Khai thá cd l iu trên ungth vú vƠ ungth ct cung

Theo s li u th ng kê trong B ng 3.7, có 6 nghiên c u v ung th vú vƠ 6 nghiên c u ung th c t cung phơn tích tình tr ng methyl hóa c a gen p16INK4v i t ng s

Lý Th Tuy t Ng c Trang 41

m u l n l t lƠ 40λ vƠ 830 m u, c ng nh s l ng m u c th cho t ng giai đo n c a hai lo i b nh ung th .

Bên c nh đó, c n c vƠo các giai đo n c a ung th vú vƠ ung th c t cung đ c phơn lo i trong các nghiên c u kh o sát, th ng kê t ng h p s li u ph n ánh tình hình methyl hóa theo giai đo n c a gen p16INK4a ( B ng 3.7). i v i các nghiên c u không phơn rõ giai đo n, s li u th ng kê s t ng h p thƠnh t n s methyl hóa trong ung th vú nói chung.

Theo B ng 3.7, t n s methyl hóa các t bƠo ung th vƠ t bƠo bình th ng có s khác bi t có Ủ ngh a, ch ng h n nh t bƠo đ c l y t mô thùy vú có t n s methyl

t bƠo ung th kho ng 86,7% [24] vƠ t n s các t bƠo vú bình th ng 5,6% [69] các t bƠo c t cung c ng v y các t bƠo ung th .

Khi phơn tích lo i m u s d ng trong nghiên c u ung th vú đ c th hi n b ng 3.5. Nh n th y, m u mô t i đ c s d ng v i t l cao nh t 68,2%. M u huy t thanh vƠ các lo i m u khác c ng đ c s d ng các phơn tích nƠy. ung th c t cung (B ng 3.7), nh n th y m u mô t i vƠ mô đúc paraffin đ c s d ng v i t l cao l n l t lƠ 32,3%, 21,λ%. NgoƠi ra, các bƠi báo nghiên c u nƠy s d ng ph n nh m u huy t t ng vƠ d ch ph t t cung.

Thông th ng, các nghiên c u đ u b t đ u b ng vi c s d ng mô t i b i chính đ c đi m c a lo i m u nƠyμ l y chính xác ngay t i kh i mô ung th (có s l ng t bƠo ung th r t cao so v i t bƠo bình th ng) đ xác đ nh chính xác tình tr ng methyl hóa c a t bƠo có bi n đ i b t th ng. Bên c nh đó, v i m c tiêu h ng t i kh ng đ nh tính h u d ng c a Bio - marker trong tiên đoán, theo dõi s ti n tri n kh i uầ, các lo i m u khác c ng đ c s d ng vì chúng đ c l y t b nh nhơn ch a ho c v a m i có các d u hi u c a b nh. Các s li u nƠy cho th y có s khác bi t quá l n v t n s methyl hóa gi a các nghiên c u. Ch ng h n, t n s methyl cao nh t nghiên c u tình hình ung th vú c a gen p16INK4 [24] lƠ 86,7% trong khi đó t n s methyl hóa th p nh t [69] 5,6%, tình hình b nh ung th c t cung trong nghiên c u c a tác gi [21][61]l n l t có t n s methyl hóa có s chênh l ch r t cao lƠ 28% vƠ 87%. Tuy nhiên, các s li u nƠy cho th y có s khác bi t quá l n v t n s methyl hóa gi a các nghiên c u c ng nh gi a các lo i t bƠo ung th hay t bƠo

Lý Th Tuy t Ng c Trang 42

bình th ng. đánh giá ti m n ng lƠm d u ch ng sinh h c trong phát hi n s m b nh c n ph i có tiêu ch n, s li u c th . Do v y, ti n hƠnh tính t n s methyl hóa trung bình có tr ng s (đ lo i b s khác bi t v m c đ methyl hóa gi a các nghiên c u (B ng 3.7, B ng 3.8). Sau đó mô t t n s methyl có tr ng s c a các nghiên c u ung th vú vƠ c t cung đ c th hi n Hình 3.2, Hình 3.3.

