Khảo sát tình trạng Methyl hóa gen p16INK4α tại các đảo CpG thuộc vùng Promoter trên một số bệnh ung thư

17 B GIÁO DC VÀ ÀO TO TRNG I HC M TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: KHO SÁT TÌNH TRNG METHYL HÓA GEN p16 INK4  TI CÁC O CpG THUC VỐNG PROMOTER TRểN MT S BNH UNG TH KHOA CỌNG NGH SINH HC CHUYểN NGÀNH: Vi sinh - Sinh hc phơn t CBHD: PGS.TS. Lê Huyn Ái Thúy ThS. Lao c Thun SVTH: Lý Th Tuyt Ngc MSSV: 1053012493 Khóa: 2010 - 2014 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014. LI CM N Tôi xin bƠy t lòng kính trng vƠ bit n chơn thƠnh đi vi PGS.TS. Lê Huyn Ễi Thúy, ngi luôn đy nhit huyt vi khoa hc đƣ truyn cho tôi ngn la đam mê trong nghiên cu vƠ luôn giúp đ tôi lúc khó khn. Xin chơn thƠnh cm n ThS. Lao c Thun, ngi thy đƣ luôn tn tình hng dn, đng viên vƠ giúp đ tôi trong sut quá trình thc hin đ tƠi. Tôi cng xin cm n ThS.Trng Kim Phng vƠ tt c các thƠnh viên trong phòng Thí Nghim Sinh Hc Phơn T - Trng H M TP.HCM đƣ h tr, giúp đ tôi trong sut thi gian va qua. Cui cùng con xin bƠy t lòng bit n sơu sc đn Ba M vƠ em đƣ luôn yêu thng, chm sóc, đng viên vƠ to điu kin tt nht cho con. Tp H Chí Minh, Tháng 5, 2014 Tuyt Ngc DANH MC CÁC BNG BIU PHN 1 TNG QUAN TÀI LIU PHN 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP Bng 2.1. Bng mi gen p16 INK4  Bng 2.2. Các bc tách chit phenol/chloroform Bng 2.3. ThƠnh phn dung dch lysis buffer Bng 2.4. Các bc chn b Ct conversion reagent (EZ1) Bng 2.5. ThƠnh phn phn ng PCR PHN 3. KT QU VÀ THO LUN Bng 3.1. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4 trên mt s bnh ung th Bng 3.2. Phng pháp đc s dng trong 24 công trình nghiên cu Bng 3.3. Loi mu bnh phm đc s dng trong 24 công trình nghiên cu Bng 3.4. Bng trung bình tn s có trng s trên mt s bnh ung th Bng 3.5. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4 trên bnh ung th vú Bng 3.6. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4 trên bnh ung th c t cung Bng 3.7. Bng trung bình tn s có trng s  các TBUT, TBBT vƠ ung th theo giai đon trên bnh ung th vú Bng 3.8. Bng trung bình tn s có trng s  các TBUT, TBBT vƠ ung th theo giai đon trên bnh ung c t cung Bng 3.9. Kt qu kho sát các đc tính vt lỦ ca mi Bng 3.10. Bng nng đ vƠ cht lng DNA tách chit Bng 3.1. Bng kt qu s b phng pháp MSP Bng 3.13. Bng mô t đc đim mu bnh phm ung th vú Bng 3.13. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter  gen p16 INK4 vi ung th vú Bng 3.14. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter  gen p16 INK4 vi các yu t lơm sƠng trên bnh nhơn ung th vú Bng 3.15. Mc đ liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen p16 INK4 vi ung th vú DANH MC HÌNH V VÀ S  PHN 1. TNG QUAN TÀI LIU Hình 1.1. T l mc bnh vƠ t l t vong trên toƠn th gii Hình 1.2. T l mc bnh ung th vú trên toƠn th gii Hình 1.4. Mô t ung th vú Hình 1.5. Ung th c t cung Hình 1.6. C ch epigenetics bao gm hin tng methyl hóa DNA, bin đi histone vƠ micro - RNA Hình 1.7. Quá trình methyl hóa DNA Hình 1.8. C ch methyl hóa DNA chuyn hóa 5 - cystosine (5C) thƠnh 5 methylcytosine (m5C) Hình 1.