khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của các gene brca1, p16ink4a, rassfia, cyclin d2 và gstp1 trên các bệnh nhân bị ung thư vú

 Y BAN NHÂN DÂN TP. HCM  GIÁO DC & ÀO TO  KHOA HC VÀ CÔNG NGH I HC M TP. HCM BÁO CÁO NGHIM THU KHO SÁT MC  METHYL HÓA TI CÁC O CpG THUC VÙNG PROMOTER CA CÁC GEN BRCA1, p16 INK4 , RASSF1A, CYCLIN D2 VÀ GSTP1 TRÊN CÁC BNH NHÂN B UNG TH VÚ Ch nhim  tài: PGS.TS. Lê Huyn Ái Thúy TS.BS. oàn Th Phng Tho THÀNH PH H CHÍ MINH THÁNG 1/2014 i C LC Trang Tóm tt ni dung nghiên cu ii Danh sách các ch vit tt iii Danh sách bng iv Danh sách hình v ng quyt toán vii ng d trù kinh phí giai n II viii Phn mu 1 Phn báo cáo 7 t vn  8 I. Tng quan 9 1.1. Tng quan v epigenetics 10 1.2. Tng quan v các gen RASSF1A, BRCA1, cyclin D2, GSTP1 và p16 INK4a 14 1.2.1. Gen RASSF1A 14 1.2.2. Gen BRCA1 16 1.2.3. Gen cyclin D2 19 1.2.4. Gen GSTP1 21 1.2.5. Gen p16 INK4a 23 1.3. Các phng pháp phát hin s methyl hóa DNA 35 1.3.1. Phng pháp Methylation - Specific PCR (MSP) 36 1 .3.2. Phng pháp Q - MSP 36 1.3.3. Phng pháp BSP 37 II. Ni dung và phng pháp 38 III. Kt qu và tho lun 54 3.1. Ni dung 1 - Ly mu nghiên cu 55 3.2. Ni dung 2 - Kho sát các c m mô bnh hc 55 3.3. Ni dung 3 - Thc hin k thut hoá mô min dch vi hai th th p53 và HER2/ neu 57 3.4. Ni dung 4- Kho sát in silico các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1 , p16 INK4a , RASSF1A , cyclin D2 và GSTP1 58 3.5. Ni dung 5 - Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng Methylation-specific-PCR 71 3.6. Ni dung 6 - Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gii trình t  sn phm Methylation - specific - PCR 82 3.7. Ni dung 7 – X lý s liu 83 IV. K t lun v à   ngh 99 ii TÓM TT NI DUNG NGHIÊN CU Ung th vú là mt cn bnh ph bin và là nguyên nhân gây cht hàng u  ph  mc bnh này trên th gii. Bnh vn ang có xu hng gia tng trên th gii, c bit là  các nc ang phát trin trong ó có Vit Nam. Nghiên cu s dng k thut Methylation-specific PCR (MSP)  kho sát mc  methyl hóa trên 200 mu mô nh c sinh thit t các bnh nhân ung th vú và 20 mu mô vú lành tính thu thp  bnh vin i hc Y Dc thành ph H Chí Minh. Các gen BRCA1 (gen sa cha DNA), p16 INK4a và Cyclin D2 (nhóm gen u hòa chu trình t bào), GSTP1 (gen gii c), và RASSF1A (gen è nén u) c chn  kim tra tn s methyl hóa. t qu cho thy t l methyl hóa ca các gen BRCA1 là cao nht chim 85%. Tip theo là các gen Cyclin D2, p16 INK4a , GSTP1 và RASSF1A có t l methyl hóa ln t 57.5, 48.5, 46.5 và 40%. Tính cht methyl hóa trên nm gen kho sát u là c m c trng ca bnh ung th vú, và c ánh giá là làm tng nguy c dn n nh. Kh nng phát hin s methyl hóa trong mu bnh ngi Vit Nam là rt cao khi sàng lc cùng mt lúc nm gen bi  bao pht 100% trên s mu kho sát. SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Breast cancer is the common cause of death among women in most countries worldwide, with rapidly increases in the developing countries, including Vietnam. The best opportunity for improving the survival is thought to be had an early detection through the promising biomarker: DNA hypermethylation. In present study, with the aim towards using the hypermethylation at CpG islands of promoter of candidate genes as the biomarker for Vietnamese population, sensitive methyl specific PCR (MSP) was carried out to analyze the hypermethylation status of the panel of five genes including BRCA1, p16 INK4 , GSTP1, RASSF1A and Cyclin D2 in 220 samples including 200 breast cancer specimens and 20 normal breast tissues from another disease (not breast cancer) which were obtained Ho Chi Minh City Medical