B ng 3.6. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16INK4trên b nh ung th vú

M u

PP

T n s methyl hóa (%)

T n s methyl hóa qua các giai đo n ung th

(%) TL TK SL Lo i TB BT TB UT G D0 GDI GD II GD III GD IV 25 Mô t i MSP - 44,7 - - - [34] 53 Mô thùy MSP - 86.7 - 60 60.6 - - [24] 48 Mô ng MSP - 52.1 - - - 30 HT thùy MSP - 80 - 80 45.8 - - 48 HT ng MSP - 45.8 - - - 70 Mô t i MSP, PCR-SSCP - 35.7 - - - - - [67] 46 Mô t i MSP - 23.9 - - - - - [76] 7 Mô t i MSP 14.3 - - - - 52 Mô đúc paraffin MSP - 38.4 9,0 - - - - [70] 15 Mô tuy n MSP, HMMD 5.6 - - - - - - [69] 15 Mô MSP, HMMD - 19.8 - - - - -

Ghi chú: MSP: Methylation specific PCR, HMMDμ hóa mô mi n d ch, UTP: ung th ph i, UTVμ ung th vú, UTCTCμ ung th c t cung, UTDTTμ ung th đ i tr c trƠng, HTμ huy t thanh, PPμ ph ng pháp, TLTKμ tƠi li u tham kh o.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 43

B ng 3.7. Khái quát tình hình methyl hóa gen p16INK4trên b nh ung th c t cung M u PP T n s methyl hóa (%)

T n s methyl hóa qua các giai đo n ung th

(%) TL TK SL Lo i TB BT TB UT GD0 GD I GD II GD III GD IV 141 Mô t i MSP 2,1 44,7 - - - - - [6] 125 Mô đúc parafin MSP, RT- PCR 1,0 28 - - - [22] 340 D ch ph t MSP 12,2 87,5 - - - - - [63] 42 Mô t i MSP 2 59,1 - 0 18,2 40,1 0 [46] 57 Mô đúc parafin MSP, Mi n d ch h c 14,2 55,8 54,8 76, 9 29 - 3,2 [61] 85 Mô t i MSP 7,2 39 - 56, 5 - - 47,8 [73] 40 Huy t t ng 19,3 33

Ghi chú: MSP: Methylation - specific PCR, HMMDμ hóa mô mi n d ch, UTP: ung th ph i, UTVμ ung th vú, UTCTCμ ung th c t cung, UTDTTμ ung th đ i tr c trƠng, PPμ ph ng pháp, TLTKμ tƠi li u tham kh o, TBUTμ t bƠo ung th , TBBTμ t bƠo bình th ng, GD0μ giai đo n 0, GDIμ giai đo n I, GDIIμ giai đo n II.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 44

B ng 3.8. B ng trung bình t n s có tr ng s các TBUT, TBBT vƠ giai đo n b nhtrên b nh ung th vú

B ng 3.9. B ng trung bình t n s có tr ng s các TBUT, TBBT vƠ giai đo n b nhtrên b nh ung th c t cung

Ghi chú:TBUTμ t bƠo ung th , TBBTμ t bƠo bình th ng, GD0μ giai đo n 0, GDIμ giai đo n I, GDIIμ giai đo n II, GDIIIμ giai đo n III, GDIVμ giai đo n IV.

T n s methyl hóa trung bình có tr ng s (%) TB UT TB BT Ung th theo giai đo n GD0 GDI GDII 52,58 7,06 9,00 71,20 53,95

T n s methyl hóa trung bình có tr ng s (%) TB

UT

TB BT

Ung th theo giai đo n

GD0 GDI GDII GDIII GDIV 68,28 3,40 0,00 69,93 18,84 20,05 56,13

Lý Th Tuy t Ng c Trang 45

Hình 3.2. T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a gen p16INK4 trong ung th vú vƠ phơn chia theo các giai đo n b nh

