Ung th lƠ k t qu c a nhi u c ch khác nhau trong c th , trong đó bao g m c nh ng bi n đ i bi u sinh mƠ đ c bi t là hi n t ng methyl hóa trên DNA. S methyl hóa DNA t i các đ o CpG đóng m t vai trò quan tr ng trong vi c đi u ti t bi u hi n gen, mô hình b t th ng trong methyl hóa DNA th ng d n đ n nhi u b nh khác nhau [15, 32, 45, 77, 80].
Khi s methyl hóa quá m c x y ra trên vùng promoter c a các gen c ch kh i u s d n đ n nh ng ho t đ ng b t n c a gen b ng nhi u c ch khác nhau [11, 12]. Bi u hi n c a gen b c ch theo hai c ch riêng bi t, c ch tr c ti p vƠ c ch gián ti p. i v i c ch tr c ti p, khi m t gen b methyl hóa quá m c thì quá trình sao chép c a gen s b ng n ch n vƠ quá trình phiên mƣ c ng b kìm hãm. c ch c ch gián ti p, c ch nƠy liên quan đ n 2 lo i protein methylation-binding protein (MBD).
SV: Võ Th Ngh a 14 Protein MBD th hi n s t ng đ ng v i vùng domain c a MBD trên gen, trong khi
đó các vùng domain c a các nhân t đƠn áp quá trình phiên mƣ (transcription re- pression domains (TRDs) đ c bi t đ n g n li n v i MeCP2, MBD1 và MBD2 [51].
Trên vùng domain c a MBD, MBD1 đ c g n vào DNA không b methyl hóa, lúc này MBD2 s không g n đ c vào v trí nƠy, đ c tính c a protein MBD2 là làm du i th ng glycine vƠ arginine trong vùng domain MBD lƠm ng n ch n s ti p c n c a các y u t phiên mã (Transcription Facter) t i vùng promoter d n đ n làm ng ng quá trình phiên mã [28, 53]. Y u t HDAC ( ) c ng đ c g n vào vùng DNA methyl hóa làm c ch quá trình phiên mã, s g n c a HDAC vào
vùng DNA methyl hóa lƠm thay đ i c u trúc DNA ng n ch n s ti p c n c a các y u t phiên mã. Nh ng gen tr ng thái không b methyl hóa quá m c, các đ o CpG trên vùng promoter tr ng thái ho t đ ng bình th ng, y u t phiên mã (Transcription Facter-TF) s đnh v t i vùng kh i đ ng phiên mã c a gen [51].
SV: Võ Th Ngh a 15 Chú thích:
(A) Gen nhi u đ o CpG trong vùng promoter.
(B) Trong mô tuy n ti n li t kh e m nh, các y u t phiên mƣ nh AP-1 và Sp-1 liên k t v i promoter và kích thích phiên mã.
(C) Trong b nh ung th tuy n ti n li t, đ o CpG b methyl hóa.
Nh v y, h qu c a methyl hóa DNA trên nh ng gen c ch kh i u là làm gi m s bi u hi n gen vì v y đ c g i là làm im l ng gen. Hi n t ng im l ng này là do s kích ho t ho t đ ng c a quá trình gi m ái l c hay làm xóa b hoàn toàn kh n ng g n k t c a các y u t phiên mã (Trancripstion factor) vào vùng DNA b methyl hóa ho c
t ng tác tr c ti p v i DNMTs, histone deacetylases, methyltransferases hay các ch t
đ ng c ch phiên mã khác [17].
1.4 T NG QUAN V GSTP1
1.4.1 GST (glutathione S-transferases)
GST là m t enzyme hi n di n trong h u h t các t bào s ng [3, 31]. GST là enzyme xúc tác liên k t v i các ch t đi n t giai đo n hai trong quá trình gi i đ c nh m làm gi m quá trình oxy hóa. Bên c nh đó, GST còn đ c tìm th y tham gia vào nhi u c ch trong t bƠo nh : quá trình truy n tín hi u và apoptosis, ch không ch gi i h n trong vai trò gi i đ c xenobiotic nh đ c bi t đ n tr c đơy [3, 71, 72].
1.4.2 Gen GSTP1 (Glutathione S Tranferase P1)
Tham kh o t ngu n: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/GSTP1, gen GSTP1 g m 7 exon và 8 intron dài kho ng 3 kb , n m trên cánh dài c a nhi m s c th s 11 v trí 13. Trong s t t c nh ng enzyme GST thì GSTP1 là m t đ ng v GST có liên quan đ n nhi u lo i ung th nh t bao g m ung th vú, ung th tuy n ti n li t, đ i tr c tràng, não, ph i và lá lách [40, 58, 79, 81].