λ. C ch bin đi epgenetics gơy im lng gen Hình 1.10. Mô hình methyl hóa DNA Hình 1.11. Mô hình methyl hóa DNA  các trình t lp li Hình 1.12. nh gen p16 INK4 trên NST s λ thuc b gen ngi Hình 1.13. Quá trình phiên mƣ gen p16 INK4  Hình 1.14. C ch hình thƠnh khi u Hình 1.15. X lỦ sodium bisulfite vƠ s chuyn đi cytosine thƠnh uracil PHN 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP Hình 2.1. Chu trình nhit bin đi bisulfite ca EZ DNA METHYLATION - GOLDTM kit Hình 2.2. Chu k gradient nhit cho phn ng PCR Hình 2.3. Chu k nhit cho phn ng PCR PHN 3. KT QU VÀ THO LUN Hình 3.1. Tn s methyl hóa trung bình có trng s ca các gen p16 INK4 trong các mu ung th phi, vú, c t cung vƠ đi trc trƠng Hình 3.2. Tn s methyl hóa trung bình có trng s ca gen p16 INK4 trong ung th vú vƠ phơn chia theo các giai đon bnh Hình 3.3. Tn s methyl hóa trung bình có trng s ca gen p16 INK4 trong ung th c t cung vƠ phơn chia theo các giai đon bnh Hình 3.4. nh v gen p16 INK4 trên NST s λ Hình 3.5. S đ hình nh các vùng đo CpG trên trình t gen kho sát Hình 3.6. V trí các vùng promoter, 5’UTR vƠ exon 1 trên trình t kho sát Hình 3.7. Trình t gen p16 INK4 vƠ s phơn b các v trí phiên mƣ trên trình t Hình 3.8. V trí trình t mi methyl trên vùng trình t promoter thuc gen p16 INK4 Hình 3.λ. Kt qu phn ng gradient nhit đ trong khong 51 o C - 62 o C Hình 3.10. Kt qu đin di sn phm MSP Hình 3.11.Kt qu gii trình t sn phm MSP DANH MC CH VIT TT 5C V trí carbon s 5 BSP Bisulfite sequencing PCR C Cytosine CDK Cyclin Depedent Kinase CKIs Cyclin Kinase Inhibitors CpG Cystosine phosphate Guanine DNMT DNA methyltranfarase EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid G Guanidine Kb Kilo base pair M5C Nhóm methyl (CH 3 ) gn vƠo C s 5 MSP Methylation specific PCR NCBI National Center for Biotechnology Information NST Nhim sc th OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Pha G Pha GAP Pha M Mitosis Pha S Pha Synthesis pRB Product of retinoblastoma RT - PCR Real time PCR SAM S - adenosyl - L - methionine SDS Sodium dodecyl sulfat TBBT T bƠo bình thng TBUT T bƠo ung th T m Nhit đ nóng chy T a Nhit đ lai UTCTC Ung th c t cung UTDTT Ung th đi trc trƠng UTP Ung th phi UTR Untranlated region UTV Ung th vú MC LC Li cm n DANH MC CỄC BNG BIU DANH MC HÌNH V VÀ S  DANH MC CH VIT TT T VN  1 PHN 1. TNG QUAN TÀI LIU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIểN CU TRONG VÀ NGOÀI NC 3 1.2. TNG QUAN V UNG TH 4 1.2.1. Khái nim ung th 4 1.2.2. Tình trng ung th trên th gii vƠ Vit Nam 4 1.2.3. Tng quan ung th vú 7 1.2.4. Tng quan ung th c t cung 10 1.3. EPIGENETICS 13 1.3.1. nh ngha 13 1.3.2. Hin