1.2.3.1. C u trúc và ch c n ng:
Cyclin D2 thu c nhóm cyclin lo i D tham gia vào chu trình t bào, gencyclin D2
m trong vùng 12p13 trên nhi m s c th s 12 c a b gen ng i [69].Cyclin D2 còn c g i v i nhi u tên khác nh KIAK0002, MGC102758. Cyclin D2 dài kho ng 31000 bp bao g m vùng promoter dài kho ng 1600 bp, vùng 5’, 3’ không d ch mã, 5 exon và 4 intron. Phân t mRNA do cyclin D2 phiên mã có kích th c 6.5 kb và nó
ch mã cho m t phân t protein dài 289 amino acid [70].
Chu trình t bào tr i qua 4 giai n G1, S, G2,M; chuy n t giai n G1 sang S t bào ph i tr i qua m gi i h n G0 g n cu i pha G1, t i m t i h n này di n ra s ki m tra quan tr ng nh t trong chu trình t bào [71]. Nhóm cyclin lo i D m 3 gencyclin D1, D2, D3 tham gia vào vi c u hòa chu trình t bào. Trong chu trình t bào, cyclin D là lo i cyclin u tiên c t o ra khi t bào c kích thích chuy n t giai n G0 sang pha S. Cyclin D không dao ng trong su t chu trình t bào nh các lo i cyclin khác, m c bi u hi n c a chúng b ki m soát b i các nhân
t ng tr ng. Cyclin D b t u tích t nhi u d n gi a giai n G1, trong khi
cyclin E xu t hi n sau ó ngay tr c khi quá trình chuy n i t giai n G1 sang giai n S [72].
Cyclin D liên k t v i enzyme kinase ph thu c protein cyclin (CDKs - cyclin dependent kinases) t o thành ph c h p cyclin D/CDKs, ph c h p này óng m t vai
trò quan tr ng trong u hòa chu trình t bào, quá trình bi t hóa [73]. Không có s phân bi t rõ ràng vai trò c a các cyclin D1, D2, D3 trong ph c h p này [74]. Ph c
p cyclin D/CDKs u hòa chu trình t bào b ng cách gây phosphoryl hóa. Cyclin D k t h p v i CDK4 (cyclin dependent kinase 4) ho c CDK6 (cyclin dependent kinase 6) t o thành ph c h p cyclin D/CDK4, cyclin D/CDK6. Các ph c h p này s tác ng vào protein Rb (retinoblastoma protein) và các protein liên quan v i p107, p130 gây phosphoryl hóa [74]. Khi b phosphoryl hóa, protein Rb b b t ho t không liên k t v i nhân t phiên mã E2F, khi ó E2F c gi i phóng t do. E2F t do s
u hòa kích ho t các gen mã hóa cho các protein tham gia vào ti n trình t bào, ho t ng trao i ch t và t ng h p DNA. Nhân t phiên mã E2F còn có ho t tính kích ho t s phiên mã c a gen t o ra E2F và cyclin E. Cyclin E c t o thành liên k t v i CDK2 t o ph c h p cyclin E/CDK2, ph c h p này s t ng c ng s phosphoryl hóa Rb [75] (Hình 1.4).
Ph c h p cyclin D/CDKs c hình thành n m t l ng nh t nh thì t bào t giai n G0 và chuy n sang pha S. Trong u ki n t bào ch a chu n b s n sàng cho m t chu trình m i, ch ng h n do môi tr ng thi u dinh d ng hay DNA b sai h ng ch a c s a ch a thì m t s protein c ch c ho t hóa phá h y ph c h cyclin D/CDKs. n th i m này, chu trình t bào di n ra không còn ph thu c vào ho t tính c a ph c h p cyclin D/CDK4 ho c cyclin D/CDK6, b i vì cùng
i ti n trình các nhân t t ng tr ng không t ng thêm thì m c bi u hi n c a cyclin D c ng gi m i và khi ó t bào v t m gi i h n G0 i vào pha S [76, 77].
