khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh LỜI CAM ĐOAN Kết thúc khóa học 2008-2011 chuyên nghành Công Nghệ Sinh Học của Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Trong quá trình học tập, em đã hoàn thành tốt khóa học của mình, nay được vinh dự làm bài khóa luận tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình và ra trường. Em rất tự hào khi mình là người được thực hiện bài khóa luận này, do đó em thấy mình phải có trách nhiệm thực hiện tốt bài khóa luận này, không sao chép nội dung bài khóa luận của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Những số liệu trong bài của em là trung thực chứ không phải sao chép của bất kỳ ai khác. Vì những lý do trên, em thấy mình phải có trách nhiệm thực hiện đúng với những gì đã cam đoan như trên, thực hiện đúng và không có bất cứ sai phạm gì. TP HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Nhật Minh Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh LỜI CẢM ƠN Tôi Xin Chân Thành Cảm Ơn :  BGH Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM và các thầy cô ở Bộ môn Công Nghệ Sinh học đã tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 3 năm qua, và các thầy cô đã cố gắng tạo mọi điều kiện để chúng em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.  Các anh chị trong phòng Thí Nghiệm Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã cung cấp cho tôi những số liệu mà tôi cần, khi tôi làm về qui trình thực nghiệm.  Tất cả các bạn trong lớp 08csh thân yêu đã an ủi động viên tôi hoàn thành tốt bài khóa luận này.  Và con xin cám ơn cha, mẹ, chị hai, những người thân đã luôn động viên con, giúp con có nghị lực để con có thể hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này. TP HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Nhật Minh Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh i MỤC LỤC Danh sách các từ viết tắt v Danh sách các bảng vi Danh sách các hình vii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào 3 2.2. Giới thiệu về Trichoderma Reesei 4 2.2.1. Lịch sử nguyên cứu Trichoderma 4 2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma Reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì 5 2.2.3. Hình thái của Trichoderma Reesei 5 2.2.4. Đặc điểm 6 2.2.5. Ứng dụng 8 2.2.5.1. Lương thực và nghành dệt 8 2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học 8 2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 8 2.2.5.4. Nguồn gen sử dụng trong chuyển gel 8 2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ 9 2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme 10 2.4. Giới thiệu sơ lược về protease 12 2.4.1. Ứng dụng của protease 13 2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma Reesei 15 2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 16 2.5.2. Tính chất hóa lý của enzyme cellulase 18 2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase 19 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh ii 2.5.4. Các nguồn thu nhận enzyme 19 2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô 19 2.7. Cố định enzyme 20 2.7.1. Định nghĩa cố định enzyme 20 2.7.2. Ưu nhược điểm của cố định enzyme 20 2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định 21 2.7.4. Phương pháp cố định enzyme 21 2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định 22 2.7.5.1. Trong công nghiệp 22 2.7.5.2. Trong y học 22 2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học 23 2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường 23 2.7.6. Tình hình nguyên cứu trong và ngoài nước 24 2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước 24 2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước 24 CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 26 3.1. Thiết bị và hóa chất 26 3.1.1. Thiết bị 26 3.1.2. Hóa chất 28 3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô 28 3.2.1. Thuyết minh quy trình 29 3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 31 3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Baradford 31 3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulase 33 3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối thích đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35 3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 36 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh iii 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 37 3.4.4. Xác định độ pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 37 3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp enzymecellulase 38 3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 38 3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hoặc polymer 38 3.5.2. Tủa enzyme bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 ở các nồng độ khác nhau 39 3.5.3. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ 39 3.5.4. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính 39 3.5.5. Tủa protein-enzyme bằng điểm đẳng điện 40 3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel 40 3.7. Tinh sạch enzyme 41 3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 41 3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị 41 3.7.1.2. Hóa chất 41 3.7.1.3 Tinh sạch enzyme 41 3.8. Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide 43 3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide 43 3.8.2. Vật liệu 44 3.8.2.1. Dụng cụ và thiết bị 44 3.8.2.2. Hóa chất 45 3.8.3. Phương pháp 46 3.8.3.1. Đổ gel 46 3.8.3.2. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 48 3.8.3.3. Xác định trọng lượng phân tử của protein 48 3.9. Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase trên Natrialginate 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1. Kết Luận 51 4.2. Đề Nghị 51 Tài Liệu Tham Khảo 52 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh iv Phụ lục 54 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT NTG: Nitrosoguanidine. BM: Bã mía. CM: Cám mì. CMCase: Carboxymethyl cellulase. FBU: Filter Paper Unit. CBB: Coomassie Brilliant Blue. DNS: Acid-2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic. CMC: Sodium carboxymethyl cellulose. TEMED: Tetramethylethylenediamine. SDS Sodium Dodelcyl Sulfate. PAGE: Polyacrylamide GelElectrophoresis. DTT: Dithiotheitol. PEG: polyethylene glycol. HL: Hàm lượng. HS: Hiệu suất. DVHT E: Đơn vị hoạt tính enzyme. APS: Ammoniumpersulfate. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào 3 Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất 25 Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn 31 Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase 34 Bảng 3.3 Thành phần môi trường thí nghiệm theo phần trăm 36 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng 49 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm Trichoderma reesei. 5 Hình 2.2 Hình thái nấm Trichoderma Reesei 6 Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei 7 Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma 10 Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-) 12 Hình 2.6 Cấu trúc không gian của protease 13 Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 16 Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 17 Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulae 17 Hình 3.1 Máy đo pH 27 Hình 3.2 Cân phân tích 27 Hình 3.3 Máy đo quang UV 27 Hình 3.4 Máy ly tâm 27 Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 28 Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm 30 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng 50 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải này. Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm. Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả nhất mà giá thành lại rẻ. [...]... Nhật Minh Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đã thực hiện khóa luận này: Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát  Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei  Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate 1.2.2 Mục tiêu cụ thể  Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma. .. Ứng dụng của enzyme cố định 2.7.5.1 Trong công nghiệp Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất… Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa - Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục... công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể điều khiển dễ dàng các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu xuất cao trong sản xuất 11 Khóa luận tốt nghiệp  SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-) 2.4 Giới thiệu sơ lược về protease Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase):... Trichoderma có ít nhất là 33 loài Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei 7 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.2.5 Ứng dụng 2.2.5.1 Lương thực và ngành dệt Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả cao Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường... dưỡng, độ ẩm ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma reesei VTT-D80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn 5 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.2.3 Hình thái của nấm Trichoderma reesei Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh... và sản xuất một số thức ăn kiêng - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh… - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm 2.5 Sơ lược về enzyme. .. cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei  Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton  Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase  Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate  Tinh sạch enzyme cellulase 2 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào Mặc dù... hoạt động của enzyme cellulase Cơ Chế Hoạt Động Của Enzyme Cellulase Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase 17 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.5.2 Tính chất lý hóa của enzyme cellulase Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định  Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác... hưởng đến cấu trúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở... cellulase ngoại bào Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với số lượng lớn Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào Hoạt tính STT Tên chủng celulase (unit/ml) Tên phân loại Thuộc . quát  Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei.  Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể  Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei. . Nhật Minh 2 Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đã thực hiện khóa luận này: Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei . 1.2 dòng nấm Trichoderma reesei. 5 Hình 2.2 Hình thái nấm Trichoderma Reesei 6 Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei 7 Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma