Đánh giá mức độ Methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng Promoter gen APC trên các bệnh ung thư

 Báo cáo KLTN-          Trang 1 T VN  Theo thng kê ca T Chc Y T Th Gii (WHO), trên th gii có khong 14,1 tring hi và 8,2 tring hp t vong xy ra trong i 12,7 tring hp mi mc bnh và 7,6 triu ng hp t c tính cho th tuc chc   t cung là hai long gp và gây t vong cao  ph n [64] . Gen APC là gen c ch khm ti v trí 5q21-q22 trên nhim sc th s 5 ca b i. Gen APC bao gm 15 exon nm trong mt locus 98-kilobase [83] . S methyl hóa xy ra ti co CpG xung quanh vùng promoter gen APC, dn c ch s biu hin ca gen, là nguyên nhân dn t [30] . S methyl hóa DNA là s bii phân t gn nhóm -CH 3 vào v trí Cytosin trong o CpG ca trình t DNA. Nhiu báo cáo khoa hc trên th gii cho thy s methyl hóa vùng promoter ca gen APC (Adenomatous polyposis coli gene) là du chng sinh hc ting và ch [37] [55] [30] . Trên th gii, vic nghiên c tn s methyl hóa ca gen APC c thc hin  nhiu lo  : i trc tràng [29][51]   i [53][89]  [9][55][86][89]  [31]  t cung [21] Tuy nhiên, d liu v s methyl hóa vùng promoter gen APC i vi bnh  Vic công b nhiu. Do vy, chúng tôi thc hi khóa lun tt nghip: " ÁNH GIÁ MC  METHYL HÓA TI CÁC O CpG THUC VÙNG PROMOTER GEN APC TRÊN CÁC BNH UNG TH" vi mn tìm du chng sinh hc ting, ch b t cung nói riêng. Ni dung nghiên cu bao gm:  Kho sát in silico  Báo cáo KLTN-          Trang 2 - Thu thp thông tin v m, cu trúc ca gen APC và m s methyl hóa trên gen APC vi các bc bi và ung  t cung. - Thit k b mi c hiu cho phn ng MSP khui vùng gen cn kho sát. - Kho sát,  thông s vt lýc hiu ca b mi (Cp mi methyl APC-MF, APC-MR và cp mi unmethyl APC-UF, APC-UR) trên trình t o CpG thuc vùng promoter gen APC.  Kho sát thc nghim - Kh c hiu, nhi lai tp mi methyl và unmethyl. - Thc hin quy trình phn    m methyl hóa vùng promoter gen APC vi các mu sinh thit mô vú t nhng bnh nhân m vú (kèm theo thông tin mu và các ch tiêu lâm sàng) và các mu mô vú lành tính, c cung cp t bnh vii hc TP. H Chí Minh; mu máu hoc dch pht t nh nhim HPV kiu uy p, mu máu hoc dch pht t o lành tính (kèm theo các ch tiêu lâm sàng) c công ty c phn công ngh Vit Á cung cp.  Báo cáo KLTN-          Trang 3 Phn I: TNG QUAN  Báo cáo KLTN-          Trang 4 I.1. Ung th I.1.1. nh ngha ung th là      Quá trình dlà nguyên nhân  (WHO) [92] .  và  U lành tính và    . U ác tính     [106] . I.1.2. Phân loi ung th  c phân loi da theo tính cht gii phu bnh ho quan b t Các t t khi u (bao gm c t  u xut phát t mt t bào duy nht phân chia mà thành. t bnh  c phân loi theo loi t bào khi phát và theo v trí ca t bào      ng h      c khi u nguyên phát [97] . t phát t t bào gng hin din  tinh hoàn hoc bung trng [100][102] .  u mô (carcinoma)  ch mt khi u ác tính có ngun gc t t bào biu mô và niêm mc bên trong hoc bên ngoài c ng tiêu hóa hay các tuyu mô, chim 80-90% ca tt c ng h u mô c các tuyn có kh t,  tuyn vú sn xut sa, phi tit cht nhi tràng, tuyn tin lit hoc bàng quang.  