Hình 3.3. T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a gen p16INK4 trong ung th c t cung vƠ phơn chia theo các giai đo n b nh

Chú thích: t bƠo ung th (TBUT), t bƠo bình th ng (TBBT), ung th giai đo n 0 (UTGD0), ung th giai đo n I (UTGDI), ung th giai đo n II (UTGDII), ung th giai đo n III (UTGDIII), ung th giai đo n IV (UTGDIV). Tơm các đ ng tròn th hi n s methyl hóa đƣ đ c các bƠi báo liên quan. Kích th c đ ng tròn th hi n s l ng m u trong các nghiên c u. ng th ng n m ngang hi n th t n s methyl hóa trung bình có tr ng s d a trên t c c các nghiên c u.

Kh o sát t n s methylhóa có tr ng s c a gen p16INK4đ c v ung th vú. T bƠo ung th (TBUT) có t n s trong bình có tr ng s (TSTBTS) đ t 52,58% có s khác bi t có Ủ ngh a so v i t bƠo bình th ng (TBBT) đ t 7,06%. Trong các giai đo n ung th vú, các t bƠo ung th thu c ch y u giai đo n 0, I, II có t n s methyl hóa các giai đo n ung th l n l t lƠ λ,00%, 71,20% vƠ 53,λ5%. Nh n th y giai đo n I (các tuy n hay thùy xu t hi n kh i u ch a có hi n t ng xơm l n) có t n s methyl hóa cao nh t vƠ giai đo n 0 (giai đo n ti n ung th ) lƠ th p nh t.

T n s methyl hóa có tr ng s c a gen p16INK4 đ c kh o sát v ung th c t cung. T bƠo ung th (TBUT) có t n s trong bình có tr ng s (TSTBTS) đ t 68,28% có s khác bi t có Ủ ngh a so v i t bƠo bình th ng (TBBT) đ t 3,42%. Trong các giai đo n ung th vú, các t bƠo ung th thu c ch y u giai đo n 0, I, II, III, IV có t n s methyl hóa các giai đo n ung th l n l t lƠ 0,00%, 69,93%,

Lý Th Tuy t Ng c Trang 46

18,84%, 20,05%, 56,13%. Nh n th y giai đo n I (giai đo n xu t hi n kh i u t cung) có t n s methyl hóa cao nh t vƠ giai đo n 0 (giai đo n ti n ung th ) lƠ th p nh t.

3.2. KH O SÁT IN SILICO

3.2.1. Xácđnh c u trúc gen, v trí gen p16INK4

Hình 3.4. nh v gen p16INK4trên NST s 9

Gen p16INK4 hay còn g i CDKN2A (Cyclin - Dependent Kinase inhibitor 2A n m trên vùng λp21 thu c NST s λ, kích th c c a gen p16INK4 b t đ u t nu 21λ67752 đ n nu 21λλ44λ1. Gen p16INK4 mƣ hóa cho hai lo i proteinp16INK4a vƠ p14 (p14ARF) có tr ng l ng 16kDa vƠ 15kDa [14][32]. Gen p16INK4a có kích th c 42kb g m ba exon 1 , 2 vƠ 3 vƠ đóng vai trò chính trong các con đ ng đi u hòa chu trình t bƠo [14][32]

. nh v gen p16INK4a s d ng trong nghiên c u nƠy có mƣ s truy c p trên NCBI lƠ NC 00000λ (Hình 3.4).

3.2.2. Kh o sát v trívƠ c u trúcđ o CpG thu c vùng promoter gen p16INK4

Ti n hƠnh thu th p trình t vùng promoter thu c gen CDKN2A (p16INK4) b ng ch ng trìnhNCBI theo mƣ DQ406745.

