- Lamen Nhu m:
c Nhi t( oC) Thi gian Chu kì
1 95 3 phút 1
2 95 30 giây 40
X 30 giây
72 30 giây
3 72 6 phút 1
- Thi t b , hóa ch t
- Agarose ... Bio Rad
- TE 1X... Bio Rad
- Ethidium bromide ... Bio Rad
- Máy n di ... Bio Rad - Ph ng pháp ti n hành
Trong m i gi ng c a b n gel, n p vào m t h n h p g m 7 l s n ph m MSP ho c PCR và 3 l dung d ch n p m u. Thang chu n n p 5 l. n di 15 phút hi u n th 80V. K t thúc quá trình n di, b n gel c a lên bàn èn UV và ch p hình k t qu
2.5.3. S n ph m c n t:
- Quy trình tách chi t DNA thích h p t sinh thi t mô - Quy trình x lý DNA b ng sodium bisulfite
- Quy trình tinh s ch DNA sau x lý sodium bisulfite
- Quy trình MSP nh m phát hi n s methyl hóa t i o CpG vùng promoter trên các gen BRCA1,p16INK4a,RASSF1A,cyclin D2 và GSTP1
- D li u methyl hóa t i vùng promoter trên các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A,
cyclin D2 và GSTP1 a 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và 20 m u mô lành tính
2.6. N i dung 6 - Kh o sát c m methyl hoá t i các o CpG thu c
vùng promoter c a các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và
GSTP1 ng gi i trình t s n ph m Methylation-specific-PCR
2.6.1. Mô t n i dung:Ti n hành gi i trình t m t s s n ph m MSP nh m ki m tratính c hi u c a s n ph m, ng th i ánh giá hi u su t c a các quá trình bi n i tính c hi u c a s n ph m, ng th i ánh giá hi u su t c a các quá trình bi n i DNA b ng sodium bisulfite
2.6.2. Ph ng pháp nghiên c u:
- Chúng tôi ti n hành g i gi i trình t 10 m u s n ph m MSP theo hai giai n: giai n th nghi m xây d ng quy trình (2 m u) và giai n th nghi m quy trình trên nh ph m (8 m u).
- D li u methyl hóa t i vùng promoter trên các gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A,
cyclin D2 và GSTP1 a 10 m u i di n cho carcinôm ng tuy n vú xâm l n và mô vú lành tính
2.7. N i dung 7 – X lý s li u
2.7.1. Mô t n i dung: Ti n hành x lý th ng kê s li u th c nghi m thu nh n c hai kh i d li u: tính ch t methyl hóa (trên hai nhóm m u b nh ung th và nhóm hai kh i d li u: tính ch t methyl hóa (trên hai nhóm m u b nh ung th và nhóm lành), các c m tu i b nh nhân, mô b nh h c, hóa mô mi n d ch, ch s bao ph (c a tính ch t methyl) tính trên 5 gen kh o sát
2.7.2. Ph ng pháp nghiên c u:
- Nh p và x lý s li u b ng ph n m m Medcalc for Windows phiên b n 11.3.1.0 (updated 8/2010) [145]. T t c các phép ki m là 2 phía. Giá tr p < 0.05 c xem là có ý ngh a th ng kê.
Th ng kê mô t :
- Tính t l , t n s i v i các bi n s nh tính.
- Tính trung bình, l ch chu n (SD) i v i các bi n s nh l ng. Khi bi n s nh l ng phân ph i không chu n tính trung v , và kho ng t phân (IQR).
Th ng kê phân tích:
- Phép ki m 2 c dùng ki m nh m i liên quan gi a các bi n s nh tính, khi phép ki m 2 không phù h p, thay th b ng phép ki m likelihood ratio.
- Phép ki m t và one-way ANOVA c dùng so sánh các bi n s nh l ng. Khi các phép ki m trên không phù h p, thay th b ng phép ki m Mann – Whitney và Kruskal –Wallis.
Th ng kê so sánh:
- Phép ki m di n t m c m nh c a các m i liên quan: s d ng t su t chênh và nguy c t ng i.
- T su t chênh (Odd ratio – OR) o l ng m i liên quan gi a hai bi n nh phân có cân nh c t i m c m nh y u c a m i liên quan ó. Trong nghiên c u này, t su t chênh c dùng ánh giá m i liên quan gi a tính ch t methyl hóa và b nh ung th vú.
- Nguy c t ng i (Relative risk – RR) o l ng m i liên quan gi a hai bi n nh phân có cân nh c t i m c m nh y u c a m i liên quan ó. Trong nghiên c u này,
nguy c t ng i c dùng ánh giá m nh c a m i liên quan gi a tính ch t methyl hóa và b nh ung th vú.
ng 2.10. Di n gi i ý ngh a c a t su t chênh (odd ratio – OR) và nguy c t ng i (Relative risk – RR)* OR Di n gi i RR Di n gi i OR>1 Kh n ng m c b nh (ung th vú) cao h n kh n ng không m c b nh RR>1 Tính ch t methyl hóa (b t th ng) làm t ng kh n ng m c b nh (ung th vú) OR=1 Kh n ng m c b nh (ung th vú) b ng kh n ng không m c b nh
RR=1 Không có m i liên h nào gi a tính ch t methyl hóa (b t th ng) và kh n ng m c b nh (ung th vú) OR<1 Kh n ng m c b nh th p n kh n ng không m c nh RR<1 Tính ch t methyl hóa (b t th ng) làm gi m kh n ng m c b nh (ung th vú)
*Ghi chú: n u p>0.05, s liên quan không có ý ngh a th ng kê (dù OR và RR l n hay nh ).
2.7.3. S n ph m c n t:
- Xác nh t l , m i t ng quan gi a tình tr ng methyl hoá t i các o CpG thu c vùng promoter c a các gen BRCA1,p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 và các c m gi i ph u b nh, hóa mô mi n d ch (HER2 và p53) trên 200 m u carcinôm ng tuy n vú xâm l n và 20 m u mô vú lành tính