Cân 1 g enzyme cố định đem xác định số lần tái sử dụng của enzyme cellulase trên Natrialginate theo phương pháp mục 3.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp mục 3.2.2.
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt ính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng Số lần lặp lại Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ
lại (%) 1 136.15 100 2 104.97 77.09 3 73.76 54.18 4 51.08 37.52 5 39.75 29.20 6 31.25 22.96 7 14.21 10.44
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hoạt tính của enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng
50 Nhận xét:
Việc tái sử dụng enzyme là đặc tính quan trọng của enzyme cố định. Tuy nhiên qua các lần tái sử dụng hoạt tính của enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu của enzyme cố định. Sự giảm hoạt tính của enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố.Theo đồ thị thì hoạt tính cellulase cố định trên Natrialginate giảm đi rất nhiều so với ban đầu. Ở lần tái sử dụng thứ 4 hoạt tính cellulase chỉ còn 37.52%. Hiệu suất tái sử dụng của cellulase cố định trên Natrialginate không cao có thể là do cơ chất Natrialginate kém bền với nhiệt độ và các điều kiện phản ứng. Sau mỗi lần tái sử dụng, enzyme bị thất thoát nhiều, do đó hoạt tính cellulase cố định giảm rất nhanh.
Tuy nhiên sau 4 lần tái sử dụng hoạt tính cellulase cố định giảm đi ít hơn so với những lần đầu tiên. Có thể là do đường kính hạt gel Natrialginate khá lớn nên với những điều kiện phản ứng chỉ tác động đến một phần hạt gel làm cho những lần tái sử dụng sau lượng enzyme trong hạt gel ít thất thoát hơn nên hoạt tính cellulase cố định những lần sau giảm ít hơn và ổn định hơn. Tuy vậy hoạt tính của những lần tái sử dụng sau vẫn thấp (hoạt tính còn giữ lại 10.44% sau 7 lần tái sử dụng).
51
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ những nghiên cứu về quy trình tách chiết enzyme cellulase từ Trichoderma reesei xác định được các yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm cơ chất ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cũng như tách chiết enzyme cellulase.
Xác định đươc tác nhân của enzyme hiệu quả nhất cho quy trình phân hủy cơ chất và củng như giúp cho quy trình thu hồi enzyme tốt nhất.
Xây dựng quy trình tách chiết enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ký lọc gel đồng thời xác định trọng lượng của phân tử enzyme tạo thành.
4.2. Đề nghị
Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các dòng nấm Trichoderma Reesei bị đột biến xem dòng nào mang lại hiệu quả sản xuất enzyme cellulase là cao nhất, mà giá thành sản xuất lại ít tốn kém .
Ngoài chủng nấm Trichoderma Reesei ra, thì chúng ta nên tiến hành khảo sát thêm khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc khác như : Bacillus subtilis, Apergilus, vi khuẩn, xạ khuẩn…xem khả năng tổng hợp enzyme cellulase của chủng nào là mạnh nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất .
Tận dụng và xử lý có hiệu quả nguồn phế thải hữu cơ từ các nhà máy : mạt cưa, bã mía, cám mì, bã đậu nành... Nó không chỉ góp phần vào bảo vệ môi trường mà còn tạo ra một lượng lớn enzyme cellulase ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất bột giặc, trong dược phẩm…
Bên cạnh ứng dụng của các chủng nấm để sản xuất enzyme cellulase thì ta cũng nên nghiên cứu thêm nhũng ứng dụng khác của chủng nấm để phục vụ cho khoa học, cũng như trong đời sống hàng ngày.
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
[1] Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,113 - 114, 2003.
[2] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 128 - 129, 2003.
[3] Lê Hồng Phú, Nghiên cứu sinh tổng hợp Enzyme Pectinase và Cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ ngành sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2003.
[4] Nguyễn Văn Tuân, tuyển chọn nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất của Endo-β-1,4-glucanase, luận văn Thạc sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Thái Nguyên .
[5] Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma Reesei trên môi trường bán rắn, Viện Sinh Học Nhiệt Đới-Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam.