Hình 1.4. S phosphoyl hóa Rb gi i phóng E2F
1.2.3.2. S methyl hóa c a cyclin D2 trong ung th :
m t bi u hi n c a gen cyclin D2 do methyl hóa quá m c vùng promoter ch c tìm th y trong t bào kh i u c a b nh nhân ung th vú [78]. Theo nghiên
u c a Fackler và c ng s vào n m 2003, t n s methyl hóa c a gen cyclin D2 i i ung th bi u mô xâm l n (ILC-invasive lobular carcinoma) là 32% và ung th ng n s a xâm l n (IDC- invasive ductal carcinoma) là 52%. T n s methyl hóa c a
cyclin D2 i v i lo i ung th vú t i ch là 23% trong tr ng h p ung th bi u mô t i ch (LCIS- lobular carcinomas in situ); 29% cho giai n m t, 25% cho giai n hai và 39% cho giai n ba c a tr ng h p ung th ng d n s a t i ch (DCIS- ductal carcinomas in situ) [79]. Theo các th ng kê c a nghiên c u này thì t n s methyl hóa c acyclin D2 trong ung th vú tuy không cao nh ng ch xu t hi n r t c tr ng cho ung th vú.
1.2.4. Gen GSTP1:
1.2.4.1. C u trúc và ch c n ng:
GSTP1 (Glutathione S-transferase Pi-1) n m trên vùng 11q13 c a nhi m s c th 11.GSTP1 có kích th c 3059 bp thu c chu i ng n trên vùng nhi m s c th này.
GSTP1 có 7 exon và 6 intron, phiên mã t o phân t mRNA có kích th c 986 bp và ch mã cho phân t protein có 210 amino acid [80].
GSTP1 là gen mã hóa cho enzyme Glutathione S-transferase P ng i. Enzyme này thu c nhóm Glutathione S-transferases (GSTs), là m t h g m các enzyme óng vai trò quan tr ng trong quá trình xúc tác cho các ph n ng oxy hóa kh x y ra trong bào b ng cách chuy n tác nhân glutathione (GSH) t i các ph c h p ái n t , bao m các tác nhân gây ung th (carcinogens) và m t s thu c ngo i sinh (exogenous drugs) khác ào th i chúng i [81, 82]. D a trên các tính ch t sinh lý, sinh hóa, mi n d ch c ng nh c u trúc c a cácGSTs, có th phân chia nhóm enzyme này thành 4 nhóm: theta, pi, mu và alpha. Trong s các d ng này, vai trò c a gen glutathione S- transferase pi (GSTP1) i v i b nh ung th ã c nghiên c u trong th i gian g n ây [83]. S bi u hi n c a GSTP1 có liên quan n vi c u hòa quá trình t ng sinh bào và quá trình apoptosis, thông qua vi c liên k t tr c ti p c a nó v i enzyme c- Jun N-terminal kinase (JNK) t o ph c h p GSTP1/JNK. Trong ph c h p này, GSTP1 có th c ch JNK d n n k t qu trong quá trình kh c, GSTP1 xu t hi n nh m t ch t áp ng liên quan n vi c t o áp l c t bào (áp l c oxy hóa bên trong và/ho c bên ngoài t bào), ng th i ki m soát chu trình t bào [84, 85].
Vai trò c a GSTP1 trong vi c u hòa hi n t ng apoptosis ã c mô t trong nhi u nghiên c u. D i các u ki n không b áp l c, GSTP1 c ch các n phân JNK thông qua vi c thành l p c a m t ph c h p protein [86]. S ti p xúc v i các áp c oxy hóa gây ra quá trình phân ly c a GSTP1 t JNK và hình thành chu i trình t con c a các h p ch t c ng hóa tr nh trùng h p. D i các u ki n này, ho t ng
y c a JNK c gi b i chính JNK d n n ho t ng c a c-jun thông qua hi n ng phosphoryl hóa t i v trí Ser-63 ho c Ser-73 và t ng c ng ho t ng phiên mã a các gen áp ng AP-1. Các k t qu này có vai trò trong vi c kích ho t các con ng phát tín hi u cho áp ng áp l c, t ng sinh và apoptosis [86, 87, 88]. Thêm vào ó, nó còn tái ho t ng hình thái c a phân t oxy-các tác nhân kích ho t phiên mã a GSTP1 thông qua các c ch t kích ho t phiên mã JNK, bao g m c-Jun, quá trình ng h p m i c a GSTP1 x y ra, quá trình này ti p t c kìm hãm JNK. Th t v y, s c ch c a GSTP1 d n n t ng c ng các ho t ng c a JNK. Vì v y, GSTP1 nh ng n các con ng phát tín hi u cho apoptosis b ng vi c u ch nh các ho t ng c a enzyme kinase JNK [83].
