Gen Lo i ung th Trình t m i (5’-3’) L Tm ( oC) (1) (2) (3) %GC P (bp) GSTP1 Ung th vú G1-M-F 20 62 0,13 -13,09 -9,21 65 91 G1-M-R 22 55,8 1,51 -3,61 50 G1-U-F 24 57,6 1,55 -1,47 -16,4 45,8 97 G1-U-R 24 55,1 1,51 -1,47 41,7 Ung th c t cung G1-M-F 20 61,8 -0,16 -3,61 -9,21 65 91 G1-M-R 22 55,8 1,51 -3,61 50 G1-U-F 24 57,6 1,55 -1,47 -16,4 45,8 97 G1-U-R 24 55,1 1,51 -1,47 41,7
B ng 1.12, 1.13 là trình t và các thông s v t lý c a m i tham kh o trong các bài báo nghiên c u v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 trên hai lo i ung th lƠ ung th vú vƠ ung th c t cung. Các trình t m i đ c đánh giá trên IDT, nhìn chung các
thông s c a m i đ u n m trong gi i h n cho phép c a m i, nh ng c ng t ng t nh
b m i cho MSP k th a t nghiên c u tr c c a phòng thí nghi m sinh h c phân t
n ng l ng liên k t t do hình thành c u trúc heterodimer c a m i xuôi methyl hóa thì
v t ra ngoài gi i h n cho phép c a m i (-13,09).
T k t qu thu đ c b ng 1.13 chúng tôi nh n th y: thông s chi u dài c a m i là phù h p cho m t ph n ng PCR, thông s % GC và Tm c a m i ch a th t s t i u
SV: Võ Th Ngh a 49 V thông s delta G, chúng tôi nh n th y các thông s nƠy đa ph n l n h n giá tr âm 9 kcal/mol.
Vi c thu th p các trình t m i cho ph n ng MSP khu ch đ i vùng promoter c a GSTP1, đ ng th i chúng tôi c ng tham kh o m i t nghiên c u tr c đơy c a phòng thí nghi m sinh h c phân t nh m m c đích tìm ra nh ng c p m i phù h p nh t cho ph n ng khu ch đ i MSP (tr c tiên là các thông s v t lý c a m i). T s so sánh gi a 2 h m i trên chúng tôi nh n th y r ng c hai h m i nƠy đ u có nh ng thông s
ch a th t s phù h p cho ph n ng MSP: ví d nh Tm hay % GC. Vì v y nên chúng tôi quy t đ nh s d ng h m i k th a t i phòng thí nghi m sinh h c phân t nh m ti t ki m chi phí th c nghi m.
3.3 K T QU TH C NGHI M
3.3.1 K t qu tách chi t DNA
đánh giá ch t l ng các m u b nh ph m ung th vú đ c tách chi t b ng ph ng
pháp phenol/chloroform, chúng tôi ti n hƠnh đo OD các m u DNA đƣ tách chi t, k t qu th hi n b ng 1.14.
B ng 1.14N ng đ vƠ ch t l ng DNA tách chi t
M u A260nm H s pha loãng A260nm /A280nm N ng đ (ng/µl) M u A260nm H s pha loãng A260nm /A280nm N ng đ (ng/µl) 1 0,020 80 0,8630 0,9849 6 0,081 80 0,063 4,0440 2 0,020 80 1,2450 0,9849 7 0,017 80 0,017 0,8374 3 0,116 80 1,2901 5,8141 8 0,038 80 0,029 1,8810 4 0,031 80 0,9496 1,5655 9 0,047 80 0,033 2,3262
SV: Võ Th Ngh a 50 5 0,062 80 1,2901 3,1145 10 0,010 80 0,012 0,4958
V i k t qu đo OD thu đ c trên cho th y ch t l ng DNA tách chi t ch a t t, m u DNA còn nhi m protein th hi n qua thông s A260nm/A280nm th p và n ng đ DNA thu đ c ch a cao.
3.3.2 K t qu ph n ng MSP trên các m u DNA b nh ph m ung th vú
M u b nh ph m ung th vú sau khi đ c tách chi t và bi n đ i bisulfide, chúng tôi th c hi n ph n ng MSP đ kh o sát m c đ methyl hóa c a các m u DNA b nh ph m v i c p m i đ c hi u cho GSTP1. Ph n ng MSP v i m i methyl đ c hi u cho GSTP1 đ c th c hi n trên 10 m u b nh ph m ung th vú. K t qu thu đ c đ c th hi n trên hình 1.19 và 1.20.