Hospital, Vietnam. The results indicated that the hypermethylation of one or more genes occurred in all total of 200 tumor specimens (100% diagnostic coverage), considered to be a specific characteristic of Vietnamese breast cancer patients, with the frequencies for methylation of each genes were 85, 57.5, 48.5, 46.5 and 40% for BRCA1, p16 INK4 , GSTP1, RASSF1A and CyclinD2 gene, respectively. iii DANH SÁCH CÁC CH VIT TT 5’UTR 5‘ Untranslated Region 3’UTR 3‘ Untranslated Region A Adenine bp Base pair BRCA1 Breast cancer susceptibility 1 C Cytosine CDKN2A Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A DNA Deoxyribonucleic acid DNMT DNA methyltransferase dNTP Deoxynucleoside triphosphate G Guanine GSTP1 Glutathione S-transferase Pi-1 IDT Integrated DNA Technology (công ty IDT) M Methylated mRNA messenger Ribonucleic acid MSP Methylation specific PCR NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction RASSF1A Ras association domain family 1 isoform A T Thymine Taq Thermus aquaticus Tm Melting temperature U Unmethylated UV Ultraviolet iv DANH SÁCH BNG Trang ng 1.1. Danh sách chn lc các biomarker tim nng cho ung th 13 B ng 1.2. Khái quát các nghi ên c u v nm gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và p16 INK4a 25 ng 2.1. Phân  mô bnh hc 40 ng 2.2. Quy trình nhum HMMD trên máy BenchMark XT 42 B ng 2.3. Thông s cp mi bt tr ên gen BRCA1 47 B ng 2.4. Th ành ph n phn ng PCR 47 ng 2.5. Chu kì nhit ca phn ng PCR 47 B ng 2.6. Chu tr ình nhi t  bin i bisulfite ca Epitech bisulfite Kit 48 B ng 2.7. Th ành p h n phn ng Q - MSP 49 ng 2.8. Chu trình nhit phn ng Q-MSP 50 ng 2.9. Chu kì nhit ca phn ng MSP 50 B ng 2.10. Din gii ý ngha ca t sut ch ênh (odd ratio – OR) và nguy c tng  i (Relative risk – RR)* 53 ng 3.1. Giai n ung th vú 56 B ng 3.2. Phân loi mô hc 56 ng 3.3. Phân  mô hc 57 B ng 3.4. T ình tr ng HER2/new 58 ng 3.5. Tình trng p53 58 B ng 3.6. Tr ình t  mi v à các thông s  vt lý 69 B ng 3.7. Nng  v à ch t l  ng DNA tách chit 72 ng 3.8. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca các gen vi ung th vú 83 ng 3.9. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen BRCA1 v i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú 84 ng 3.10. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen Cyclin D2 i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú 85 ng 3.11. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen GSTP1 i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú 86 ng 3.12. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen p16 INK4  v i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú 87 ng 3.13. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen RASSF1A i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú 88 ng 3.14. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen BRCA1 v i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính 90 ng 3.15. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen Cyclin D2 i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính 91 B ng 3.16. Mi t ng quan gi a  l methyl hóa ti vùng promoter ca gen p16 INK4  v i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính 92 ng 3.17. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen GSTP1 i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính 93 ng 3.18. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen RASSF1A i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính 94 ng 3.19. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen BRCA1 i ung th vú 94 ng 3.20. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen Cyclin D2 i ung th vú 95 ng 3.21. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen GSTP1 i ung th vú 96 v ng 3.22. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen p16 INK4a i ung th vú 96 B ng 3.22. Mc  li ên quan gi a tính cht methyl hóa ti v ùng promoter  gen RASSF1A 97 ng 3.24. Các mu có ln lt không, mt, hai, ba, bn gen b methyl hóa trong b mu nh phm ung vú 42 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1.  b sung nhóm – CH 3 vào v trí 5’ ca cytosine nh DNMTs 10 Hình 1.2. Tóm tt vai trò sinh hc ca RASSF1A 15 Hình 1. 3. Các vùng ch c nng c a BRCA1 17 Hình 1.4.  phosphoyl hóa Rb gii phóng E2F 20 Hình 1.5. Tn s methyl hóa ca nm gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và p16 INK4a trong ung th vú. 26 Hình 1.6: Tn s methyl hóa ca nm gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và p16 INK4a trong t bào bình thng 27 Hình 1.7: Tn s methyl hóa trung bình có trng s ca các gen RASSF1A, GSTP1, BRCA1, cyclin D2 và p16 INK4a trong ung th vú nói chung và phân chia theo các giai n bnh 29 Hình 1.8. X  lý sodium bisulfite v à s  chuy n  i cytosine th ành ur 36 Hình 3.1. Hình nh vi th các loi carcinôm xâm ln 55 Hình 3.2. Hình nh biu hin th th HER2/neu 57 Hình 3.3. Hình nh p53 58 Hình 3.4. nh v gen RASSF1A trên nhim sc th s 3 59 Hình 3.5. u trúc gen RASSF1A 59 Hình 3.6. Trình t gen RASSF1A và s phân b ca mt s nhân t phiên mã 60 Hình 3.7. nh v gen BRCA1 trên nhim sc th s 17 60 Hì nh 3 . 8. u tr ú c gen BRCA 1 61 Hình 3.9. Trình t gen BRCA1 và s phân b ca mt s nhân t phiên mã 61 Hình 3.10. nh v gen Cyclin D2 trên nhim sc th s 12 62 Hình 3.11. u tr ú c gen Cyclin D2 62 Hình 3.12. Trình t gen Cyclin D2 và s phân b ca mt s nhân t phiên mã 63 Hình 3.13. nh v gen GSTP1 trên nhim sc th s 11 63 Hình 3.14. u trúc gen GSTP1 64 Hình 3.15. Trình t gen GSTP1 và s phân b ca mt s nhân t phiên mã 64 Hình 3.16. nh v gen p16 INK4a trên nhim sc th s 9 65 Hình 3.17. u trúc gen p16 INK4a 65 Hình 3.18. Trình t  gen p16 INK4a và s phân b ca mt s nhân t phiên mã 66 Hình 3.19: t qu kim tra c hiu mi methyl/BRCA1 (WT3) bng Methblast 68 Hình 3.20a.   th biu din k t qu kho sát mi methyl WT7, c tr ng cho gen GSTP1 trên DNA chng 74 Hình 3.20b.  th biu din kt qu phân tích nhit  nóng chy ca sn phm MSP gia mi methyl WT7 và DNA chng 75 Hình 3.21a.   th biu din kt qu kho sát mi unmethyl WT8, c tr ng cho gen GSTP1 trên DNA chng 75 Hình 3.21b.  th biu din kt qu phân tích nhit  nóng chy ca sn phm MSP gia mi unmethyl WT8 và DNA chng 76 Hình 3.22. Kt qun di sn phm MSP nhm kho sát nhit  lai ti u ca cp mi 77 vi WT9 Hình 3.23. K t qun di sn phm MSP vi các cp mi methyl c hiu cho các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 trên 27 mu bnh phm ung th vú 78 Hình 3.24. t qu gii trình t sn phm MSP gen RASSF1A 79 Hình 3.25. Kt qun di sn phm MSP gen BRCA1 80 Hình 3.26. Kt qu gii trình t sn phm MSP gen BRCA 82 vii NG QUYT TOÁN  tài: Kho sát mc  methyl hóa ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và p16 INK4a trên các bnh nhân b ung th vú Ch nhim: TS. Lê Huyn Ái Thúy & ThS. BS. oàn Th Phng Tho  quan ch trì:H. M TP. HCM Thi gian ng ký trong hp ng: 24 tháng (t tháng 12/20120 n tháng 12/2012) Thi gian thc hin giai n I: t tháng 12/2010 n tháng 12/2011 ng kinh phí c duyt: 600.000.000 VN Kinh phí cp giai n I: 350.000.000 VN theo TB s: 233/H-SKHCN ngày 07/12/2010 VT:1000 TT i dung Kinh phí nm 2011 Trong ó Ngân sách Ngun khác I Kinh phí cp trong nm: 350.000 350.000 II Kinh phí quyt toán trong nm 350.000 350.000 1. Công cht xám 24.000 24.000 2. Công thuê khoán 