1.2.4.2. S methyl hóa c a GSTP1 trong ung th :
methyl hóa c aGSTP1 th ng ít xu t hi n trong các t bào bình th ng, mà ch xu t hi n trong các t bào b ung th [78]. M t s bi n i trên GSTP1 nh s methyl hóa quá m c các o CpG thu c vùng promoter có th làm ng n ch n s liên
t v i các y u t phiên mã, làm cho enzyme RNA polymerase II không còn kh n ng ng tác v i vùng promoter d n n c ch quá trình phiên mã. u này làm gián n ho c d ng c ch s a ch a DNA, khi ó nh ng t n th ng DNA c tích l y i d n d n hình thành ung th . Do ó n u quá trình phiên mã b c ch , t bào s ti p c i vào quá trình sao chép DNA và phân bào b t k mang theo các t bi n và sai ng DNA. Các t bi n và sai h ng DNA s ti p t c c tích l y qua m i chu trình bào và n m t lúc nào ó t bào không còn ki m soát c ho t ng phân bào
a và chuy n sang tr ng thái ung th [89]. ng th i, khi b methyl hóa, GSTP1
t kh n ng c ch JNK, làm gián n quá trình kh c và t ng nguy c d n t i ung th (ví d kh các ch t thu c nhóm xenobiotic và các ch t hóa tr li u…). Hi n nay, trên th gi i có nhi u công trình nghiên c u v các lo i thu c gi i methyl hóa
a h n là m t d u ch ng sinh h c ti m n ng trong ch n oán, nh h ng khuynh ng tr li u c ng nh ánh giá hi u qu u tr trong ung th nói chung và ung th vú nói riêng [5, 83, 84, 89, 90].
1.2.5. Gen p16INK4a:
1.2.5.1. C u trúc và ch c n ng:
GenCDKN2A (Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) n m trên vùng 9p12 c a nhi m s c th s 9 thu c b gen ng i, mã hóa cho hai protein p16 (p16INK4a) có tr ng ng phân t 16 kDa, và p14 (p14ARF) [91]. Trong ó, gen p16INK4acó ba exon 1 , 2 và 3, óng vai trò chính trong các con ng u hòa chu trình t bào v i ch c n ng u hòa âm tính chu trình t bào thông qua s c ch các CDK (cyclin dependent kinase) t ng tác v i cyclin D1 [91]. S bi u hi n c a genp16INK4aliên quan t i quá trình lão hóa c a t bào, khi càng l n tu i thì n ng c a p16INK4a càng cao. p16INK4a
có kh n ng chi ph i quá trình lão hóa b ng gi i h n s t làm m i c a các t bào có kh n ng nhân ôi.
CDK và cyclin là hai nhóm protein có vai trò quan tr ng t i các m ki m soát chu trình t bào [92]. Khi không có m t p16INK4a, CDK cùng cyclin t o ph c h p cyclin/CDK th c hi n quá trình phosphoryl hóa pRb (protein Retinoblastoma). Bình th ng, pRb không b phosphoryl hóa s liên k t v i nhân t phiên mã E2F [93]. Khi phosphoryl hóa, pRb s m t liên k t v i E2F, E2F c t do s kích ho t các gen sao chép DNA thúc y chu trình t bào i qua m ki m soát G1/S. Tuy nhiên, khi qua m ki m soát này n u phát hi n DNA h h ng, chu trình t bào s t m d ng
a ch a DNA. Quá trình t m ng ng này c th c ki n nh s t ng tác c a
p16INK4a v i các thành ph n CDK4/CDK6 c n tr s t o thành ph c h p cyclin/CDK,
n t i c ch quá trình phosphoryl hóa c a pRb và không tách r i E2F, quá trình sao chép DNA không di n ra, chu trình t bào ng ng l i t i m ki m soát G1/S, lúc này các gen ch u trách nhi m s a ch a DNA h h ng s làm vi c [94, 95]. Nh v y, khi
p16INK4a b b t ho t s làm cho chu trình t bào b xáo tr n, các t bào sao chép không ki m soát n m t lúc nào ó s d n n ung th .
1.2.5.2. S methyl hóa c a p16INK4a trong ung th :
Có th th y r ng s xáo tr n chu trình t bào c bi t do thi u h t ch c n ng c a gen u hòa trong con ng thi t y u là pRb (pRb/p16INK4a/cyclin D1) là ích
th ng xuyên c a các quá trình b nh hóa ung th , k c ung th vú. Trong nhi u lo i ung th p16INK4a c tìm th y tr ng thái b b t ho t do hai nguyên nhân t bi n trên gen và bi n i epigenetics [95]. S m t bi u hi n c a p16INK4a th ng do s methyl vùng o CpG trong vùng 5’ không d ch mã t i vùng exon 1 c a gen [96, 97]. Trong nghiên c u c a Krassenstein và c ng s , t n s methyl c a p16INK4a trong ung th vú là 17% [98]. Theo m t vài nghiên c u, s methyl hóa c a gen p16INK4alà m t ki n x y ra s m trong ung th vú [99]. Do ó, s methyl hóa b t th ng trên gen
p16INK4a a h n là m t d u ch ng sinh h c trong tiên oán, ch n oán và theo dõi ti n tri n kh i u ti m n ng trong ung th vú.