tng epigenetics 13 1.3.3. o CpG 14 1.3.4. Chu k t bƠo vƠ gen p16 INK4  15 1.3.5. Methyl hóa DNA 16 1.3.6. Tng quan v gen p16 INK4  20 1.3.7. Con đng dn đn s điu hòa bt thng gen p16 INK4   các bnh ung th 22 1.3.8. Các phng pháp phát hin s methyl hóa 24 PHN 2. VT LIU VÀ PHNG PHỄP 2.1. THI GIAN VÀ A IM NGHIểN CU 26 2.2. VT LIU VÀ PHNG PHỄP NGHIểN CU 26 2.2.1.Vt liu 26 2.2.2. Phng pháp 26 PHN 3. KT QU VÀ THO LUN 3.1. KT QU KHAI THỄC D LIU 35 3.1.1. Khai thác d liu trên mt s loi ung th 35 3.1.2. Khai thác d liu trên ung th vú vƠ ung th c t cung 40 3.2. KHO SỄT IN SILICO 46 3.2.1. Xác đnh cu trúc gen, v trí gen p16 INK4  46 3.2.2. Kho sát v trí vƠ cu trúc đo CpG thuc vùng promoter gen p16 INK4  46 3.2.3. ánh giá mi 49 3.3. KT QU THC NGHIM 52 3.3.1. Kt qu tách chit DNA 52 3.3.2. Kt qu phn ng MSP trên các mu mô đúc paraffin 53 3.3.3. Gii trình t sn phm MSP 55 3.3.4. Mô t đc đim mu bnh phm ung th vú theo ch tiêu lơm sƠng vƠ cn lơm sƠng 57 3.3.5. Xác đnh mi tng quan gia s methyl hóa gen p16 INK4  vƠ bnh ung th 58 [...]... ng d n 1.3.7.1 S u b t ns u ng gen p16INK4 b t b nh ung ng trong ung - oncogene [54] Gen p16INK4 p16INK4 [66][65] 1.3.7.2 ch methyl b t hay ng gen p16INK4 trong ung p16INK4 (hypermethylation) gen [28][54] p16INK4 methyl -binding protein) [36] g deacetylases histone) y Tuy t Ng c Trang 22 a lu n t t nghi p d p16INK4 (gene silencing) [36][13][62] p16INK4 3 [13] Khi gen p16INK4 (retinoblastoma) 1 sang... t nghi p 1.2.4 T ng quan ung 1.2.4.1 Ung c t cung c t cung (Cervicial Cancer) UTCT [80] UTCTC 1.2.4.2 Y u t nguy b nh ung c t cung: [88] Virus HPV (Human papilloma irus HPV UTCTC [17][9] c - Tuy t Ng c Trang 10 a lu n t t nghi p [80] 5 1.2.4.3 c t cung [81] lo i ung ,u microinvasive ,k adenosarcoma, adenofibroma, adenomyoma , ung t 1.2.4.4 giai n ung c t cung [87] n cung: in sitiu) ,g Tuy t... 1.3.6.2.Vai gen p16 NST 9 [14][37] Gen p16INK4 [37][79] gen gen p16INK4 ch c Gen p16INK4 [29][18][35][27][3] gen p16INK4 - cyclin [8][25] Gen p16INK4 1 [37] sang pha G0 Gen p16INK4 - reg [59] [59] g Trong pha G0 Khi gen p16INK4 1 [71] p16INK4 p16INK4 [56] Gen p16INK4 p16INK4 terminal kinase 3 (glycin - - - terminal - [7][55] Tuy t Ng c Trang 21 a lu n t t nghi p Khi gen p16INK4 p16INK4 [27][73]... ng ung theo Globocan (2012), tr [53] h ung th , g 12 Tuy t Ng c [48] Trang 5 a lu n t t nghi p [53] 2 1.2.2.2 tr ng ung c t cung trong ch [20] 0 [20][32][9] 3 Tuy t Ng c g [52] Trang 6 a lu n t t nghi p 1.2.3 T ng quan ung 1.2.3.1 ni m ung invasive) (metastasize [84] [92] 4 1.2.3.2 y u t nguy 1.2.3.3 ung [84] lo i ung 1 [53] Tuy t Ng c Trang 7 a lu n t t nghi p in situ (vasive 1.2.3.4 giai n ung. .. SFRP1 - oncogen) [58] Tuy t Ng c [54] u [38][58] Trang 19 a lu n t t nghi p (methyl 3- - methylcytosine glyco [58] [58][54] [54] 11 1.3.6 T ng quan v gen p16INK4 g i gen