Hình 1.20 K t qu đi n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F và G-M-R Hình 1.20 là k t qu đi n di c a 5 m u b nh ph m ung th vú 1, 2, 3, 4, 5 và m u âm. Theo k t qu trên hình 1.20, s n ph m khu ch đ i MSP c a các m u 2, 3, 4, 5 t o thƠnh có kích th c nh mong đ i lƠ 199 bp. i u này ch ng t các m u nƠy đƣ b
SV: Võ Th Ngh a 51 methyl hóa. Ch ng âm không xu t hi n v ch s n ph m cho th y các v ch s n ph m
trên đơy xu t hi n là lo i tr kh n ng b nhi m DNA t bên ngoài.
Hình 1.21 K t qu đi n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F và G-M-R
T ng t nh v y, hình 1.21 là k t qu đi n di c a 5 m u b nh ph m DNA ung
th vú 6, 7, 8, 9, 10 và m u âm. K t qu trên hình cho th y MSP âm tính v i t t c các m u, nh đi n di không cho th y có xu t hi n v ch s n ph m. i u này cho th y các m u trên là không b methyl hóa.
Nhìn chung, tuy có s xu t hi n c a các v ch s n ph m nh ng các v ch s n ph m lƠ ch a rõ rƠng. i u này có th là do ch t l ng c a DNA tách chi t lƠ ch a t t, n ng đ DNA th p c ng nh b đ t gãy hay b m t trong quá trình b o qu n d n đ n hi u su t b t c p th p, vì th l ng DNA khu ch đ i ch a đ đ cho k t qu đi n di rõ ràng.
SV: Võ Th Ngh a 52 Hình 1.22 K t qu gi i trình t s n ph m MSP c a gen GSTP1
(a)Là vùng trình t GSTP1 ch a bi n đ i bisulfide (b)Là vùng trình t GSTP1 đã bi n đ i bisulfide
Trình t g ch d i, in đ m: trình t g n c a m i xuôi methyl G1-M-F. Các cytosine không thu c đ o CG đ c tô màu vàng. CG đ c tô màu xanh.
(c)Là trình t thu đ c t gi i trình t v i c p m i xuôi methyl G1-M-F. Vùng 1: vùng g n c a m i ng c methyl; vùng 2: v trí c a 6 CG n m trong vùng kh o sát; vùng 3:
v trí c a 3 CG n m trong vùng kh o sát.
Phân tích k t qu gi i trình t c a m i xuôi methyl t s n ph m MSP v i m i methyl hóa c a GSTP1 trên cho th y, vùng cu i c a trình t này xu t hi n chính xác t ng nucleotide c a m i ng c methyl (vùng 1, hình 1.22). Hình nƠy c ng cho th y c 4 v trí CpG trên m i ng c methyl đ u b methyl hóa.
SV: Võ Th Ngh a 53 Bên c nh đó, vùng trình t n m gi a hai m i cho k t qu trùng kh p , 6 v trí CG trong vùng 2 và 3 v trí CG trong vùng 3 đ u b methyl hóa ( hình 1.22, vùng 2 và 3). T k t qu trên cho th y r ng vùng trình t DNA đ c kh o sát dƠi 199 bp đƣ b methyl hóa hoƠn toƠn. Các đnh tín hi u hu nh quang t ng đ i cao và rõ ràng, h u h t là có duy nh t m t đnh tín hi u (hình 1.22(c)).
ng th i k t qu gi i trình t trên còn cho th y quá trình bi n đ i DNA b ng sodium bisulfide th c hi n tr c đó đƣ thành công. Các cytosine không n m trong c p
dinicleotide CpG đ u đ c chuy n thành uracil.
B ng 1.15T ng k t k t qu methyl hóa c a GSTP1 trên 10 m u ung th vú
M u GSTP1 M u GSTP1 1 - 6 - 2 + 7 - 3 + 8 - 4 + 9 - 5 + 10 -
Nh v y, v i nh ng k t qu in silico và in vitro thu đ c chúng tôi m t l n n a kh ng đnh tính khoa h c c a b m i đ c s d ng cho MSP nh m đánh giá tình tr ng
methyl hóa đ i di n cho vùng promoter c a gen GSTP1 trên ung th vú. Tuy v y, vì th i gian có h n và nh ng g p khó kh n trong quá trình xin m u ung th tuy n ti n li t nên chúng tôi v n ch a ti n hành th c nghi m đ c trên ung th c t cung vƠ ung th
SV: Võ Th Ngh a 54
3.4 M C LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I
VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I NHịM TU I/ TU I C A CÁC B NH NHÂN UNG TH VÚ Phân nhóm tu i K t lu n methyl T l Âm D ng N1 (<40) 3 (50,0 %) 1 (25,0 %) 4 (40%) N2 (40-50) 2 (33,3 %) 1 (25,0 %) 3 (30 %) N3 (>50) 1 (16,7 %) 2 (50,0 %) 3 (30 %) 6 (60%) 4 (40%) 10 (100 %) Chi ậ squared 1,319 DF 2 Significance P = 0,5241
B ng phép th ng kê Chi ậ squared, chúng tôi đƣ kh o sát đ c m c đ liên quan c a tính ch t methyl hóa c a vùng promoter c a GSTP1 v i nhóm tu i c a các b nh nhơn ung th vú (b ng ph l c). Qua giá tr P thu đ c 0,5241 (p> 0,05), đi u này cho th y m c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter trên GSTP1 v i nhóm tu i không đ t Ủ ngh a th ng kê.