53
Tài liệu tiếng anh
Okada G., The growth of Trichoderma viride on media containing cotton fibres, J. Biochem, trang 591 – 607, 1963.
Ruy D.D.Y. And Mandels M. – Cellulase, Biosynthesis and applications - Enzyme Microbiology Technology, 1980.
Gary J. Samuels, Trichoderma a guide to identification and biology. Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA, 2004. Science & Technology Development, Vol 12, No.13 – 2009.
54
PHỤ LỤC Phụ lục A.
Bảng 1.1: Đại diện vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase
Vi Sinh Vật Vi Khuẩn Nấm
Acremonium cellulolyticus Actinomycetes
Thermoactinomyces sp.
Chrysosporium
Aspergillus acculeatus Actinomycetes
Thermomonospora curvata
Schizophyllum xã
Aspergillus fumigates Sclerotium rolfsii
Aspergillus niger Sporotrichum
cellulophilum
Fusarium solani Talaromyces emersonii
Irpex lacteus Thielavia terrestris
Penicillium funmiculosum Trichoderma koningii
Phanerochaete Trichoderma reesei
Clostridium thermocellum Trichoderma viride
Ruminococcus albus Streptomyces sp.
Phụ lục B.
Môi trường nuôi cấy các chủng Vi Sinh Vật
Môi trường nuôi cấy: Môi trường (MT) nuôi cấy vi khuẩn: CMC 1%, peptone 0,05%, cao thịt 0,1%, NaCl 0,1%). MT nuôi cấy xạ khuẩn: CMC 1%, tinh bột 0,1%, cao nấm men 0,02%. MT nuôi cấy nấm sợi: CMC 1%, cao malt 0.02%. MT nuôi cấy nấm men: CMC 1%, glucose 0,1%, peptone 0,05%, cao nấm men 0,03%, cao malt 0,03%. MT nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh cellulase được sưu tập từ phòng thí nghiệm của trường Đại học khoa học Tự nhiên: CMC 1%, tinh bột 0,1%, MgSO4 0,02
55
%, NaHCO3 0.02%, K2HPO4 0,5%, CaCl2 0.02%, NaCl 0,02%, peptone 0,02%. Môi trường AN: KH2PO4 0,1g, NaNO3 0,3g, MgSO4 .H2O 0,05g, KCl 0,05g, FeSO4 7H2O 0,01g, Cao bắp 0,5g, giấy lọc 2g, nước cất 1l. MT Zapek, Cell.
Phụ lục C. Gel “Biogel-P-“Hãng Bio-Rad
C.1.Giới thiệu
Các loại gel “Bio-Gel P” là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, được điều chế bằng quá trình đồng hóa polymer hóa acrylamide và N, N’ –methylene-bis-acrylamide. Các gel này rất ưa nước và không mang điện tính, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Độ phân giải cao được xác định bằng 2 yếu tố (1) sự phân bố hẹp và consistent của đường kính hạt, (2) sự phân tách tốt theo trọng lượng phân tử.
Gel “Bio-Gel P” thích hợp với các acid hữu cơ yếu, urê 8M, guanidine 6M, các tác nhân chatropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, các tác nhân tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100, Bio-Gel P có thể được dùng với nước cất, tuy nhiên các dung dịch đệm có cường độ ion > 50Mm sẽ mang lại hiệu quả phân tách protein tốt nhất. Có thể cho dung môi hữu cơ miscible vào chất giải hấp được dùng với gel “Bio-Gel P”. Cồn (có thể đến 20%) không làm thay đổi đặc tính phân tách của gel, và trong một vài trường hợp nó còn làm tăng quá trình phân tách các hỗn hợp phức tạp của các phân tử hòa tan kém trong nước như các nucleotide, peptide, tamin. Có thể dùng dung môi formamide ở cường độ mạnh vì gel “Bio-Gel P” swell hoàn toàn bởi dung môi này.