90.488,065 90.488,065 3. Nguyên, nhiên vt liu, dng c, ph tùng, VPP,… 206.539, 935 206.539, 935 4. Thit b 0 0 5. Xét duyt, giám nh, nghim thu 5.281 5.281 6. i ngh, hi tho 5.691 5.691 7. ánh máy tài liu 0 0 8. Giao thông liên lc 0 9. Chi phí u hành 18.000 18.000 III Tit kim 5% 0 0 IV Kinh phí np tr ngân sách viii NG S DNG KINH PHÍ GIAI N II TT i dung Kinh phí nm 2011 Trong ó Ngân sách Ngun khác I Kinh phí cp trong nm th II: 190.000 190.000 II Kinh phí quyt toán trong nm II 190.000 190.000 1. Công cht xám 12.000 12.000 2. Công thuê khoán 80.000 80.000 3. Nguyên, nhiên vt liu, dng c, ph tùng, VPP,… 83.000 83.000 4. Thit b 0 0 5. Xét duyt, giám nh, nghim thu 0 0 6. i ngh, hi tho 0 0 7. ánh máy tài liu 0 0 8. Giao thông liên lc 0 9. Chi phí u hành 15.000 15.000 III Tit kim 5% 0 0 IV Kinh phí np tr ngân sách 1 PHN MU 1. Tên  tài: Kho sát mc  methyl hóa ti các o cpg thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4 , RASSF1A, CYCLIN D2 và GSTP1 trên các bnh nhân b ung th vú Ch nhim  tài: PGS.TS. Lê Huyn Ái Thúy & TS. BS. oàn Th Phng Tho  quan ch trì: H. M TP. HCM Thi gian thc hin: 24 tháng (t tháng 12/2010 n tháng 6/2013) Kinh phí c duyt: 600.000.000 VN Kinh phí ã cp: 540.000.000 VN theo TB s: 233/H-SKHCN ngày 07/12/2010 2. c tiêu: Tìm hiu s methyl hóa ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4A , RASSF1A, cyclin D 2 và GSTP1 trên các bnh nhân b ung th vú  ngi Vit Nam nhm ánh giá tiên liu, xác nh phng pháp u tr. 3. i dung: - Ly mu nghiên cu, thu thp d liu v các c m: tui, gii tính - Kho sát các c m mô bnh hc: kích thc, v trí u, mô vú xâm ln và mô vú ung th ti ch, hóa mô min dch - Kho sát in silico các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1, nhn din các o có th xem là “hot-spot”, nhn din vùng trình t thit k mi - Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng PCR bao gm: + Thit lp quy trình tách chit DNA thích hp t sinh thit mô + Thit lp quy trình x lý DNA bng sodium bisulfite + Thit lp quy trình tinh sch DNA sau x lý sodium bisulfite + Thit lp quy trình methylation-specific PCR (MSP) nhm phát hin s methyl hóa ti vùng promoter trên các gen này + Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng MSP [...]... hi n s methyl hóa t i ã xây d ng thành công quy trình o CpG vùng promoter trên các MSP nh m phát hi n s methyl hóa gen BRCA1, p16 INK4a, RASSF1A, cyclin D2 i o CpG vùng promoter trên các gen BRCA1, và GSTP1 p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - D li u methyl hóa t i vùng promoter trên - ã có d li u methyl hóa t i vùng các gen BRCA1, p16 INK4a, RASSF1A, cyclin promoter D2 và GSTP1 trên các gen BRCA1,. .. nh n trình t các vùng promoter và/ ho c exon 1 c a các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - o CpG thu c vùng promoter và/ ho c - ã thu nh n o CpG thu c vùng exon 1 c a các gen BRCA1, p16INK4a, promoter và/ ho c exon 1 c a các gen RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - Các b m i cho Methylation-specific- - ã thi t k và ánh giá các b m i 3 PCR và gi i trình... p53 và HER2 ã ánh giá bi u hi n c a p53 và trên 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm HER2 trên 200 m u carcinôm n và 18 m u mô vú lành tính ng tuy n vú xâm l n và và 20 m u mô vú lành tính i dung 4: Kh o sát in silico các o CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - Trình t các vùng promoter và/ ho c exon 1 c a các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1. .. carcinôm ng p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và tuy n vú xâm l n và 20 m u mô vú lành GSTP1 a 