Bnh lý huyt hc ác tính (hematological malignancy) nh bch cu  Báo cáo KLTN-          Trang 5 (leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xut phát t máu và t Bnh bch cng liên n vic sn xut quá mc các t bào bch cu ng thành, các t  các chn d bng d b nhim trùng. Bnh bch cn các t bào hng cu, có th t mi do thiu máu.     ng phát trin trong h bch huyt (lá lách, amidan, và tuyn c).  t phát t mô liên kt, n, và cht béo.  U hc t do ri lon ca t bào sc t.  U quái bt ngun t các t bào mm. I.1.3. Bnh ung th vú  vong ph bin nht trong các b ph n. Bnh ung  n s phát trin bng ca các t bào có ngun gc t các mô vú [49]  xy ra  ph n mà còn  c nam gii, t l mc bnh  nam gii chim khong 1% ca tt c ng hp  [91] .  Các yu t nguy c dn đn ung th vú: Các yu t i vi bi tính n i ln tui. Yu t m: Tin s i tit t, li sng và ch  ng thiu khoa hng sng b ô nhim  Tui và gii tính i tác. Hu hng hp ung n tric tìm thy  ph n trên 50 tui. Ph n  ung n so v [68] .  Tin s gia đình Nu mt vài thành viên c   cung, ung ng trng, hot kt ) bnh nhân có th có  [44] . Mt s i có nht bin di truyn dn  Báo cáo KLTN-          Trang 6 n nhiu kh n ung  bin nhc tìm thy trong các gen BRCA1, BRCA2 và mt s gen khác ít ph bip53, CHEK2, ATM, BRIP, PALB2, PTEN, và STK11 [17] .  Ni tit t i m  có th kích thích phát trii tit t b n bu và kt thúc ca chu k kinh nguyt, mang thai sm, liu pháp thay th hormon, s dng thuc ung [68] .  Li sng và ch đ n ung  c vng, ch  ng nhiu cht béo  bnh nhân béo phì và c bit là  ph n mãn kinh có th  d ung có cn, hút thuu t  [25][58] .  Yu t môi trng Yu t ng có th  p xúc vi hóa cht, tia bc x [25][58] . I.1.4. Ung th c t cung:  t cung là ng th hai trong s các long gp  ph n trên toàn th gii và là nguyên nhân chính gây t  ph n thuc n.  Các yu t nguy c dn đn ung th c t cung: Ht c ng hp  t n HPV (Human Papiloma Virus), mt loc thù theo mô, d lây lan và lây lan rng rãi. HPV là vi rút d lây nhing tình dc nht. Không có thuu tr c hiu cho nhim HPV [81] . HPV là mt t hp các chng vi rút khác nhau [62] . Trên th git t 100 chng HPV. Vi rút HPV c chia làm 2 nhóm: nhóm nhóm p (v Các nhóm u ht các bnh u môn - sinh dc, trong khi các nhóm p có th gây sùi mào gà sinh dc, t bào c t cung bng, bng hô hp tái phát,  Báo cáo KLTN-          Trang 7 hoc ph bin nht là các viêm nhim không có triu chng và không phát hin  [80] . Hu ht ng h t u phát hin có nhip thì him khi gp [1] . Có ít nht 13 kiu gekiu gen  liên quan ti khong 70% tt c các ng hp  t cung là HPV-16 và HPV-18. Bên cHPV-45 và HPV- t cung, chim khong 4% s ca mi kiu gen [23][78] . Hu ht các viêm nhim  c t cung u t bin mt mà không  li triu chm kéo dài vi các kiu gen HPV  gây nên các tu mô c t cung. Trong s các ph n nhim các long t 5-10% s chuyn thành viêm nhim HPV kéo dài, dn t hin các t c t cung. Nu u tr, các t tin tri t cung xâm ln [78][79] . I.1.5.Các phng pháp chn đoán ung th. I.1.5.1. Các phng pháp chn đoán ung th vú. Theo t chc y th th gii (WHO), chm là chic  u tr c bit là  c có thu nhp th bnh ng ch c ch n cui [104] .  Kim tra hình nh  Chnh Chc s dng khi bnh nhân i qua nhng du hiu thay i  tuyn vú xut hin dch tit núm vú hoc mt khi u mi.  