Tóm l i, trên th gi i ã và ang có nhi u công trình nghiên c u v s methyl hóa b t th ng c a các gen nh m h ng t i vi c s d ng chúng nh m t d u ch ng sinh h c c tr ng cho t ng b nh ung th k c ung th vú c xu t b n. Có công trình thì ánh giá chung cho nhi u gen, có công trình ch kh o sát trên m t ho c vài gen. có m t cái nhìn t ng th h n v tính ch t methyl hóa trên c n m gen t ng p t t t c các công trình nghiên c u tr c, trong quá trình th c hi n tài, chúng tôi ã ti n hành t ng h p và phân tích s li u t thông tin methyl hóa trên n m gen
BRCA1, RASSF1A, Cyclin D2, p16INK4a và GSTP1 t r t nhi u công b trên th gi i Toàn b k t qu này ã c chúng tôi xu t b n vào n m 2011 [100]. Ph n ti p theo, chúng tôi s trình bày m t cách tóm l c k t qu phân tích – t ng h p này.
Sau khi ti n hành khai thác d li u trên Pubmeth và Pubmed (NCBI) b ng v i các t khóa “breast cancer”, “epigenetics” và “DNA methylation”, chúng tôi thu c 44 công trình th c nghi m kh o sát m c methyl hóa trên vùng promoter c a n m gen RASSF1A, GSTP1, cyclin D2, p16INK4a và BRCA1 (tính t i th i m tháng 12/2011). M t s nh n nh ban u c rút ra là: (1) M c methyl hóa c a gen c phát hi n b ng nhi u k thu t trên nhi u lo i m u khác nhau và (2) T n s methyl hóa khá là khác nhau gi a các nghiên c u. Do v y, chúng tôi ti n hành tính
n s methyl hóa trung bình có tr ng s ( lo i b s khác bi t v m c methyl hóa gi a các nghiên c u).
Trong các nghiên c u này, MSP là ph ng pháp ch y u c s d ng phân tích tình tr ng methyl hóa c a các gen, chi m 89% (39/44); 3 nghiên c u khác s
kh methyl hóa (B ng 1.2). Có th th y r ng tuy có nhi u k thu t c i biên t MSP, nh ng MSP v n c s d ng nhi u b i s n gi n, nh y cao nh t là kh n ng phân bi t alen (methyl hóa ho c không) trong h n h p DNA tách t m u là t p h p các t bào ung th hay không ung th . ây th c s là m t l i th c a MSP so v i k thu t gi i trình t d a trên PCR (v n c xem là chu n vàng c a các k thu t Sinh
c Phân t ).
Trong n m gen kh o sát, s methyl hóa b t th ng c a BRCA1 c phân tích trong 12 nghiên c u v i t ng s m u là 850; ti p theo là gen p16INK4a v i 10 nghiên u trên 811 m u. 11 nghiên c u ã ti n hành v i gen RASSF1A và s l ng m u ng ng là 593. Cu i cùng, tình tr ng methyl hóa c a hai gencyclin D2, GSTP1 n t c ti n hành trên 7 nghiên c u v i 397 m u và 4 nghiên c u v i 527 m u.
ng 1.2: Khái quát các nghiên c u v n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin
D2, GSTP1 và p16INK4a Gen ng nghiên u ng u MSPs/s nghiên c u n s methyl hóa (%, có tr ng s ) Trong ung th vú bào th ng BRCA1 12 850 9/12 8.8% 0% RASSF1A 11 593 11/11 72.2% 19.8% Cyclin D2 7 397 6/7 47.2% 2.4% GSTP1 4 527 4/4 9.8% p16INK4a 10 811 9/10 23.9% ng s 44 3178 39/44
n c vào ph n tr m có ý ngh a theo kích c m u phân tích, chúng tôi ghi nh n n s methyl hóa c a genRASSF1A là cao nh t chi m 72.2%, ti p n là gen cyclin