Trình t vùng promoter gen p16INK4 đ c thu nh n trên ngơn hƠng gen (Genbank) trên c s d li u NCBI v i mƣ s accession lƠ DQ406745. Sau đó, các đ o CpG đ c ti n hƠnh xác đ nh thông qua ch ng trình Methprimer. K t qu đ c trình bƠy Hình 3.5.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 47

Hình 3.5. S đ hình nh các vùng đ o CpG trên trình t gen kh o sát

Nhìn chung, k t qu cho th y 4 đ o CpG đ c d đoán v i chi u dƠi các đ o t ng ng lƠ 26λbp (CpG1), 130bp (CpG2), 142bp (CpG3) vƠ 257bp (CpG4). Trên trình t kh o sát nƠy, nh n di n đ c m t vùng đ o CpG4 v i chi u dƠi 257bp đ c đ nh v t v trí Nu 188λ đ n 2145. NgoƠi ra, d a trên k t qu kh o sát trên genebank, nh n th y s phơn b các vùng c a trình t nƠy nh sauμ vùng promoterđ c đ nh v t Nu 1 đ n 1787, vƠ vùng exon 1 đ c đ nh v b t đ u t Nu s 2000. K t qu phơn vùng đ c đ c th hi n Hình 3.5. Nh v y, vùng đ o CpG4 ph l p m t ph n promoter, vùng 5’UTR vƠ 1 ph n vùng exon 1.

Hình 3.6. V trí các vùng promoter, 5’UTR vƠ exon 1trên trình t kh o sát

Ghi chúμ vùng promoter lƠ đo n mƠu xanh lá, mƠu h ng lƠ exon 1

Bên c nh đó, d a trên m t s các công trình nghiên c u trên th gi i trên nhi u đ i t ng nghiên c u khác nhau ch ng h n nh ung th vú công trình nghiên c u Hu X.C. [16], ung th th c qu n c a tác gi Hibi K.[15], ung th ph i c a tác gi Yang L. [74][72] đ u t p trung trong vi c thi t k m i khu ch vùng gen n m thu c đ o CpG đ

Lý Th Tuy t Ng c Trang 48

ti n hƠnh đánh giá tình tr ng methyl hóa c a v trí CG trong vùng nƠy. Do đó, trong gi i h n c a đ tƠi khóa lu n t t nghi p, vùng CpG4 đ c l a ch n đ kh o sát vƠ k th a trình t m i methyl vƠ không methyl t các nghiên c u tr c đơy.

NgoƠi ra, b ng ch ng trình TFSEARCH xác đ nh các v trí nhơn t phiên mƣ ch ng h n nh Sp1, CREB, GATA2, AML - 1aầ đ c nh n di n đ c s d ng ch đ ng ng (threshold) l n h n 85.

Hình 3.7. Trình t gen p16INK4 vƠ s phơn b các v trí phiên mƣ trên trình t

Ghi chú: vùng mƠu tímμ 5’UTR, vùng mƠu đ Exon 1, các vùng mƠu xanhμ v trí các CpG, trình t g ch d i lƠ m i.

Nh n xét:

Trên trình t kh o sát, k t qu cho th y có 4 vùng đ o CpG trên vùng promoter thu c gen p16INIK, xác đ nh đ c trình t nh n bi t c a m t s nhơn t phiên mƣ c th lƠμ ADR1, Sp1, GATA - 2, GATA - 2, AML,... (Hình 3.7). Các v trí CpG trong trình t m i vƠ bên trong s n ph m MSP t o ra gi a hai m i ho c các motif nucleotide k c n các v trí CpG đ u lƠ các ví trí ắnóng” (hot spot)μ chúng chính lƠ các trình t ho c m i ho c m t ph n các trình t nh n bi t các nhơn t đi u hòa phiên mƣ quan tr ng. Nh ng v trí nóng nƠy d dƠng b đ t bi n hay methyl hóa d n đ n gen không đ c phiên mƣ, không có kh n ng bi u hi n ch c n ng gen c ch kh i u.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 49

Vùng exon 1 mƣ hóa trình t đ o CpG trên vùng promoter thu c gen p16INK4, các t bƠo bình th ng không b methyl hóa, khi quá trình methyl hóa vùng 5’ t i đ o CpG đ c phát hi n m t s b nh ung th ng i [5]

. Methyl hóa các đ o CpG trên vùng promoter thu c gen p16INK4 gơy im l ng bi u hi n gen p16INK4 (tumor suppressor gene - gen c ch kh i u) t ng quan ch c ch đ n m t s b nh ung th bao g m ung th đ i tr c trƠng, ph i, vú, c t cung...

o CpG4 n m m t ph n trong vùng 5’ không d ch mƣ vƠ m t ph n trong vùng exon 1 c a gen p16INK4, tham kh o t công trình nghiên c u c a Vinci A. D. vƠ c ng s , 2002 [69].

