Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase, β-glucosidase. Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose.
Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose.
17
Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase
Cơ Chế Hoạt Động Của Enzyme Cellulase
18
2.5.2. Tính chất lý hóa của enzyme cellulase
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C.
Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,0- 5,0.
Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme.
Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%.
19
2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase
Enzym cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất cồn, trong xử lý môi trường. Enzym cellulase được ứng dụng rất ít trong thực phẩm (khoảng 1%) nhưng hầu như quá trình chế biến nào liên quan đến nguồn nguyên liệu là thực vật nếu có enzym cellulase đều cho hiệu suất cao hơn. Hơn nữa cellulase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt, bột giặt, ngành công nghiệp giấy, cellulase còn được sử dụng cho các ứng dụng dược phẩm.
2.5.4. Các nguồn thu nhận enzyme
Hiện nay trên thế giới có 3 nguồn để thu nhận enzyme là từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn. Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như thu enzym từ nguồn thực vật và động vật.
Có 2 phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme là nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên ngày nay phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi do khả năng cơ giới hóa và tự động hóa.
2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô
Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch. Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng phương pháp siêu âm. Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật. Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozine (enzyme phá vách tế bào). Đối với những tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy ép
20
tạo áp suất cao để phá vở tế bào. Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu.
Sau khi nhận được sinh khối tế bào bị nghiền, công việc tiếp theo là phải tách vách và các mảnh vỡ tế bào ra khỏi dịch chứa protein được giải phóng trong quá trình nghiền. Thường người ta sử dụng phương pháp: ly tâm, lọc, tách dịch 2 lớp, tách nucleic acid và lipid. Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp.
2.7. Cố định enzyme
2.7.1. Định nghĩa về enzyme cố định
Enzyme cố định là enzyme được giới hạn hay khác biệt về mặt vật lý ở một vùng không gian nhất định, nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể tái sử dụng nhiều lần sau một quá trình xúc tác.
2.7.2. Ưu nhược điểm của quá trình cố định enzyme
Ưu điểm:
Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần 1 lượng enzyme xác định trong 1 thời gian dài, do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền, thuận lợi trong các quá trình tự động hóa và liên tục.
- Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ do đó dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm. Tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm. Điều này đặc biệt là có ý nghĩa khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất thực phẩm, trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích.
- Có thể dừng quá trình phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất.
- Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như với các tác nhân gây biến tính so với enzyme hòa tan.
21
- Hoạt tính ổn định so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như: pH, nhiệt độ…. Nhờ vào các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liên kết ion và các liên kết khác.
Nhược điểm:
Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do.
- Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hóa trị là do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme.
2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định
Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hoà tan là:
Bản chất và tính chất hóa học của chất mang.
Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương điện tích, tính háo nước và kị nước,… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hóa học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.
Dẫn xuất enzyme không hòa tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydro và liên kết kỵ nước.
Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác. Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác.
22
2.7.4. Phương pháp cố định enzyme
Cố định enzyme thông qua liên kết hóa trị
Tạo liên kết hóa trị với vật liệu mang được hoạt hóa thông qua các gốc tự do – NH2, OH và SH ở mạch bên của các amino acid. Theo nguyên tắc, liên kết hình thành trong quá trình tương tác giữa nhóm ưa nhân (nucleophilic) của enzyme với các nhóm chất được hoạt hóa trước đó trên bề mặt chất mang.
Cố định enzyme bằng cách nhốt trong gel
Tiến hành nhốt enzyme vào nền chất tạo gel tự nhiên, hay tổng hợp, có bản chất là polymer, là khá đơn giản. Các polymer như Na-alginate, carrageenan, carboxymethyl-cellulose (CMC) hoặc polymer cationic như chitosan, thường được sử dụng để tạo liên kết với các ion trái dấu như Ca+2 hoặc polyphosphate. Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế. Ion Ca+2 đóng vai trò làm chất kết nối gel thường dễ bị hòa tan khi bổ sung thêm muối. Gel dạng hình cầu lại mềm và xốp, độ bền cơ học thấp, khó có thể nhồi vào cột phản ứng, nên ít được sử dụng. Tuy nhiên hướng công nghệ này vẫn được tiếp tục nghiên cứu, theo hướng làm cứng nền gel bằng cách tạo phức gel với hạt epoxide.
2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định
2.7.5.1. Trong công nghiệp
Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất… Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn.
Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa.
- Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định. - Năm 1971 đã dùng Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulose làm đông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền.
23
Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ.
Enzyme được cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh. Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng: glucose, urea, cholesterol…Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể , giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kĩ thuật ELISA).
Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn.
2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học
Năm 1967, điện cực enzyme đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide. Nhúng điện cực vào dung dịch glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose.
Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol.
Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn.
Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao.
24
2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ. Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài.
2.7.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước
Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế.
Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde.
Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ.
Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước.
Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis…
2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước
Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực tiễn (chủ yếu là ở Nhật).
25
Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất Enzyme cố định Sản lượng
(tấn/năm)
Phương pháp cố định
Hãng sản xuất
Aminoacid acylase 1000 t DEAE sepharose Reactor màng Eupergit
Tanabe Degussa Rohm Aminoglucosidase 5000 t sirô glucose Than hoạt tính Tate % Lyle Aspartate 1000 t Nhốt tế bào trong
carrageeman
Tanabe
Furmarase Malic acid Nhốt tế bào trong carrageeman
Tanabe
Glucose Isomerase 6-7 triệu tấn
Lactase < 1000 t sirô lactose Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon
Corning Sumomoto
Lipatse Chuyển ester, thủy phân
Trao đổi ion celite Novo Unillever
Nitrilase 6000 t acrylamide Nhốt tế bào trong polyacrylamide
Nitto
RNAase >500 t RNA Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit
VR China, Japan Rohm Penicillin G amidase 4500 t 6-amino- penicillanic Eupergit Rohm Beecham Penicillin V amidase 500 t Polyacrylamide, sợi nylon Toyo Jozo Boehringer Novo
26
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1. Thiết bị Bể ổn nhiệt Cân phân tích Máy ly tâm Máy quang phổ UV Máy lắc nuôi cấy Nồi khử trùng Máy đo pH Tủ sấy Ống nghiệm Bình tam giác Phễu lọc, giấy lọc Đũa khuấy
Pipet man các loại
Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml Gía đựng ống nghiệm Ống đong 100ml, 250ml Xi lanh Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ Các dụng cụ chạy điện di Tủ lạnh
27
Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích
28 Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 3.1.2. Hóa chất Triton X-100 Tween-20 Tweeen-80
Sodium carboxymethyl cellulose Coomassie Brilliant Blue
Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone
Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd CaCl2 0,02M
29
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp)
↓ (Trộn tỷ lệ nước) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