Gel “Bio-Gel P” có thể khử trùng ở pH 5.5-6.0 trong các dung dịch đệm như HEPES 50Mm, MES, hoặc citrate ở 1200 C trong 15-30 phút. Ở nhiệt độ phòng, phạm vi pH nên điều chỉnh từ 2 đến 10. Gel “Bio-Gel P” nhạy cảm với sự thủy phân các nhóm amide ở pH cao hoặc thấp. Tốc độ dòng và độ phân giải gia tăng khi nhiệt độ trong phạm vi 4-800 C.
C.2. Các thông số kĩ thuật
56
Thông Số Đặc Tính
Chất nền (Matrix) Gel-Bio-Gel polyacrylamide Kích thước hạt Trung bình 90-180 µm
Mịn 45-90 µm
Rất mịn < 45 µm
Shipping medium Shipped dry
Phạm vi hoạt động tốt
pH 2-10
Áp suất 15 psi
Các dung môi hữu cơ < 200 C Phạm vi nhiệt độ vận hành 4-800 C Phạm vi nhiệt độ cho phép Khử trùng bằng autoclave, pH 5.5-6.5 ở nhiệt độ 1200 C trong 30 phút.
Bảo quản Khô, ở nhiệt độ phòng, trong
nước cất hoặc dung dịch đệm ở 40 C với sodium azide 0.02%.
57 Gel Phạm vi kích thước hạt, các hạt đã bị ngậm nước(µM) Thể tích nền đã hydrated điển hình, ml/g gel khô Tốc độ dòng điển hình (cm/hr) Phạm vi phân tách tiêu biểu/giới hạn phân tách thong thường (Daltons) Bio-Gel P-2 Gel, mịn Bio-Gel P-2, rất mịn 45-90 < 45 3 5.0-10 < 10 100-1.800 100-1.800 Bio-Gel P-4 Gel, trung bình Bio-Gel P-4 Gel, mịn Bio-Gel P-4 Gel, rất mịn 90-180 45-90 < 45 4 15-20 10-15 < 10 800-4.000 800-4.000 800-4.000 Bio-Gel p-6 Gel, trung bình Bio-Gel P-6 Gel, mịn Bio-Gel P-6 Gel, rất mịn 90-180 45-90 < 45 6.5 15-20 10-15 < 10 1.000-6.000 1.000-6.000 1.000-6.000 Bio-Gel P- 90-180 6.5 15-20 1.000-6.000
58 6DG Gel Bio-Gel P-10 Gel, trung bình 90-180 7.5 15-20 1.500-20.000 Bio-Gel P-10 Gel, rất mịn 45-90 10-15 1.500-20.000 Bio-Gel P-30 Gel, trung bình Bio-Gel P-30 Gel, mịn 90-180 45-90 9 15-20 10-15 2.500-40.000 2.500-40.000 Bio-Gel P-60 Gel, trung bình Bio-Gel P-60 Gel, mịn 90-180 45-90 11 15-20 10-15 3.000-60.000 3.000-60.000 Bio-Gel P- 100 Gel, trung bình Bio-Gel P- 100 Gel, mịn 90-180 45-90 12 15-20 10-15 5.000-100.000 5.000-100.000 Lưu ý: Tốc độ dòng xác định ở cột 1.5 x 70 cm.
59
Đối với mục đích kiểm soát chất lượng, giới hạn phân tách được xác định bằng cách tính giá trị Kd, hoặc hệ số phân bố. Hệ số phân bố là giá trị thời gian lưu của phân tử trong các lỗ gel, được biểu diễn như sau:
(Ve – Vo)/ (Vt – Vo)
Trong đó: Ve là thể tích giải hấp (thể tích thôi = elution volumn). Vo là thể tích trống (void volumn).
Vt là thể tích tổng xác định bằng một phân tử nhỏ như vitamin B12
C.3. Hướng dẫn sử dụng Bio-Gel P
C.3.1. Chọn cột
Kích thước cột lý tưởng là những kích thước cho phép phân giải vạch ranh giới các chất phân tích mà không cần pha loãng mẫu nhiều. Điển hình, chiều dài cột so với tỷ lệ đường kính ở khoảng pH 5-10, và thể tích lớp nền (bed volumn) gấp 4-20 lần thể tích của mẫu. Hệ số pha loãng tối thiểu có thể thu được đối với một chất đã được tách (excluded substance) khoảng 1,25. Nhìn chung, đối với quá trình phân tách khó thì cần chiều dài lớp nền so với tỷ lệ đường kính là 25-100 hoặc lớn hơn, và thể tích lớp nền gấp 25-100 lần thể tích mẫu.