Siêu âm Siêu âm s dng sóng âm thanh tn s  quan sát hình nh ca các mô vú. Siêu âm có th phân bit gia mt khi rn, có th t u nang cha y d  Báo cáo KLTN-          Trang 8  Chp cng t MRI MRI s dng t ng  quan hình nh chi tit và cho phép phân bit m t. MRI  c s d sàng lc  nhng ph n mc bnh cao.  Sinh thit t bào Mu bnh phc qua sinh thit bng mt kim nh thích hp cho vic ch bào hc. ó, mu mô c kim tra i kính hin vi  phân tích trng thái ca bnh. Tuy nhiên, sinh thit t bào bng kim nh có th xy ra hing âm tính gi  I.1.5.2.Các phng pháp chn đoán ung th c t cung. Theo t chc y t th gi  t cung có th  u tr c phát hin sm. Các xét nghim Pap smear (pht t bào) là th nghim duy nhc s dng rng rãi trong chc chng minh là làm gim t l mc u t cung và t vong. Các xét nghim khác (VIA, HPV, khoét chóp sinh thit CTC )  ha hn mang li hiu qu trong chu tr.  Sàng lc t bào hc ậ Pap’s smear ,  bào hc phát hin nhng bng ca t bào bi phát hin s c gi là Pap smear. Nguyên lý da trên tính cht bong ra mt cách t nhiên, liên tc ca t c bit là các t bào bng có tính cht bong sm và rt d bong. Phân tích hình thái hc chi tit, du hiu ca t bào b nhim HPV là s b bin i thành các dng t  ng l, hoc nhân teo li, hay có th tìm thy t bào bóng, t   smear c nhy 44- c hiu cao 91-96%. Tuy  l âm tính gi, theo các tác gi ng t 1,1 -29,7% [4] .  Soi c t cung  Báo cáo KLTN-          Trang 9 Soi c t c s dng khi kt qu sàng lc c t cung bng, hoc có triu chng c t cung. Soi c t cung s dng mt kính hin vi nh  tìm bt k bng trong c t cung. Trong khi kim tra c t cung, bác  khoa có th loi b mt mu mô nh (sinh thi có th kim ti kính hin vi cho các t  [54] .  Khoét chóp sinh thit c t cung Khoét chóp sinh thit c t       u tr nhng b t cung  n s này, mu mô hình nón nh ca c t cung s c loi b  kii kính hin vi cho các t  [54] .  Quan sát bng mt thng vi acid acetic (VIA) s dng dung dch acid acetic 3-5% (dm) xt hoc bôi lên b mt c t cung và quan sát c t cung bng mng sau 1 phút. Nu quan sát thy các vùng b trng gn vi khu vc chuyn tip thì xét nghic i vi t bào tin n si phi có phòng xét nghim hay nhân viên o chuyên sâu. Kt qu cho thy ngay lp tu tr ngay trong ln u kim tra.  nhy ca VIA tt bng hoc t nhy ca Pap  smear, kim tra bng mng là rt ch quan, và cn ph kim soát chng cm tra bng mng. VIA có th không phù hp lm  ph n sau mãn kinh bi vì vùng chuyn tip dch chuyn vào ng c t cung khi mãn kinh [26][27][76][74] .  Phng pháp Sinh hc phân t HPV-PCR Mu máu hoc mu t bào t c t cung, o c ly c xét nghim dt sinh hc phân t c bit là PCR. Mm ca xét nghim c thc hiu ki không mang tính ch c bng mng và sàng lc t bào hc. Bên cnh vic nh  Báo cáo KLTN-          Trang 10 nhim b nh các ph n  bnh  c t cung [88] . I.1.6. Tình hình ung th trên th gii và  Vit Nam: I.1.6.1. Tình hình ung th trên th gii c tính, trên th gii có khong 14,1 tring hi và 8,2 tring hp t vong x012, so vi 12,7 tring hp mi mc bnh và 7,6 triu ng hp t vong  c tính cho thcó 32,6 trii ( tu sng, c chm [69] . Các lo bin nht trên toàn th gic ch phi (1,8 triu ng hp, chim khong 13,0% tng s ng hp), vú (1,7 triu ng hp, chim khong 11,9%), và  (1,4 triu ng hp, chim khong 9,7%) [105 ] . Nguyên nhân ph bin nht gây t vong do i (1,6 triu ng hp, chim khong 19,4% tng s),   gan (0,8 triu ng hp, 9,1%), và ung d dày (0,7 triu ng hp, chim khong 8,8%) [69] . Theo th     nh trên toàn th gi c tính ng h ng thi u ph n c ch  triu ph n còn sc ch  K t c tính, t l mc b t l t ên 14%. T l vú cao nhc phát tri l t u  c kém phát trin do thiu kin phát hin sm và tip cn v u tr (IARC) [69] . u cp thit trong kip cn hiu qu  phát hin sm, chu tr  nhng ph n sng  các quc gia kém phát trin. [...]