Các polymer trung tính tạo tương tác giữa các protein với nhau, nhờ ưu thế loại bỏ bọc nước, dẫn đến tạo tủa protein và tách phase. Khác với dung môi hữu cơ, các polymer trung tính như polyethylene glycol (PEG), không gây biến tính protein, nên có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng.
Ngoài 3 phương pháp tạo tủa phân đoạn protein kể trên, một số phương pháp tạo tủa khác cũng được sử dụng. Đó là tạo tủa phân đoạn protein bằng cách gây biến tính bởi nhiệt độ, độ pH, dung môi hữu cơ, tạo tủa loại protein gây nhiễm. Để tăng tủa đặc hiệu, người ta bổ sung các tay nối (ligand) đặc hiệu vào các polymer tạo “tủa ái lực protein” cho phép làm sạch đáng kể protein-enzyme dịch.
40
3.5.5. Tủa enzyme bằng điểm đẳngđiện
Dựa trên tính chất protein có độ hoà tan thấp ở điểm đẳng điện. Ở điểm đẳng điện độ hydrate-hoá của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn. Phương pháp này cho hiệu quả không cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ.
3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel
Tạo dung dịch Natrialginate 3%: Cân 0.75g Natrialginate hòa tan trong 25 ml dung dịch đệm acetate pH 5. Khuấy đến khi tất cả Natrialginate hòa tan hoàn toàn là được.
Tiến hành cố định: Cân 0.5g ezyme cellulase hòa tan trong dung dịch Natrialginate 3%. Dùng ống xilanh có đầu kim tiêm, hút dung dịch enzyme hòa tan này nhỏ từ độ cao 20cm vào trong 100ml dung dịch 0.2m CaCl2 để tạo gel. Qúa trình tạo gel xảy ra trong 2 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau cố định, dùng giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định. Kết quả thu được hạt gel enzyme cellulase đã được nhốt trong khuôn gel. Dịch lọc thu được đem đi xác định hàm lượng theo phương pháp Bradford và xác định hoạt tíh theo phương pháp của công ty Shin Nihon Chemical Co, Ltd.
Cách tính:
HL Protein cố định (mg) = HL Protein trước cố định – HL Protein còn lại
Hiệu suất gắn Protein được tính theo công thức sau: HS cố định Protein = HL Protein cố định/HL Protein trước cố định x 100
Hiệu suất hoạt tính enzyme cellulase cố định so với hoạt tính enzyme cellulase ban đầu:
∑ ĐVHT E cellulase cố định
HS hoạt tính enzyme cố định (%) = X 100
41 Trong đó:
∑ ĐVHT E cellulase cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase cố định (UI/g).
∑ ĐVHT E cellulase trước cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase trước cố định (UI/g).
Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase cố định trên Natrialginate
Sau khi hạt gel đã được cố định ta bọc bằng giấy lọc, thu dịch nước tiến hành khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 1 và rửa lại bằng CaCl2, tiếp tục khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 2 cứ như thế ta khảo sát được lần 3, lần 4,…. Vẽ đồ thị số lần tái sử dụng giảm 50% so với enzyme ban đầu.
3.7. Tinh sạch enzyme
3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ
3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị
Phễu đổ gel
Bình hút chân không
Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm, thể tích 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3,14 .
Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm: 20 cái
Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch.
3.7.1.2. Hóa chất
Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm, khả năng ngậm nước: 12ml/1 g gel khô, phạm vi phân tách: 5.000-100.000 Daltons. Đệm Acetate 50 Nm, pH 5.0: khử bọt khí trước khi dùng
3.7.1.3. Tinh sạch enzyme
Dịch enzyme sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có
42
kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7.5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích
mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endo- β -1,4-glucanase cao được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là 3320 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể được tóm tắt như sơ đồ:
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Dịch enzyme thô Ly tâm 10000 vòng/10 phút Dịch trong Cột Sephadex G100 Cột DEAE Enzyme tinh sạch
43
3.8. Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide
3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide
Gel polycrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N, N’-methylene-bis-acrylamide. Qúa trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS), N, N ,N’ ,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của ỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis- acrylamide: nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptooethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
44
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein có xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000-200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2.5%.
Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo lien kết (cross-linkes) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focusing gel electrophoresis).
3.8.2. Vật liệu
3.8.2.1. Dụng cụ và thiết bị
- Bộ điện di chứng
- Bộ nguồn chạy điện di (electrophoresis power supply) Biorad - Pipetteman 1000 µl. - Pipetteman 200 µl. - Pipetteman 10µl. - Típ xanh: 1 hộp. - Típ vàng: 1 hộp. - Típ trắng: 1 hộp. - Giấy lọc.
45 - Giấy thấm.
- Găng tay: 1 đôi. - Phao. - Eppendorf. - pH kế 3.8.2.2. Hóa chất - N, N, N’, N’-tetramethylenediamide [C6H16N2-TEMED] - Dung dịch Acryamide/Bisacryamide 40% (29:1) (3,3 % C) - β-Mercaptoethanol [HSCH2CH2OH]
- Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad), gồm các protein chuẩn có kích thước xác định sau:
Phosphorylase b 97.400 Daltons Bovine serum albumin 66.200 Daltons
Ovalbumin 45.000 Daltons
Carbonic anhydrase 31.000 Daltons Soybean trypsin inhibitor 21.500 Daltons
Lysozyme 14.400 Daltons
- Sodium Dodecyl Sulfate [SDS]
- Ammonium persulfate [(NH4)2S2O8][APS]
- Coomassie Brillilant Blue G 250 dạng viên (Bio-Rad) - Cồn tuyệt đối [99,5 độ]
- Methanol [CH3OH]
- Tris (hydroxymethyl) aminomethane - Axit acetic
- Bromophenol blue - Glycerol [C3H8O3] - Glycine [C2H5O2N]
46 - Axít Clohydric [HCl]
- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%: cân 10g SDS cho 100ml nước cất vào khuấy cho tới khi tan hết.
- Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1.5 M, pH 8.8-0,4% SDS: cân 36,3 g Tris pha thêm 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8.8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40 C.
- Dung dịch gel gom (stacking gel buffer) Tris-Cl 0,5M, pH 6.8-0,4% SDS: cân 6.05g Tris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chi 6.8. Hút 4ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100ml, lắc đều giữ ở 40 C.
- Ammoniumperslfate 10% (chỉ pha trước khi dùng): cân 0.1g cho vào một eppendorf 1000µl thêm 1ml nước cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3: pha dung dịch me 10X chứa 30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000ml nước cất.
- Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần như sau: 2.5ml dung dịch đệm Tris-Cl 0.5M, pH 6.8, 4ml 10% SDS, 2ml Glycerol, 2mg Bromophenol Blue, 0.2 ml mercaptoethanol, thêm nước đủ 10ml.
- Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa 0.625g Coomassie Blue G 250, 112.5ml ethanol tuyệt đối, 112.5ml nước cất và 25ml axit acetic, lắc đều, giữ trong chai màu tối.
- Dung dịch giải nhuộm: 30ml methanol: 10ml acid acetic: 60ml nước cất.
3.8.3. Phương pháp
3.8.3.1. Đổ gel
Chuẩn bị đổ một gel có kích thước 100 x 100 x 0.75mm có nồng độ acrylamide là 10%.
47
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50ml sạch: 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2.5ml Tris-HCl 1.5M pH 8.8-0.4% SDS 2.5ml Nước cất 4.445ml TEMED 5µl Ammonium persulfate 10% 50µl Tổng thể tích 10ml
Sau khi cho Ammonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20-30 phút).
Gel gom (Stacking gel)
Cho các thành phần sau vào một Becher 50ml khác:
40% Acrylamide/0.85 bisacrylamide 0.5ml Tris-HCl 0.5M pH 6.8-0.4% SDS 1ml Nước cất 2.476ml TEMED 4µl Ammonium persulfate 10% 20µl Tổng thể tích 4ml
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sauk hi gel trùng ngưng tháo lược lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung dịch điện di vào buồn điện di.
48
3.8.3.2. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di
Xử lý mẫu
Hút 30µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30µl dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5-10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1-5 giây.
Đối với những thang chuẩn protein (Biorad0 hút 2µl vào eppendorf 1ml chứa 8 µl nước cất và 10µl dung dịch nạp mẫu.
Tiến hành chạy điện di
Dùng pipetteman 10µl nạp mẫu vào các giếng (20µl/giếng). Tiến hành chạy điện di ổn định dòng: 100V
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước (2-4 giờ) 1 giờ. Sau đó, tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đén khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sauk hi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
3.8.3.3. Xác định trọng lượng phân tử của protein
- Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách đến các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. - Tính giá trị Rf:
Khoảng cách di chuyển của protein Rf =
Khoảng cách di chuyển của vạch màu Brommophenol Blue
- Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng.
- Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông số giá trị Rf của chúng thông qua phương pháp ngoại suy tử đồ thị.
49
3.9. Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase trên Natrialginate
Cân 1 g enzyme cố định đem xác định số lần tái sử dụng của enzyme cellulase trên Natrialginate theo phương pháp mục 3.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp mục 3.2.2.
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt ính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng Số lần lặp lại Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ
lại (%) 1 136.15 100 2 104.97 77.09 3 73.76 54.18 4 51.08 37.52 5 39.75 29.20 6 31.25 22.96 7 14.21 10.44
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hoạt tính của enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng
50 Nhận xét:
Việc tái sử dụng enzyme là đặc tính quan trọng của enzyme cố định. Tuy nhiên qua các lần tái sử dụng hoạt tính của enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu của enzyme cố định. Sự giảm hoạt tính của enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố.Theo đồ thị thì hoạt tính cellulase cố định trên Natrialginate giảm đi rất nhiều so với ban đầu. Ở lần tái sử dụng thứ 4 hoạt tính cellulase chỉ còn 37.52%. Hiệu suất tái sử dụng của cellulase cố định trên Natrialginate không cao có thể là do cơ chất Natrialginate kém bền với nhiệt độ và các điều kiện phản ứng. Sau mỗi lần tái sử dụng, enzyme bị thất thoát nhiều, do đó hoạt tính cellulase cố định giảm rất nhanh.
Tuy nhiên sau 4 lần tái sử dụng hoạt tính cellulase cố định giảm đi ít hơn so với những lần đầu tiên. Có thể là do đường kính hạt gel Natrialginate khá lớn nên với những điều kiện phản ứng chỉ tác động đến một phần hạt gel làm cho những lần tái sử dụng sau lượng enzyme trong hạt gel ít thất thoát hơn nên hoạt tính cellulase cố định những lần sau giảm ít hơn và ổn định hơn. Tuy vậy hoạt tính của những lần tái sử dụng sau vẫn thấp (hoạt tính còn giữ lại 10.44% sau 7 lần tái sử dụng).
51
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ những nghiên cứu về quy trình tách chiết enzyme cellulase từ Trichoderma reesei xác định được các yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm cơ chất ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cũng như tách chiết enzyme cellulase.
Xác định đươc tác nhân của enzyme hiệu quả nhất cho quy trình phân hủy cơ chất và củng như giúp cho quy trình thu hồi enzyme tốt nhất.