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và 200 m u mô vú tính lành tính i dung 6: Kh o sát c a các gen BRCA1, p16 m methyl hoá t i các INK4a o CpG thu c vùng promoter , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 b ng gi i trình t n ph m Methylation-specific-PCR - D li u methyl hóa t i vùng promoter trên - ã có các gen BRCA1, p16... RASSF1A, cyclin promoter D2 và GSTP1 a 20 m u d li u methyl hóa t i vùng trên các gen BRCA1, i di n cho p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và carcinôm ng tuy n vú xâm l n và mô vú GSTP1 a 20 m u i di n cho 4 lành tính carcinôm ng tuy n vú xâm l n và mô vú lành tính i dung 7: X lý s li u Xác ng quan gi a tình - ã hoàn t t nh t l , m i t tr ng methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1, p16INK4a,. .. bisulfite - Quy trình MSP nh m phát hi n s methyl hóa t i các o CpG vùng promoter trên các gen p16 INK4a, BRCA1, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 4 D li u methyl Có x lý th ng kê, rõ ràng, áng 1 b hóa t i các CpG o tin c y d li u × (1 b d li u) thu c vùng promoter a các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 a 200 u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và 20 u mô vú lành tính 5 Báo cáo phân Xác tích m i... t lo i u ch ng sinh h c cho ung th nói chung và ung th vú nói riêng Nghiên c u này vì v y c th c hi n nh m tìm hi u s methyl hóa t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1, p16INK4A, RASSF1A, CYCLIN D2 và GSTP1 trên các b nh nhân b ung th vú nh m xác nh ph ng pháp u tr b nh ng i Vi t Nam ánh giá, tiên li u, 9 PH N I – T NG QUAN 1.1 T ng quan v epigenetics: 10 Epigenetics c không liên quan nh... u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và và 20 m u mô vú lành tính i dung 2: Kh o sát các Thu th p s li u v các nh c b n và c c m mô b nh h c c m m gi i ph u i th ã thu th p s li u v các trên 200 gi i ph u b nh c b n và u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và 20 th u mô vú lành tính c c m m i trên 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và và 20 m u mô vú lành tính i dung 3: Th c hi n k thu t hoá mô mi n d ch ánh... trong ung th : 16 Các ho t ng methyl hóa b t th ng t i các o CpG thu c vùng promoter óng vai trò ch y u trong vi c làm m t i ch c n ng sinh h c c nén u và hi n t ng này i v i gen RASSF1A ã nh c a các gen è c ch ng minh khá rõ Hi n ng m t bi u hi n c a gen RASSF1A do s methyl hóa quá m c vùng promoter ã c phát hi n trong nhi u lo i ung th nh : ung th vú, ung th c t cung, ung th ph i, ung th u và c , ung. ..2 - Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gi i trình t s n ph m methylation-specific PCR - X lý s li u 3.1 Nh ng n i dung th c hi n ( i chi u v i ph l c 1 - h p Công vi c d ki n ng ã ký): Công vi c ã th c hi n i dung 1: L y m u nghiên c u Thu th p c 200 m u carcinôm ng ã thu th p tuy n vú xâm l n và 20 m u mô vú lành tính . methyl hóa ti o CpG vùng promoter trên các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - D liu methyl hóa ti vùng promoter trên các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1. RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - Trình t các vùng promoter và/ hoc exon 1 ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 - o CpG thuc vùng promoter và/ hoc exon 1 ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A,. RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng MSP 2 - Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16 INK4a , RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gii trình t sn phm methylation-specific