SV: Võ Th Ngh a 55
3.5 M C LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I
VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I GIAI O N B NH C A
CÁC B NH NHÂN UNG TH VÚ Giai đo n b nh K t lu n methyl T l Âm D ng 1 2 (33,3 %) 0 (0%) 2 (20%) 2 2 (33,3 %) 1 (25%) 3 (30 %) 3 0 (0%) 1 (25%) 1 (10 %) 4 0 (0%) 1 (25%) 1 (10 %) N 2 (33,3%) 1 (25%) 3 (30%) 6 (60%) 4 (40%) 10 (100%) Chi-squared 4.444 DF 4 Significance P = 0.3492
i v i y u t giai đo n ung th : s li u đ c th ng kê b ng phép th ng kê Chi ậ squared trên cho th y tình tr ng methyl hóa có s phân b r i rác các giai
đo n t giai đo n 2 đ n giai đo n 4, tình tr ng methyl c ng đ c tìm th y trong các m u lành. Tuy nhiên, k t qu methyl hóa ch a cho th y tính ch t methyl hóa t i các v trí CpG thu c vùng promoter gen GSTP1 đ c kh o sát trong nghiên c u có liên quan v i giai đo n b nh ( p= 0,3492).
SV: Võ Th Ngh a 56
3.6 KH O SÁT M C LIÊN QUAN (T SU T CHÊNH - ODD
RATIO - OR VÀ NGUY C T NG I - RELATIVE RISK -
RR) GI A TệNH CH T METHYL HịA V I UNG TH VÚ
B ng 1.16 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i ung th vú
GSTP1 v i ung th vú
Lo i m u Không methyl Methyl Giá tr p*
M u lành 2 1 M u ung th 4 3 6 (60%) 4 (40%) <0,05 T su t chênh (OR) 1,50 <0,05 Ti s nguy c 1,33 <0,05
K t qu th ng kê cho th y t su t trên OR=1,50, có ngh a lƠ nhóm b methyl hóa vùng promoter c a gen GSTP1 v i y u t nguy c , t l ung th vú cao g p 1,5 l n so v i nhóm không b methyl hóa, s chênh l ch nƠy lƠ đáng tin c y (P<0,05).
T s nguy c RR=1,33 có ngh a lƠ nguy c b nh ung th vú nhóm b methyl hóa vùng promoter c a gen GSTP1 cao g p 1,33 l n so v i nhóm không b methyl hóa, s khác bi t nƠy lƠ có Ủ ngh a th ng kê (p <0,05)
PH N 4.
SV: Võ Th Ngh a 57
4.1 K T LU N
Qua quá trình th c hi n đ tài, chúng tôi rút ra m t s k t lu n sau:
M t l n n a kh o sát l i t n s methyl hóa c a GSTP1 trên ung th vú sau khi k
th a k t qu c a nh ng nghiên c u tr c v t n s methyl hóa c a GSTP1 trên lo i
ung th nƠy.
B c đ u tìm hi u v t n s methyl hóa c a GSTP1 trên ung th tuy n ti n li t thông qua các bài báo nghiên c u trên th gi i. K t qu cho th y ti m n ng r t l n đ
GSTP1 tr thành d u ch ng sinh h c trong vi c phát hi n ung th tuy n ti n li t.
ƣ thƠnh công trong vi c th c hi n ph n ng MSP kh o sát m c đ methyl hóa c a GSTP1 trên 10 m u b nh ph m ung th vú v i t l methyl hóa là 4/10 m u.
Nh ng d li u v methyl hóa c a GSTP1 trên 3 lo i ung th : ung th vú, ung th
c t cung vƠ ung th tuy n ti n li t thu nh n đ c là r t có giá tr trong vi c tích l y đ hình thành m t c s d li u nh m h ng t i vi c s d ng hi n t ng methyl hóa
nh m t d u ch ng sinh h c ti m n ng trong ch n đoán, tiên l ng vƠ đi u tr 3 lo i
ung th trên mƠ nh t lƠ đ i v i ung th tuy n ti n li t khi mà t n s methyl hóa c a GSTP1 trên gen nƠy khá cao (43,3%) c ng nh s l ng nghiên c u v methyl hóa c a gen nƠy trên ung th tuy n ti n li t lƠ t ng đ i nhi u.