SV: Võ Th Ngh a 16
Protein GSTP1 đ c mã hóa tr c ti p t gen GSTP1 đóng m t vai trò quan tr ng trên t bƠo bình th ng và t bƠo ung th . Protein GSTP1 ho t đ ng v i nhi u ch c
n ng khác nhau bao g m tham gia vào quá trình ho t đ ng chuy n hóa xenobiotic gi i
đ c t , mã hóa protein c ch kh i u, các quá trình b o v t bào đ i v i nh ng s n ph m liên k t c a DNA v i hóa ch t gơy ung th (Adducts DNA), đáp ng l i v i quá trình stress, truy n tín hi u và quá trình apoptossis [35, 54, 83].
Hình 1.8 V trí gen GSTP1 trên NST s 11 [88]
áng chú Ủ lƠ protein GSTP1 tham gia vƠo vi c xúc tác cho s g n c a glutathione tripeptide (ch t ch ng oxy hóa) v i m t lo t ch t l c đi n t bao g m c genotoxin, ch t gơy ung th vƠ các ch t hóa tr li u t đó giúp các t bào tránh kh i nh ng tác nhân là các g c oxy hóa này [6]. Khi có s methyl hóa quá m c t i các đ o CpG trên vùng promoter c a gen thì s bi u hi n c a gen s b c ch .
1.4.3 C ch ho t đ ng c a GSTP1
Nh đƣ trình bƠy trên GSTP1 đóng m t vai trò quan tr ng trong nhi u ho t
đ ng c a c th v i nhi u ch c n ng khác nhau, trong đó GSTP1 n i b t v i vi c tham gia vào ph n ng stress và quá trình apoptosis c ng nh trong s t ng sinh c a t bào [21].
SV: Võ Th Ngh a 17 Hình 1.9 Ch c n ng c a protein GSTP1 trong t bƠo [48]
Ho t đ ng c a protein GSTP1 bao g m tham gia xúc tác cho s k t h p c a glutathione (GSH) - m t ch t ch ng oxy hóa trong t bƠo đ ng v t, n m và vi khu n v i nh ng g c oxy hóa nh các ph c h p ái l c đi n t , các ch t gơy ung th vƠ m t s ch t ngo i sinh khác t đó ng n ch n s ti p xúc c a các g c oxy hóa này đ i v i các t bƠo trong c th . Ngoài ho t đ ng xúc tác cho s g n c a glutathionine (GSH) v i các g c oxy hóa, protein GSTP1 còn đ c bi t đ n v i vai trò là m t phi enzyme. V i vai trò là m t phi enzyme, ho t đ ng c a protein GSTP1 là g n v i C-Jun N- terminal kinase (JNK) thu c h protein kinase và TRAF2 (TNF receptor- associated factor 2) đ hình thành ph c h p GSTP1/JNK [25, 35, 43, 48]. Ph c h p này s kích ho t vƠ đáp ng v i các kích thích hay stress c a t bào ch ng h n nh đáp ng v i các y u t tia c c tím hay nhi t đ , t đó làm kích ho t quá trình apoptosis. Bên c nh
đó, ph c h p c a protein GSTP1/JNK còn kích ho t y u t phiên mã AP-1 đ kích ho t quá trình phiên mã bi u hi n ch c n ng c a gen. Nh v y v i vai trò c a m t phi
SV: Võ Th Ngh a 18 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
enzyme, GSTP1 đóng vai trò quan tr ng trong d n truy n tín hi u t bào, k t qu c a ho t đ ng này nh m quy đnh m t con đ ng ki m soát s t ng sinh vƠ s ch t c a t bào b ng con đ ng apoptosis [33, 40, 42,68].
Vi c methyl hóa quá m c x y ra trên vùng promoter c a GSTP1 s lƠm ng n c n s g n c a các y u t phiên mã lên vùng promoter c a gen, đ ng th i enzyme RNA polymerase II không còn kh n ng t ng tác v i vùng promoter. K t qu là làm c ch quá trình phiên mã gây gi m sút ho t đ ng và m t ki m soát các con đ ng ch c n ng
c a gen. Do đó lƠm gián đo n ho c d ng c ch s a ch a DNA, lúc này nh ng t n
th ng DNA s tích l y d n trong khi t bào v n đi vƠo quá trình sao chép vƠ phơn
bào b t k các đ t bi n hay sai h ng DNA gây ra nhi u quá trình b t l i cho c th mà nghiêm tr ng nh t là d n đ n ung th [32, 33, 36, 49].