Chọn chất tách
Chất tách (chất giải hấp) là chất lỏng dùng để chiết một chất khỏi chất khác trong sắc ký.
Chất tách chọn cần tạo tính ổn định tối đa cho các chất tan không ổn định trong mẫu. Nồng độ ion ít nhất là 20mM để loại trừ ảnh hưởng của số lượng nhỏ các nhóm mang điện âm trên gel.
Việc sử dụng các dung dịch muối ở nồng độ cao có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong thể tích lớp nền gel và giới hạn phân tách (exclusion limits).
Bio-Gel P tương thích với các trạng thái hòa tan và làm biến tính (solubilizing and denaturing condition) được sử dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử như
60
guanidine-HCl 6M, các tác nhân chaotropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, và các thuốc tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100.
Có thể sử dụng các muối đệm dễ bay hơi như pyridine, acetic acid, ammonium formate hoặc ammonium bicarbonate nếu sản phẩm cuối cùng cần phải ở trạng thái không có muối đệm. Có thể loại các chất này ra khỏi phân đoạn dòng chảy (effluent fractions) dễ dàng bằng đông khô.
Nên loại các khí hòa tan như CO2 để ngăn chặn sự tạo bọt trong hệ thống. Thực hiện điều này bằng cách hút dung dịch đệm trong một lọ chân không bằng một vòi nước tạo chân không hoặc bằng máy tạo chân không.
Nên tránh sử dụng các chất tách có pH trên 10 hoặc nhỏ hơn 2 để ngăn sự thủy phân gel.
Tránh dùng các tác nhân 0xy hóa mạnh vì các chất này sẽ phản ứng với gel và làm gia tăng hàm lượng các nhóm tích điện trên chất lớp.
Chuẩn bị gel
Cho từ từ môi trường Bio-Gel P vào dung dịch đệm đã được đựng trong cốc mỏ (beaker). Có thể ước tính lượng gel Bio-Gel P cần cho vào cột có thể tích đã biết bằng cách sử dụng bảng 2, bảng này cho biết thể tích lớp neenfkhi được hydrat hóa. Lưu ý sự mất gel trong suốt quá trình tiến hành công việc. Dùng dung dịch đệm nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền cần cho trong cột.
Đối với các gel từ Bio-Gel P-2 đến Bio-Gel P-10 cần hydrat hóa trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng (1 giờ nếu dung dịch đệm đã được làm nóng đến 1000 C và rồi làm lạnh sau khi đã cho gel vào dung dịch đệm). Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 200 C để hydrat hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000 C . Sauk hi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá trình hydrat hóa.
Sau khi quá trình hydrat xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình lọc và gắn với nguồn chân không. Khử khí của dung dịch trong
61
khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư hại gel.
Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ bình. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoăc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại > 99% hạt mịn.
Cho một cái phễu trên đỉnh cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.
Rót đều chất pha trộn loãng (slurry) vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn (tung tóe) chất pha trộn loãng để đảm bảo việc nhồi cột đều và để tránh việc bẫy các bọt khí.
Khi 2-5 cm lớp nền đã hình thàh, cho cột chảy cho đến khi cột được nạp đầy (packed).
Khi cột đã được nạp đầy, đóng đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích trên lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy.
Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị.
Nếu không dùng flow adaptor thì lấy lớp gel thừa cho đến khi đạt chiều cao lớp nền mong muốn khi mà cột đã được nạp xong và gắn cột vào một reservoir. Cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ dòng chảy. Rút dung dịch đệm xuống bằng lớp nền gel và mẫu nằm trên lớp nền gel, sau đó cho thêm dung dịch đệm để lấy mẫu vào lớp nền. Thay lớp dung dịch đệm nổi