Hi n t ng methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i y u t nguy c lƠm t ng kh n ng m c b nh ung th vú cao g p 1,50 (OR=1,50, p<0,05) so v i nhóm không b methyl hóa. ng th i, nguy c m c b nh ung th vú nhóm b methyl hóa vùng promoter c a GSTP1 c ng cao g p 1,33 l n so v i nhóm không b methyl hóa (RR=1,33, p<0,05).
SV: Võ Th Ngh a 58
4.2 NGH
Ti p t c kh o sát t n s methyl hóa c a GSTP1 v i c m u l n h ntrên ung th vú.
Ti n hành kh o sát t n s methyl hóa c a GSTP1 trên ung th c t cung vƠ ung th
SV: Võ Th Ngh a 59
TÀI LI U THAM KH O
Tài li u ti ng Vi t
1. H Hu nh Thùy D ng (1959), Sinh H c Phân T , NXB Giáo D c, Tp.HCM.
2. Lê ình V n (2006), Gi i Ph u H c, NXB Y h c hu .
3. Nguy n Phan C m Trang, Phan Th M H ng (2011), Kh o sát m c đ methyl hóa t i các đ o CpG thu c vùng promoter c a các gen RASSF1A, GSTP1, CYCLIN D2,
BRCA1 và p16INK4A trong ung th vú, Th vi n đ tài nghiên c u khoa h c sinh viên
Eureka, i H c M Tp.HCM.
Tài li u ti ng Anh
4. Adam M, Christopher R, McCudden, Frank Wians, et al. (2009), Recent Advances in the Detection of Prostate Cancer Using Epigenetic Markers in Commonly Collected Laboratory Samples, Lab Med, pp.446-469.
5. AhmedY. (2013), Frequent DNA Hypermethylation at the RASSF1A and APC Gene Loci in Prostate Cancer Patients of Pakistani Origin,Clinical Study, pp.1-4
6. Ajay G. (2010), DNA methylation-based fecal biomarkers for the noninvasive screening of GI cancers, Future Oncology, 6(3), pp. 333-336.
7. Alok Mishra, Mukesh Verma. (2010), Cancer Biomarkers: Are We Ready for the Prime Time?, Cancers, pp. 190-208.
8. Ana Paula SarretaTerra ,Eddie Fernando Candido Murta, et al. (2007), Aberrant promoter methylation can be useful as a marker of recurrent disease in patients with cervical Intraepithelial neoplasia grade III, Research Institute of Oncology, pp. 572-579.
9. Anant Narayan Bhatt, Rohit Mathur, et al. (2010), Cancer biomarkers - Current perspectives, Indian J Med Res, pp. 129-149.
SV: Võ Th Ngh a 60
10. Andrew P. Feinberg, Benjamin Tycko. (2004), The history of cancer epigenetics, Nature Reviews Cancer, pp. 143-153.
11. Ann M. Moyer, Oreste E. Salavaggione, et al. (2008), Glutathione S-Transferase P1: Gene Sequence Variation and Functional Genomic Studies, Cancer Research, 68: (12), pp. 4791:4800.
12. Anubha Saxena, Varinderpal, S. dhillon, et al. (2012), GSTP1 methylation and polymorphism increase the risk of breast cancer and the effects of diet and lifestyle in breast cancer patients, Experimental and Therapeutic Medicine, pp. 1097-1103.
13. Arvind K. Virmani, Carolyn Muller, Asha Rathi, et al. (2001), Aberrant Methylation During Cervical Carcinogenesis, Clin Cancer Res, pp. 584-589.
14. Bhatt AN, Mathur R, Farooque A, Verma A, Dwarakanath BS. (2010), Cancer biomarkers - current perspectives, Indian J Med Res, pp. 129-149.
15. Behrens J, von Kries JP, Kuhl M. (1996), Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1, Nature, 382: (6592), pp. 638 ậ 642
16. Bock Christoph(2009), Epigenetic biomarker development, Epigenomics, 1(1), pp.99-110.
17. Brooks J.,C. Cairns, and A.Zeleniuch Jacquotte. (2009), Promoter methylation and detection of breast cancer, Cancer Causes Control, 20(9), pp. 1539ậ1550
18. Carmen Jeronimo, Isabel Costa, M. Conceicao Martins, et al. (2003), Detection Of Gene Promoter Hypermethylation In Fine Needle Washings From Breast Lesions, Clin Cancer Res, pp. 3413-3417.
19. Celeste H Schietinger. and Norbert O. Reich. (2010), The inherent processivity of the human de novo methyltransferase 3A (DNMT3A) is en-hanced by DNMT3L, The Journal of Biological Chemistry, 285(38), pp. 29091-29100.
20. Chatterjee, S.K, Zetter, B.R. (2005), Cancer biomarkers: knowing the present and predicting the future, Future Oncol, pp. 37ậ50.