... khi ti n hành khai thác d li u trên NCBI b ng các t khóa APC , c 17 bài báo kh o sát m methyl hóa trên vùng promoter c a gen APC chung, các nghiên c u v b b Nhìn methyl hóa t i vùng promoter gen APC c th c hi n nhi u qu c gia trên th gi i và các s li u trên cho th y, có s khác bi t l n v t n s methyl hóa, lo i m u s d ng gi a các nghiên c u (thông tin chi ti Hình 3.1.1: Các c trình bày ph l c 5) sinh... nhi m s c th I.3.3 S methyl hóa gen APC S methyl hóa b ng vùng promoter gen APC x y ra i tr c tràng [29][51] r t nhi u lo i ung i [53[89] vú [45][89][30], ung t cung [21] Theo các nghiên c u trên th gi i, t n s methyl hóa c a gen APC trong các kh c c a kh i u (Virmani và cs., 2001; Roa và cs., 2004; Chen và cs., 2007; Liu và cs., 2007) Theo các nghiên c u vùng promoter gen APC c công b , t i Hoa... methyl hóa o CpG [24][93] tm c Hình 1.2.2: S methyl hóa trong t ng và t bào ung th o CpG Vùng trình t c g c kho ng 200bp v i t p h p CG chi o CpG [50] Trong t methyl hóa, kho i có kho ng 70ng xu t hi n n exon 1 trong trình t gen c ng v t có vú trong vùng promoter c và im l ng d cb n r i lo v y, s methyl hóa t [33] o CpG b vùng promoter và kéo Khi DNA b methyl hóa u, các gen b b t ho t u hòa trong các. .. 2001) m methyl hóa methyl hóa t i i Nh t B n, Jin Z và cs công b các m c phát hi n (Jin Z., 2001) T i Trung Qu methyl hóa là 36,8% (Liu Z., 2007) c uv im các m u mô ung tl nn methyl hóa là 39,5% các m n I và 7,7% các mô ph i lành tính (Lin Q., 2009) u và phát hi n m u mô c t methyl hóa là 56,8% c các m u mô ung các m u mô lành (Chen Yong, 2013) M t nghiên c u k t h p gi a B hi n m methyl hóa trên DNA... (Dimberg JJ., 2013) Các nghiên c u v m methyl hóa hi n nhi u qu c gia trên th gi i và c u vùng promoter gen APC nhi u lo Vi t Nam còn h n ch , bên c uy nhiên, các nghiên uv c công b , vì v y, nhóm chúng tôi th c hi methyl hóa t c th c t tài n o CpG thu c vùng promoter gen APC kh o sát m c các b nh nhân t cung I.4 P n s methyl hóa DNA Hi n nay, m methyl hóa DNA có th nhi ng r t i trình t tr c ti p Direct... Bên c nghiên c u trên s dùng nhi qMSP, RT-PCR li c, chúng tôi nh n th y, các t sinh h c phân t methyl hóa t i vùng promoter c a gen APC, bi n nh t chi m 79,3% (P . mc  methyl hóa to CpG thuc vùng promoter gen APC  các bnh nhân   t cung. I.4. Phng pháp phát hin s methyl hóa DNA Hin nay, m methyl hóa DNA. ca gen APC và m s methyl hóa trên gen APC vi các bc bi và ung  t cung. - Thit k b mi c hiu cho phn ng MSP khui vùng gen. vt lýc hiu ca b mi (Cp mi methyl APC- MF, APC- MR và cp mi unmethyl APC- UF, APC- UR) trên trình t o CpG thuc vùng promoter gen APC.  Kho sát thc nghim - Kh