M i xuôi (MF) vƠ m i ng c (MR) đ c đ c xác đ nh t i đ o CpG4 b i ph n m m anhyb n m trong kho ng t nu 1λ20 đ n nu 1λ43 m i xuôi vƠ m i ng c lƠ t nu 204λ đ n 206λ, khuy ch đ i vùng gen có kích th c 257 pb, ngoƠi ra vùng đ o CpG4 đ c bi u di n nhi u đi m CG nh t trong 4 vùng (d a vƠoHình 3.6). Do đó, vùng đ o CpG4 đ c ch n vùng khuy ch đ i vùng promoter thu c gen p16INK4 nh m phát hi n, tiên l ng ch n đoán m t s b nh ung th . Sau khi nh n đ nh k t qu , ti n hƠnh mô t v trí nhơn t phiên mƣ vƠ m i trên đ o CpG thu c gen p16INK4đ c trình bƠy Hình 3.7.

3.2.3. ánhgiá m i

3.2.3.1.Kh o sáttính ch t v t lý c a m i b ng ch ngtrình IDT

M i có kh n ng b t c p b sung v i m ch khuôn DNA vƠ có mang đ u 3’ OH t do giúp cho DNA polymerase b t đ u t ng h p m ch m i. M i đ c thi t k d a vƠo 2 vùng trình t đƣ đ c bi t, n m hai đ u c a đo n gen c n khu ch đ i. NgoƠi ra, cung c n ph i đ m b o c p m i ch d c hi u v i trình t DNA ngu n mƠ không d c hi u v i các trình t DNA khác có b t c p sai.

ThƠnh ph n nucleotide A, T, G, C trong trình t c a m i, thông s quan tr ng tác đ ng tr c ti p đ n nhi t đ nóng ch y (Tm) vƠ nhi t đ b t c p (Ta) c a m i v i DNA đích. M i methyl vƠ unmethyl khác bi t so v i PCR thông th ng do m i methyl đ c thi t k cho ph n ng MSP ch a nhi u cystosine t do, sau quá trình

Lý Th Tuy t Ng c Trang 50

bi n đ i BSP chuy n các cystosine thƠnh thymine. M i methyl bi n đ i nh g n nhóm methyl chuy n cystosine thƠnh thymine (uracil chuy n thymine), ngo i tr cytosine b methyl hóa lƠ không bi n đ i. i v i m i không methyl thì toƠn b cytosine b bi n đ i thƠnh thymine.

3.2.3.2. Ti n hành ki m tra đ đ c hi u c a các c p m i Ki m tra b ng ch ngtrình IDT

D a vƠo phơn tích IDT

(https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/), đánh giá các thông s v t lỦ quan tr ng c a các c p m i thu th p nh chi u dƠi (L - lenght), thƠnh ph n GC (%GC), Tm (nhi t đ nóng ch y), kh n ng hình thƠnh c u trúc k p tóc (hairpin dimer), m i t bát c p (hetero dimer) nh sauμ

Thông s % GC c a các m i không th t s t i uμ ví d m i methyl MR có 66.7% GC.

Chi u dƠi m i (L - lenght) lƠ m t y u t quan tr ng trong ph n ng PCR, thông th ng dao đ ng t 18 bp - 25 bp. Chi u dƠi m i đ t yêu c u (kho ng 21bp - 24bp).

Nhi t đ nóng ch y (T melt)μ lƠ nhi t đ c a m i khi ch a b t c p v i DNA