p16INK4 1.3.6.1 V 12 Tuy t Ng c gen p16INK4 tr NST NST 9 gen [79] Trang 20 a lu n t t nghi p Gen p16INK4 2A) CDKN2A (Cyclin - Depedent Kinase inhibitor cyclin kinase, MST1 (multiple tumor suppressors 1) u, 21 t 1.3.6.2.Vai gen p16... p TV onal Agency c l p16INK4 p16INK4 Gen p16INK4 hay cyclin Tuy t Ng c CDKN2A (Cyclin - Depedent Kinase inhibitor 2A) kinase, gen 21 NST 9 Trang 1 a lu n t t nghi p gen Gen p16INK4 suppression gene) pha G1 sang pha G0 io ch p16INK4 p16INK4a p16INK4a Nam Tuy t Ng c Trang 2 a lu n t t nghi p 1.1 T T Bio - marker (apoptosis) Jha A K u c gen p16INK4 hi p15INK4b c k t qu t n s u sinh thi cung c [22]... p gen p16INK4 1.3.4 Chu k t Gen p16INK4 1 (GAP 1), S (Synthesis), G2 pha G2 1 [17] o - 1 - cyclin (CDKs retinoblastoma gene -E [59][34] 2 - - 1/S, G2 [17][26] 1 enzyme kinase (CKIs - Cyclin cyclin/CDK retinoblastoma genes), gen [37][17][40] Tuy t Ng c Trang 15 a lu n t t nghi p - [26]55][17][37] 1.3.5 Methyl 1.3.5.1 DNA nh 3- - phosphate - guanine 5 - methylcytosine (m5C) [21] 1.3.5.2 Hi n ng methyl. .. t nghi p [44] 7 8 methylcytosine (m5C) [91] 1.3.4.3 methyl lo i vai DNA methylatranferase (DNMT) trong DNA de novo methyltranfarase de novo [54][5][58] de novo 3- - de novo Tuy t Ng c Trang 17 a lu n t t nghi p de novo [54][5][58][10] enzy (maintenance DNA enzyme [6] [54] DNMT N de novo transferase 1.3.4.4 Epigenetics trong ung [21] [38] [75] [6] [19] 9 Methyl , [51] DNA trong ung Bio - marker)... cung c [22] c p16 ng s u ns iuc cung, t n s DAPK, p16, MGMT l u [73] u kh ng s p16INK4 , RASSF1A, RAR2 [70] u hi u kh i u Vallian S u p16INK4 gen methyl ung [67] Iran, t ng s ng u s methy tm gen p16INK4 , p14ARF cyclinD2, Slit2 p16INK4 , p14ARF , CyclinD2, Tuy t Ng c Trang 3 a lu n t t nghi p Slit2 [57] p16INK4 in silico [33] 1.2 1.2.1 ni m ung c [92] 1.2.2 tr ng ung th gi i Vi t Nam 2012 u kh g... nghi p Trong 1.2.4.5 ch n ung c t cung (CC) [90][89] Ch n hay t , vong cao Ch n b nh PAP - p u tr Surgery adiati (C Tuy t Ng c Trang 12 a lu n t t nghi p T tia X p Brachytherapy arboplatin, Paclitaxel, Topotecan, Gemcitabine [73] 1.3 EPIGENETICS 1.3.1 nh [47] 1.3.2 Hi n ng epigenetics microRNAs [21] Tuy t Ng c Trang 13 a lu n t t nghi p 6 h - RNA [45] g sinh [54] 1.3.3 o CpG - 4,0 [21][38] [21][58][64] . trung bình tn s có trng s trên mt s bnh ung th Bng 3.5. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4 trên bnh ung th vú Bng 3.6. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4 trên. nh các vùng đo CpG trên trình t gen kho sát Hình 3.6. V trí các vùng promoter, 5’UTR vƠ exon 1 trên trình t kho sát Hình 3.7. Trình t gen p16 INK4 vƠ s phơn b các v trí phiên mƣ trên. cu phát hin s methyl hóa các gen trên các mu máu vƠ khi u ca các bnh nhơn ung th t cung, tn s methyl hóa gen DAPK, p16, MGMT ln lt lƠ 60%, 28,2% vƠ 18,8% trên các mu khi u vƠ