tra b ng ph n m n Annhyb-4.944, phiên b n 2011. 2.3 KH O SÁT IN VITRO 2.3.1 Tách chi t DNA 2.3.1.1 Nguyên t c Ph ng pháp đ c s d ng đ tách chi t DNA là ph ng pháp
phenol/chloroform. Do đ c thù c a ngu n m u đ c b o qu n trong paraffin nên chúng tôi đƣ s d ng xylene đ x lỦ paraffin tr c khi ti n hành tách chi t DNA.
SV: Võ Th Ngh a 25 h p s c nhi t. Sau đó protein s đ c bi n tính b ng phenol/chloroform và b lo i b . DNA b gen s đ c t a v i ethanol l nh.
2.3.1.2 Các b c ti n hành
B c 1: Ti n hành c t nh m u b nh ph m cho vào ng eppendorf lo i 1,5 ml, thêm 1ml xylene, vortex 1 phút, ly tơm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Sau ly tơm đ b ph n d ch n i (l p l i 3 l n). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B c 2: Thêm 1ml Ethanol 100 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, sau ly tơm đ b ph n d ch n i, s l n l p l i ph thu c vào s l n x lý v i xylene.
B c 3: Làm khô m u: làm khô t nhiên ho c dùng máy s y trong 30 phút.
B c 4: Thêm 700 µl dung d ch lysis buffer, 55oC t 2-4 ngày.
B c 5: Cho 700 µl dung d ch phenol/chloroform (t l 1:1). Ly tâm 1000 vòng/trong 3 phút. Sau ly tâm dung d ch trong eppendorf tách thành 3 l p, trong đó DNA n m l p trên cùng. Hút l y l p d ch DNA v i th tích kho ng 500-600 µl. L p l i b c này 2 l n.
B c 6: Cho 500 µl chloroform. em ly tơm 10000 vòng/phút trong 3 phút. Dung d ch
sau ly tơm đ c phân tách v i ph n d ch n i phía trên ch a DNA. Dùng pipet hút 300µl l p d ch ch a DNA, có th hút nhi u h n nh ng c n l u Ủ tránh ch m vào l p dch phía d i.
B c 7: Thêm 60 µl (0,2V d ch DNA) NH4OAc 5M cho ti p vào 750 µl (2,5V d ch DNA) ethanol 100%. Tr n đ u đ nhi t đ -20oC trong 1 gi . Sau đó ly tơm l nh 10 phút 4oC . sau khi ly tâm DNA t a l i đáy eppendorf, đ b phân dch thu đ c DNA k t t a.
B c 8: thêm 500 µl ethanol 70%, ly tâm l nh 13000 vòng/phút trong 5 phút 4oC. b ph n dch thu đ c DNA.
SV: Võ Th Ngh a 26
B c 9: DNA sau khi thu s đ c làm khô t nhiên ho c s y khô.
B c 10: Thêm 30-50 µl n c.