Hình 1.10 Mô hình mô t t ng tác c a GSTP1-JNK và GSTP1- TRAF2 trong con
SV: Võ Th Ngh a 19
1.5 CÁC PH NG PHÁP PHÁT HI N S METHYL HÓA DNA
1.5.1 Ph ng pháp bi n đ i BSP (Bisulfide sequencing PCR)
BSP là m t ph n ng PCR di n ra qua hai b c: b c đ u tiên là s bi n đ i sodium bisulfide DNA.Ti p sau đó lƠ th c hi n ph n ng PCR khu ch đ i trình t
DNA đƣ đ c bi n đ i b i các m i đ c hi u. S n ph m PCR có th đ c s d ng theo
ba h ng sau: gi i trình t sau khi t o dòng, gi i trình t tr c ti p ho c k t h p v i các enzyme c t gi i h n nh y v i hi n t ng methyl hóa đ ki m tra s methyl hóa c a các v trí CpG đ c bi t [73].
1.5.2 Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP)
MSP là m t k thu t PCR m i có đ nh y phát hi n đ n 0,1%, đ c s d ng đ đánh giá nhanh chóng tình tr ng methyl hóa c a h u h t các v trí CpG bên trong đ o CpG, do Herman và c ng s đ ara vƠo n m 1996 [22]. Trình t DNA đích tr c khi th c hi n ph n ng MSP ph i đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, khi m u DNA đ c bi n đ i bisulfide thì nh ng Cytosine không b methyl hóa trên đo n trình t s đ c bi n đ i thành Uracil (CU). Sau khi đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, m u DNA s đ c khu ch đ i v i hai c p m i methyl và không methyl đ c thi t k đ phân bi t gi a nh ng alen b methyl hóa và nh ng alen không b methyl hóa, c ng nh đ phân bi t v i nh ng DNA đƣ bi n đ i bisulfide v i nh ng DNA ch a bi n đ i bisulfide [18]. đ t đ c nh ng m c tiêu này thì trình t m i cho ph n ng MSP th ng đ c thi t k ch a nhi u Cytosine và có các c p CpG n m g n v trí 3’ c a các base [33].
PH N 2.
V T LI U VÀ PH NG
SV: Võ Th Ngh a 20
2.1 V T LI U
2.1.1 Khai thác c s d li u
2.1.1.1 Kh o sát in silico
có đ c nh ng thông tin đáng tin c y, nhóm nghiên c u chúng tôi đƣ ti n
hƠnh khai thác c s d li u trên PubMed b ng nh ng t khóa khác nhau nh :
Epigenetics, DNA methylation, GSTP1, Methyl-specific PCR, Breast cancer, Cervical cancer, Prostate cancer.
Nh ng bƠi báo đ c ch n l c đ th ng kê s li u đ c d a trên m c đ tin c y c a t p chí đ ng t i có mã tiêu chu n qu c t ISSN (International Standard Serial Number) và nh ng bài báo nghiên c u ung th vú, ung th c t cung vƠ ung th
tuy n ti n li t c a gen kh o sát GSTP1.
Trình t m i đ khu ch đ i gen GSTP1 đ c tham kh o tr c ti p trong các bài báo nghiên c u v m c đ methyl hóa trong ung th vú vƠ ung th c t cung c a nhóm nghiên c u tr c đơy c a phòng sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM [3].
2.1.1.2 Các công c và ch ng trình s d ng trong kh o sát in silico
PubMed: M t c s d li u trích d n và tóm t t cho v n h c y sinh h c t MEDLINE và khoa h c đ i s ng thêm t p chí. Liên k t đ c cung c p khi có phiên b n toƠn v n c a các bài vi t có s n thông qua PubMed Central (M t kho l u tr k thu t s c a y sinh h c toƠn v n vƠ đ i s ng v n h c khoa h c t p chí, bao g m c y h c lâm sàng và y t công c ng.) ho c các trang web khác. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/all/).
TFSearch (Transcription For Search): LƠ ch ng trình tr c tuy n đ c Yutaka
Akiyama ( i h c Kyoto) l p trình nh m giúp xác đ nh v trí nh n bi t c a các nhân t phiên mã trên vùng promoter c a gen. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SV: Võ Th Ngh a 21 Clustal: Là dãy các phiên b n ph n m n phân tích k t qu thí nghi m v c u trúc c a chu i DNA hay protein, b ng cách so sánh đ ng th i gi a t t c các chu i trình t ,
đ tìm ki m phát hi n ra nh ng đ c đi m đ ng nh t đ c đi m g n g i hay phơn ly gi a chúng.
Andhyb: Ki m tra v trí b t c p c a m i, m u dò vƠ kích th c s n ph m.
IDT (Integrated DNA Technologies): IDT analyzer
(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/): giúp xác đ nh các thông s quan tr ng c a m i nh kích th c, thành ph n GC, nhi t đ lai, kh n ng t o hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer,....
2.1.2. Kh o sát In vitro
2.1.2.1 V t li u
V t li u là 10 m u mô đúc paraffin b nh ph m ung th vú đ c cung c p b i b môn gi i ph u b nh thu c i h c Y D c TP.HCM. 2.1.2.2 D ng c và hóa ch t D ng c và hóa ch t tách chi t Phenol Merck Chloroform Merck SDS 10 % Bio Rad NaCl 5 M Tris HCl 1 M (pH=8)
EDTA 0.5 M (pH=8) Bio Rad
NH4OAc 5 M
Ethanol 100 % Vi t Á Ethanol 70 % Vi t Á
SV: Võ Th Ngh a 22 Proteinase K Fermentas
Máy ly tâm l nh Hettich
D ng c và hóa ch t cho ph n ng MSP
Máy PCR Bio Rad Master mix Bio Rad
M i IDT
N c c t 2 l n
D ng c và hóa ch t đo quang ph
Máy đo quang ph : Bio Rad
N c c t 2 l n
D ng c và hóa ch t đi n di
Máy đi n di BioRad Gel agarose BioRad
TE 1X BioRad
Ethidium Bromide BioRad Loading dye BioRad
SV: Võ Th Ngh a 23
2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Khai thác c s d li u
Ti n hành khai thác d li u trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), s d ng công c Pubmed v i các t khóa epigenetics, DNA methylation, breast cancer, cervical cancer, Prostate cancer nh m thu th p thông tin, d li u bao g m nh ng thông tin t ng quan v t n s methyl hóa c a ung th vú, ung th c t cung, ung th tuy n ti n li t, epigenetics, methyl hóa DNA, thu th p trình t c a gen GSTP1 thông qua mã s accession number NC_000011.10 c a nhi m s c th 11.
2.2.2 Kh o sát in silico
2.2.2.1 Th ng kê t n s methyl hóa
Th ng kê trung bình có tr ng s : Trung bình có tr ng s là giá tr trung bình có ph n ánh t m quan tr ng c a các ph n t (hay giá tr quan sát) trong t p h p đó. M i m t giá tr quan sát s đ c g n m t tr ng s nh m lo i b các y u t có th nh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
h ng đ n k t qu th ng kê nh ph ng pháp ti n hành th c nghi m khác nhau, ngu n g c m u b nh nhân khác nhau, s l ng m u khác nhau hay th i gian khác nhau.
Sau khi đƣ thu th p các s li u v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 trên hai lo i
ung th lƠ ung th vú,ung th c t cung vƠ ung th tuy n ti n li t chúng tôi ti n hành th ng kê trung bình có tr ng s và v bi u đ v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 qua các lo i m u khác nhau (bao g m m u mô đúc parafin, m u huy t thanh, m u máu và m u n c ti u).
SV: Võ Th Ngh a 24 2.2.2.2 Thu nh n trình t gen, xác đ nh c u trúc gen và đ o CpG
Trong ti n trình kh o sát in silico, b c đ u tiên chúng tôi ti n hành thu nh n trình t gen GSTP1 t ngân hàng gen b ng mã s truy c p là NC_000011.10 k t h p v i ch ng trình Ensemble đ l y đúng trình t vùng promoter c a gen GSTP1.
Sau đó chúng tôi ti n hƠnh xác đ nh các vùng ch c n ng quan tr ng c a gen nh :
promoter, 5’UTR, exon 1, v trí g n c a các nhân t phiên mã b ng ch ng trình
TFsearch, xác đ nh các đ o CpG b ng Methprimer. 2.2.2.3 ánh giá m i
i v i đo n m i cho ph n ng MS-PCR chúng tôi đƣ tham kh o t m t s bài báo th c nghi m trên ngân hàng d li u NCBI c ng nh k th a m i methyl và